Name: the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00
Duration: 7 min 47 s
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Diese Forschung wurde durch Zuschuss 2017-04559 von der schwedischen Forschung Rat (VR) und der EU unterstütztes Projekt direkt am Meer, Anders Blomberg unterstützt. Insbesondere die Einrichtung der Kultivierung Anlage, im Laufe der Jahre wurde unterstützt durch Zuschüsse zu pro R. Jonsson aus folgenden Förderinstitutionen: SSF (schwedische Stiftung für strategische Forschung) durch das Programm Marine Science und Technologie und MISTRA durch das Programm Marine Farbe. Kent Berntsson war in den frühen Phasen der Einrichtung die Culturingfacility maßgeblich. Zusätzliche Mittel für den Aufbau die Kultivierung Anlage gekommen vom Zentrum für Marine Evolutionsbiologie (www.cemeb.science.gu.se), das ist unterstützt durch ein Stipendium für die schwedische Forschung Räte FORMAS und VR Linnaeus.

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Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Die Barnacle Kultur Tjärnö Marine Research Laboratory (Schweden) läuft seit über 20 Jahren und ist für Studien in vielen verschiedenen Forschungsbereichen verwendet worden. Über 30 wissenschaftliche Abhandlungen erschienen, die die Kultivierung System in den letzten Jahren, einschließlich Studien in Antifouling13,22, Hydrodynamik23, chemische Ökologie24genutzt haben, den Klimawandel16 , Evolutionsbiologie5und Molekularbiologie2.
Um die Auswahl bestimmter Individuen zu vermeiden, die eignen sich mehr für die Laborumgebung (Einzelpersonen, die möglicherweise nicht repräsentativ für die wilde Bevölkerung), empfiehlt es sich, jedes Jahr eine neue Brutbeständen aus dem Bereich zu sammeln. Darüber hinaus ist es auch ratsam, die Kultur jährlich zu verjüngen, da gibt es etwa 50-80 % der Sterblichkeit bei Erwachsenen in einem normalen Jahr. Jedoch ist das Ziel, Inzuchtlinien zu produzieren oder zum Studium der experimentellen Entwicklung einrichten, sollen nur Labor aufgezogen Familien verwendet werden.
Eine gute Zeit, B. Improvisus auf Tafeln am Tjärnö Marine Research Laboratory zu sammeln ist im Juni / August, weil zu diesem Zeitpunkt eine gute Versorgung mit Cyprid Larven im Meer ist. Überprüfen Sie die Platten wöchentlich zu sehen, wann die Barnacle Siedlung beginnt und andere manuell entfernen ließ sich Arten als B. Improvisus (z. B.Muscheln, Manteltieren, Bryozoen, Hydrozoen, Nemerteans/Röhrenwürmern und andere Barnacle Arten) von der Platten (z.B.mit einer Zahnbürste). Rund um Tjärnö gibt es drei Flachwasser-Barnacle Artenvielfalt (B. Improvisus, Semibalanus Balanoidesund Balanus Crenatus). B. Improvisus ist jedoch die dominierende fouler von glatten harten Oberflächen im Juli-August. S. Balanoides hat seine Abrechnungsperiode im frühen Frühling und bevorzugt vor allem natürliche Substrate (z.B. Steinen). B. Crenatus können zu niedrigen Zahlen auf den Tafeln im Sommer auftreten.
Es ist auch möglich, neue Generationen von Erwachsenen Barnacle zu starten, von kultivierten Cyprids, die wäre wichtig, wenn bestimmte Gruppen mit spezifischen Eigenschaften festgelegt wurden, oder im Studium der experimentellen Entwicklung. Der bequemste Weg, um neue Generationen von Erwachsenen zu starten ist, Cyprids auf thermoplastische Platten im Labor zu vereinbaren. Diese Platten mit neu besiedelten Cyprids könnte auch in experimentelle Behandlungen oder für die Exposition im Feld verwendet werden. In Notfällen kann man auch verwenden wo B. Improvisus üblich Erwachsene auf Felsbrocken aus einem nahe gelegenen Standort (z.B.Idefjord bei Tjärnö Marine Research Laboratory). Diese bereits etablierten Erwachsenen behandelt genauso wie die Erwachsenen auf die Platten, so in Schalen gelegt und über die Durchfluss-System eingespeist. Durchflusszellen können auch Platten mit Seepocken25herstellen verwendet werden. Dies sind durchströmten Kammern mit Plankton net an den Seiten, auf denen die Cyprids mit Platten als die einzige Siedlung Oberfläche für die Larven nicht begleichen zu tun.
Es gibt mehrere Schritte, die für eine langfristig funktionierende Barnacle Kultur einschließlich Lebensabschnitte Einrichten von entscheidender Bedeutung sind. Die Methoden zur Kultur B. Improvisus sind wahrscheinlich, zu einem großen Teil auch auf anderen Wirbellosen Meerestieren mit freischwimmenden, Planktotrophic Larven anwendbar. Kultivierung Verfahren für einige Arten bereits gut sind beschrieben (z.B.für Miesmuscheln und verschiedene Arten von Austern)26, während für andere Wirbellose sind nur wenige Beispiele für langfristige Kulturen über ihr ganzes Leben Zyklus. Einer der ersten erfolgreichen Versuche Kultur Entenmuscheln (B. Amphitrite) erfolgte durch Rittschof Et al. 15. langfristige finanzielle und personelle Ressourcen sollten vor der Prüfung der Einrichtung einer Barnacle Kultivierung Anlage vorhanden sein. Die Wartung dieser Art des Jahres-rund um Barnacle Kultur erfordert mindestens eine Person halbe Arbeitszeit. Möglicherweise gibt es ein Potential für die zukünftige Automatisierung der einige Schritte in der Produktion, vor allem die Kultivierung von Mikroalgen27. Um erfolgreich zu sein, gilt es darüber hinaus Zugriff auf große Mengen an qualitativ hochwertigen Meerwasser haben. Die Kultivierung von Mikroalgen, Artemia, und Seepocken beinhaltet besonderen Sicherheitsvorkehrungen. Tests von einigen Antifouling Substanzen oder giftige Chemikalien benötigen jedoch besondere Vorsichtsmaßnahmen.
Die Platten wurden mehrmals wöchentlich für Verunreinigungen überprüft. Das Meerwasser in die Kultur verwendet wurde aus 40 m Tiefe im Koster Fjord außerhalb des Tjärnö Marine Research Laboratory hochgepumpt und wurde durch zwei Sand-Filter vor dem Eintritt in die Labor-Wasser-System übergeben. Wenn keine Filterung des Wassers getan hätte, gäbe es viel mehr Verunreinigungen in der Kultur. Es ist wichtig, regelmäßig zu reinigen die Paneele in der Kultur von Detritus und andere Wirbellose (z.B.Ausläufer-Gebäude Hydrozoen und räuberische Nemerteans), die das System durch die Zufuhr von Meerwasser aus dem Feld eingeben. Z. B. wenn keine Larven, trotz produziert werden der Tatsache, dass die Kultur wohlgenährt und auch sonst wurde scheint in gutem Zustand, das Problem könnte sein, das Vorhandensein von Nemerteans, die scheinbar Paarung hemmen. Natürlich, viele der kontaminierenden Organismen in der Kultur der Tjärnö Marine Research Laboratory waren spezifisch für die Schwedische Westküste, und andere Arten von Organismen verunreinigt werden weit verbreitet und werden eine größere Herausforderung in anderen geografischen Gebieten. An der Westküste von Schweden ist es ungewöhnlich, dass Verunreinigungen durch andere Barnacle Arten auf den Tafeln finden. Gelegentlich, die Einrichtung von S. Balanoides gefunden wurde, aber dies ist eine sehr marginale Problem (allenfalls ein S. Balanoides Verunreinigung für 10.000 B. Improvisus Proben). Der Mangel an Verunreinigung Arten wurde wahrscheinlich abhängig von dem Regime, neue Kulturen zu etablieren, während des Sommers, wenn Larvaefrom B. Improvisus waren sehr dominant. Darüber hinaus gab es auch eine klare Bereicherung von B. Improvisus auf den Tafeln, da diese Spezies selektiv für glatte Oberflächen13ist.
Es ist wichtig, Tote Erwachsene Seepocken zu entfernen. Die leeren Schalen auf den Tafeln übrig sind, können sie einen Unterschlupf für Artemia Nauplien als auch für verschiedene Verunreinigungen werden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Tote Personen Einfluss auf das Wohlbefinden der benachbarten Einzelpersonen, wahrscheinlich mit der Freisetzung von toxischen Verbindungen während der Zersetzung. Eine weitere Konsequenz der erwachsenensterblichkeit ist, dass einige Individuen allein zu weit weg gelassen werden und werden von anderen Erwachsenen zur Paarung erlauben (obwohl Seepocken den längsten Penis in der Tierwelt im Verhältnis zur Größe haben)28. Diese Personen werden überleben, aber sind nicht produktiv für die Larven. Jedoch diese einsamen erwachsenen Individuen sanft ohne Schädigung der Bodenplatte entfernt werden und horizontal platziert werden, in der Nähe von anderen Paarung zu ermöglichen. Seepocken können auch gedeckt werden, indem Sie Platten mit einem Erwachsenen auf jeder aber nahe genug, so dass gegenseitige Befruchtung auftreten kann. Auf diese Weise können genetische Linien produzierten14sein.
Es ist wichtig, einen Feed von hoher Qualität zu produzieren und zu Kulturen fast jeden Tag ernähren. Noch ein paar Tage ohne Nahrung führt zu einer abnehmenden Freisetzung von Larven. Vorangegangenen Tests Ernährung Zusammensetzung haben gezeigt, dass Kieselalgen essentiell für das Wachstum und Überleben der Barnacle Nauplien sind. Mehreren Diatomee Arten scheinen als angemessen zu ernähren, obwohl kleine oder einsame Zellen (weniger als 10 µm im Durchmesser) für die Nauplien Einnahme erforderlich sind. Die Art S. Marinoi, C. Simplexund T. Pseudonana haben alle erwiesen sich als ausreichend Futter für B. Improvisus Nauplien, sowie leicht zu kultivieren. Darüber hinaus ist die Futterqualität für exponentiell wachsenden Algen in der Regel höher. Es wurde auch berichtet, dass Kieselalgen für des produktiven Kulturen von B. Amphitrite15unerlässlich sind. Eine Theorie der Bedeutung der Diatomeen ist, dass sie eine einzigartige Fettsäureprofil und sind besonders reich an 20:5 hoch ungesättigten Fettsäure-29. Es hat gezeigt, dass bereits bestimmte Fettsäuren sind wichtig für die erfolgreiche Entwicklung der Auster Larven30.
Im Laufe der Jahre wurden keine Fälle von schädlichen Krankheiten in der Barnacle Kultur. In vielen kommerziellen Wirbellosen Aquakulturen, wie Austern und Muscheln Krankheiten sind recht häufig und können sehr schädlich sein. Schädliche Auswirkungen von Viren haben auch aus Wildpopulationen gemeldet. Die gebürtige Auster in Frankreich wurde ersetzt durch die portugiesische Auster Crassostrea Angulata 1925, aber diese Spezies wurde durch ein Iridovirus um 197031ausgelöscht. Vor kurzem gab es massive Sterblichkeit Ereignisse in die Pazifische Auster Crassostrea Gigas in Kulturen weltweit erscheinenden Ostreid Herpesvirus 132zugeordnet werden soll. Keine Berichte über Krankheitserreger, Bakterien oder Viren auf Seepocken sind bisher erschienen. Jedoch im laufenden Genom-Projekt auf B. Improvisus, Virus-Sequenzen wurden gefunden (Alm Rosenblad Et Al., unveröffentlichte Daten) aber keine offensichtliche Verbindung zu Symptome von Krankheiten. Mischungen von Antibiotika wurden zuvor auf die Kulturen zur Minimierung des Risikos von bakteriellen Infektionen angewendet; Allerdings wird dieses Verfahren derzeit aufgegeben und so weit, hat dies keinerlei Verunreinigungsprobleme verursacht.
Wenn Meerwasser erhitzt wird (wie oben beschrieben), möglicherweise eine Überhitzung das größte Risiko in der Kultur-Fertigungslinie. Es ist natürlich schwierig zum Schutz gegen Überhitzung, obgleich Sensoren und geeignete Alarmsysteme verwendet (z. B.Senden von e-Mail- oder SMS-Nachrichten an Verantwortlichen) sein können. Vorfälle dieser Art in der Vergangenheit führten zu erheblichen Tötung von Erwachsenen in der Kultur. Dies kann natürlich verheerend sein und langfristige Investitionen an Zeit und Geld zu ruinieren. Insbesondere wäre katastrophal, wenn genetische Inzuchtlinien eingerichtet wurden. Um die Langlebigkeit der solche Linien und vor Datenverlust zu sichern, wäre entwickeln eine Kryokonservierung Methodik für Seepocken wünschenswert. Es wurde berichtet, dass die Larven von der pazifischen Auster können sich eingefroren und mit Teilerfolg33wiederbelebt. Kryobank wurde auch ein wertvolles Instrument zur Erhaltung der genetischen Ressourcen von den unterschiedlichsten Arten34. Auch Nauplien von B. Amphitrite werden berichtet, um Einfrieren35zu überleben, und ergab, dass 20 % der Personen eingefroren-Down erfolgreich in Cyprids36verwandelt. Einfrieren für die langfristige Tragfähigkeit der Kulturen Anwendung bisher nicht angenommen worden, aber dies wäre in der Tat für die Aufrechterhaltung der ausgewählten Linien notwendig; Dies wäre ein wesentlicher Schritt, B. Improvisus in eine starke marine Modelsystem fest zu etablieren.
Hier wurde ein Protokoll für die Zerlegung von verschiedenen Geweben von Erwachsenen von B. Improvisus (d.h., Cirri, Soma und Kaminsims) vorgestellt. Allerdings sollte betont werden, dass auch andere Gewebe extrahiert werden können. Zum Beispiel das weiche Gewebe zwischen den äußeren und inneren Mantel der Gattung häutigen-Base Tetraclita Japonica Formosana sorgfältig isoliert und für eine RNA-Extraktion und Analyse der RNA-Seq Gen Ausdruck37verwendet. Die skizzierten optimierte Extraktion Protokoll hier beschriebenen bietet ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA für die Sequenzierung von eine minimale Menge des Ausgangsmaterials. Zunächst minimiert die Auflistung der einzelnen Larven direkt in die Homogenisierung Rohre Verluste während der Übertragung von einem Gefäß in ein anderes. Darüber hinaus gehört zu die verschiedenen Methoden getestet, die Homogenisierung mit keramischen Perlen erwies sich die effizienteste in Bezug auf RNA ergeben und Integrität, im Vergleich zu beschallen oder Stößel Homogenisierung. Bei der Planung für gen-Expression oder Genomik Experimente muss man im Hinterkopf die Herausforderung der hohen genetischen Variation in Seepocken, zumindest für B. Improvisusbehalten. Barnacle hat eine genetische Vielfalt im Bereich von 3 – 5 %, auch bei der Codierung Regionen (Alm Rosenblad Et Al., unveröffentlichte Daten). Das, natürlich stellt spezifische Anforderungen an das Design der Zündkapseln für qPCR Analyse, wo mehr erhalten sollten Regionen identifiziert und als Vorlagen für Primer eingesetzt, um konsistente Ausdruck Ergebnisse Betweenbatches bekommen. Konservierte Regionen für Zielgene, wie Aquaporine und Na + / K +-ATPasen, durch das Studium der Sequenz Variabilität dieser Gene in RNA-Seq Daten aus Populationen von Cyprids mit Hunderten von Personen identifiziert werden können. Für eine Genomanalyse wird DNA entnommen werden. Allerdings kann erhalten qualitativ hochwertige DNA von B. Improvisus 21Herausforderung darstellen.
Abschließend erweist die etablierten Barnacle Kultur sich maßgeblich an verschiedene Arten von experimentellen Studien. Vor allem All-Jahr-um Larven Produktion ermöglicht es uns, Experimente durchzuführen, ohne darauf beschränkt zu den natürlich vorkommenden Laichzeit (für B. Improvisus, dies ist in den Sommermonaten). Erhaltenen Larven können verwendet werden, um eine breite Reihe von experimentellen Studien, einschließlich Siedlung Assays, Verhalten-Assays, Ausdruck Studien über bestimmte Gene sowie Transkriptom genomweite Studien durchzuführen.

Seepocken sind marine Krebstiere mit Traubeneichen Erwachsenen und nautiliden, planktonischen Larven. Die meisten 1.200 Arten von Seepocken bewohnen Flachwasser und viele oft niedrigen Salzgehalt ausgesetzt sind. Eine Spezies, die Bucht Barnacle improvisiert, Balanus (Amphibalanus) (B. Improvisus), verträgt fast Süßwasser und Charles Darwin beschrieb diese Art von einem kleinen Bach in der Mündung des Rio De La Plata in Uruguay1. Die extreme Toleranz Tolow Salzgehalt macht B. Improvisus Modellcharakter für die Studien von osmoregulatorischen Mechanismen2,3besonders relevant. Diese Barnacle bevorzugt Brackwasser Bedingungen aber ist in der Lage sind, Leben in Gewässern mit Salzgehalt von etwa 1,6 Psu zu so hoch wie 40 Netzteil4. Es ist die einzige Barnacle Arten in das Brackwasser der Ostsee. B. Improvisus wird geglaubt, um von der Ostküste des amerikanischen Kontinents stammen aber heute durch5Versand weltweit wegen Verbreitung gefunden. Es ist ein großer Verschmutzung Organismus und findet sich häufig auf Felsen, Molen und Bootsrümpfe und deshalb von allgemeinem Interesse für das Verständnis der Mechanismen von Biofouling an Konstruktionen in marine und Brackwasser6,7.
Ähnlich wie bei den meisten anderen Seepocken, B. Improvisus ist zwittrig mit gegenseitigen Befruchtung; Fortpflanzung geschieht durch Paarung zwischen benachbarten Individuen mit einem länglichen Penis und innere Befruchtung. Die reproduktive Periode ist vor allem von Mai bis September. B. Improvisus hat sieben pelagische Larvenstadien (sechs Nauplien gefolgt von einem Cyprid Stufe8). Das befruchtete Ei schlüpft in eine Nauplius-Larve, die nautiliden und in der Wassersäule für bis zu mehreren Wochen vor der Häutung in eine nicht-Fütterung Cyprid Larve ernährt. Die Cyprid nutzt mehrere Hinweise um zu finden, einen geeigneten Standort zu begleichen und dann erfährt Metamorphose in eine festsitzende juvenile Barnacle-9. Die Art kann im Labor kultiviert werden und hat eine Lebensdauer von 1 – 2 Jahre im Meer (2 – 3 Jahre in Laborkultur). Im Durchschnitt B. Improvisus wächst auf 10 mm im Durchmesser (mit einem Maximum von ca. 20 mm) und erreicht eine maximale Höhe von ca. 6 mm (obwohl es unter beengten Verhältnissen höher zu wachsen). Die Spezies kann durch seine glatte kalkhaltigen sogar Schale (weiß oder grau) identifiziert, der Radial gemusterten kalkhaltigen Basis der die Außenhaut und die Form der Platten sind1,10.
Die Barnacle B. Improvisus hat mehrere vorteilhafte Merkmale als Modell für die Studien der Muskeltätigkeit, mit einem Fokus auf Molekulare und physiologische Mechanismen sowie ökologische Wechselwirkungen und evolutionären Konsequenzen. Es ist auch als Modell für die Untersuchungen zur Beilegung der Biologie, insbesondere in Bezug auf Antifouling-Forschung und die Mechanismen beteiligt7,11,12,13verbreitet. Natürliche saisonale Laichen führt jedoch eine unvorhersehbare Versorgung mit Cyprid Larven für Studien. Die Fähigkeit, diese Barnacle über seinen gesamten Lebenszyklus ganzjährig Kultur ist daher ein wichtiger Trumpf, verschiedene Arten von molekularen und mechanistische Studien ermöglichen. Darüber hinaus erlaubt seine Präsenz in Marine/Brackwasser weltweit für eine Kombination aus Feld und experimentelle Studien. Kontrollierte Zucht produzieren auch Familien von bekannten Stammbäume für langfristige Kultivierung14und eine Generationszeit von ein paar Monaten ermöglicht langfristige experimentelle Evolution. Gibt es auch einen Entwurf des Genoms und mehrere Transkriptom und diese Ressourcen für das Klonen von mehreren Genen (z.B. Gene von Bedeutung für die Muskeltätigkeit)2,3verwendet worden.
Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie aufbauen und pflegen eine Kultur der Barnacle B. Improvisus im Laufe des Jahres um genexpressionsstudien auf Erwachsene oder Larven dieses Organismus durchzuführen. Rittschof Et al. 15 kurz beschrieben eine Methode zur Kultivierung Seepocken aus der Auflösung von Nauplien zur Regelung der Cyprids für die Spezies Balanus Amphitrite. Das Protokoll wurde angepasst für das ganze Jahr über Kultivierung von B. Improvisus Tjärnö Marine Research Laboratory (Schweden), und eine detaillierte Beschreibung aller Schritte in der Fertigungslinie ist skizziert, einschließlich der Erzeugung und Aufzucht von barnacle Larven, als auch die Gabe von Futter für die Larven und Erwachsene. Eine Übersicht über die komplette Prozedur siehe Abbildung 1. Die Nutzung des Systems der Kultivierung ist illustriert mit einigen gemeinsamen Versuchsanordnungen und illustriert in funktionsgenomics Studien von Na+/k+ ATPase und Aquaporine, ihre möglichen Funktionen in Muskeltätigkeit2, Erläuterung 3. Es ist manchmal wichtig, die Genexpression in bestimmten Geweben zu untersuchen, und einige der Grundlagen der Barnacle Dissektion abgedeckt werden. Mit einer guten Versorgung mit qualitativ hochwertigen Meerwasser sollte die Kultivierung von Barnacle B. Improvisusund potenziell viele andere Arten in marine Laboratorien überall auf der Welt möglich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1244px;" width="1243">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels</td>
			<td style="width:364px;">Plastic produkter, Bromma, Sweden</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:385px;">transparent glas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-L PET bottle</td>
			<td style="width:364px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artemia</td>
			<td>INVE Aquaculture, Belgium</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>We have tested different companies; this is really the best one</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5)</td>
			<td style="width:364px;">CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&#160;</td>
			<td style="width:153px;">strain 1077/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)</td>
			<td style="width:364px;">CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&#160;</td>
			<td style="width:153px;">strain 1085/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millipore cartridge filter system</td>
			<td style="width:364px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cartridge with a nominal pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:364px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:153px;">cartridge CWSS01S03</td>
			<td>High capacity for large volumes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polycarbonate bottle</td>
			<td style="width:364px;">Nalgene</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA later</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">76106</td>
			<td>&#160;Fixation solution to preserve RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:364px;">Invitrogen/Thermofisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>DNAse kit to remove DNA from prepared RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:364px;">Biorad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>cDNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green supermix</td>
			<td style="width:364px;">Biorad</td>
			<td>1708880</td>
			<td>Dye for QPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RNeasy minikit</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA extraction of adults or many cyprids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes</td>
			<td style="width:364px;">Precellys</td>
			<td style="width:153px;">KT03961-1-003.2</td>
			<td>Ceramic beads for homogenisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">74004</td>
			<td>RNA extraction of few cyprids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression

Seepocken sind marine Krebstiere mit Traubeneichen Erwachsenen und nautiliden, planktonischen Larven. Die Nonnengänse (Amphibalanus) Balanus Improvisus ist aufgrund seiner extremen zu niedrigen Salzgehalt besonders relevant als Modell für das Studium der osmoregulatorischen Mechanismen. Es ist auch als ein Modell zur Beilegung der Biologie, insbesondere in Bezug auf Antifouling Forschung verbreitet. Natürliche saisonale Laichen führt jedoch eine unvorhersehbare Versorgung mit Cyprid Larven für Studien. Ein Protokoll für die All-Year-Round Kultivierung von B. Improvisus entwickelt wurde und eine detaillierte Beschreibung aller in der Fertigungslinie Schritte wird beschrieben (d. h., die Einrichtung von Erwachsenen Kulturen auf Platten, die Sammlung und Aufzucht von Barnacle Larven, und die Gabe von Futter für die Larven und Erwachsene). Die Beschreibung auch Anleitungen zur Fehlerbehebung und kritische Parameter (z. B.die Entfernung von Verunreinigungen, die Herstellung von qualitativ hochwertigen Futtermitteln, die menschliche Arbeitskraft benötigt und die Bedeutung von qualitativ hochwertigen Meerwasser) diskutiert. Jede Charge von der Kultivierung System maximal ergibt etwa 12.000 Nauplien und liefern vier Chargen in einer Woche, also bis zu fast 50.000 Larven pro Woche hergestellt werden können. Die verwendete Methode zur Kultur B. Improvisus ist wahrscheinlich, zu einem großen Teil auch auf anderen Wirbellosen Meerestieren mit frei Swimminglarvae anwendbar. Protokolle werden für die Zerlegung von verschiedenen Geweben von Erwachsenen als auch die Produktion von qualitativ hochwertigen RNA für Studien auf die Genexpression dargestellt. Es ist auch beschrieben wie kultivierte Erwachsene und gezüchteten Cyprids genutzt werden, in einer Vielzahl von experimentellen Designs zur Untersuchung der Genexpression im Zusammenhang mit externen Faktoren. Die Verwendung von kultivierten Seepocken im Genausdruck ist illustriert mit Studien über mögliche osmoregulatorischen Rolle von Na+/k+ ATPase und Aquaporine.

Mit dem beschriebenen Verfahren für die Kultivierung von Erwachsenen Rankenfußkrebse von B. Improvisuskönnen bis zu vier Chargen der Nauplius Larven pro Woche hergestellt werden. Es wäre möglich, Nauplius-Larven sammeln fast jede Nacht, aber dies erfordert mehr Menschen und Infrastruktur (mit vielen Entenmuscheln in den Brutbeständen, eine Kultur wird release Larven ständig). Ein zusätzliche limitierender Faktor für die Larven Produktion scheint die Verfügbarkeit von Futter von hoher Qualität, insbesondere in Bezug auf die Diatomee Skeletonemasein. Maximal, bestehend Jede Charge aus dem Kultivierung System aus rund 12.000 Nauplien, so dass bis zu 50.000 Nauplien pro Woche kultiviert werden können. Jedoch einige Wochen möglicherweise bis zu Zehnfache weniger Larven produziert. Ein Erwachsener kann bis zu 7.000 Larven pro Tag14, produzieren, die bedeutet, dass 1 – 2 Erwachsene Larven für jede Partie freigeben. Innerhalb einer Woche werden etwa 70 – 90 % der gesammelten Nauplien in Cyprids (etwa 30.000 Cyprids pro Woche, maximal nachgeben) entwickeln, die Siedlung Assays und molekulare Studien verwendet werden können.
Es sollte betont werden, die es Varianten in Cyprid Funktionen zwischen den einzelnen Chargen gibt, und im Allgemeinen gibt es größere Unterschiede zwischen Chargen als in Chargen. Beispielsweise variiert der Einschwingzeit Erfolg in Siedlung Assays zwischen 30 und 70 % für verschiedene Chargen. Am ehesten ist dies durch die individuelle genetische Variation zwischen den spezifischen Paaren der Erwachsenen Freigabe Larven in den verschiedenen Probenahme Perioden verursacht. Empfohlen wird, natürlich, dass wiederholte Experimente (biologische Wiederholungen) Cyprids aus einer Anzahl von Batches umfassen sollte, wenn mehr allgemeine Aussagen über die Ergebnisse vorgenommen werden. Die Variation von Charge zu Charge stellt Anforderungen an die experimentelle Gesamtplanung, wo geeignete Kontrollen und Normierungen in genexpressionsstudien angewendet werden sollte. Aber auch nach mehreren statistischen Normalisierung Verfahren umgesetzt wurden erheblich reduziert, die zwischen Batch-Variation, einige Effekte des Stapels sind in der Regel noch deutlich (unveröffentlichte Daten).
Im Anschluss an das angegebene Protokoll ist es möglich zu erhalten, im Durchschnitt 500 ng hochwertige RNA von weniger als 20 Cyprids, unabhängig von der Phase der Barnacle Siedlung (Tabelle 1). Die Qualität der RNA wird normalerweise als das Verhältnis zwischen 18 und 28 s (die erwartete Position der beiden Gipfel sind in Abbildung 4angegeben) gemessen. Jedoch im Falle von Seepocken und viele andere Arthropoden, 28 s rRNA bricht zusammen, wenn Sie (als Bestandteil der Analysemethode) erhitzt und wandert zusammen mit den 18 Gipfel20. Deshalb gibt es im Prinzip ein einziges rRNA Peak bei dieser Art der Auswertung für Seepocken. Es ergibt sich aus diesem Test (Abbildung 4), dass eine Homogenisierung von keramischen Perlen die RNA mit höchster Integrität bietet und daher die Methode der Wahl ist. Die RNA ist ausreichend in Menge und Qualität zu erzeugen qualitativ hochwertige Sequenzierung Bibliotheken für die Sequenzierung, was einem Durchschnitt von 70 Millionen Lesevorgänge pro Probe (die Anzahl der Lesevorgänge, hängt natürlich, auf der Ebene der Multiplexen während der Sequenzierung). Die RNA ist auch ausreichend für cDNA Synthese und qPCR Expressionsanalyse eine große Anzahl von Genen.
Abbildung 5 zeigt dem Ergebnis von qPCR Analysen der Aquaporine und Na+/k+ ATPase (NAK1) splice-Varianten, wo der Ausdruck Änderungen als Reaktion auf Veränderungen der Umwelt Hinweise2,3untersucht wurden. Ein Vergleich der relativen Ausdruck des langen und kurzen splice Varianten von NAK1 zeigt ein zweifaches erhöhen für die lange NAK1-mRNA in niedrigen Salzgehalt in Bezug auf die kurzen NAK (Abb. 5A). So zeigen die Daten, dass alternatives Spleißen die Langform vorherrschenden niedrigen Salzgehalt Bedingungen macht. Im Falle der Aquaporine geht hervor, dass zwei Wasser-der Transport von Paralogs AQP1 und AQP2 differentielle Expression (Abb. 5B) angezeigt. Insbesondere im Mantel Gewebe ist es offensichtlich, dass die AQP1 deutlich nach unten auf niedrigere Salinität geregelt ist, gilt nicht für AQP2. Stattdessen zeigt AQP2 einen leicht erhöhten Ausdruck bei niedriger Salzgehalt, aber in der Soma. Diese Ergebnisse dienen als Grundlage für die Untersuchung der funktionalen Rollen der verschiedenen B. Improvisus Ionen-Transporter und Aquaporine in Barnacle Muskeltätigkeit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg"> Abbildung 1 : Überblick über die gesamte Kultivierung Verfahren und die RNA-Extraktion für genexpressionsstudien bei Erwachsenen. Um eine neue Kultur zu initiieren, sind Platten auf einem Rahmen befestigt und in das Meer in 1-3 m Tiefe eingesetzt. Nach mehreren Wochen sind die Paneele mit Erwachsenen/Jugendlichen in Gestellen in Schalen im Labor vertikal. Jedes Fach hält ca. 40 Tafeln mit Erwachsenen. Mit rund 100 Erwachsene pro Panel sind in insgesamt ≈ 4.000 Erwachsene Personen kultivierten pro Fach. Der Erwachsene Seepocken werden mit Artemia gefüttert und gehalten werden kann Jahr-rund um. Nauplius-Larven werden mehrmals pro Woche von den Schalen über eine Filterung durch ein Sieb aufgefangen. Die gesammelten Nauplien werden auf Eimer bei 26 ° C im Wasserbad gehalten und gefüttert, mit Mikroalgen übertragen. Nauplien werden gehalten, bis sie in nicht-Fütterung Cyprids, Häuten, die von Filtern gesammelt werden. Neue Platten können im Labor hergestellt werden, durch die Ansiedlung von Cyprids auf Tafeln, entweder um neue Panels für das Jahr zu bieten-rund um Kultur oder für spezifische Versuchsanordnungen mit veränderten äußeren Bedingungen verwendet werden. RNA wird dann von den Jugendlichen/Erwachsenen am Ende des Experiments oder zu bestimmten Zeitpunkten gewonnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg"> Abbildung 2 : Bilder von einige wichtige Schritte in der Kultivierung Prozedur. (A) dieses Bild zeigt die Frames mit Paneelen für neue Populationen aus dem Feld zu sammeln. (B) zeigt dieses Bild die Paneele mit Erwachsene Seepocken von B. Improvisus in Racks, die in Schalen gelegt werden. Die Paneele sind ca. 2 cm voneinander entfernt platziert. (C) dieses Bild zeigt die Tabletts mit den Barnacle, Panels und die Fütterung Tank auf der linken Seite. Aus jedem Fach gibt es eine Steckdose wo die Siebe für die Sammlung der Nauplius-Larven platziert werden. (D) zeigt dieses Bild, dass die Produktion von Artemia für Erwachsene Seepocken zu ernähren. (E) zeigt dieses Bild die Aufzucht von Nauplien in Eimern gelegt in ein Wasserbad legen auf 26 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg"> Abbildung 3 : Beschreibung der ersten Dissektion Schritte der Erwachsene Seepocken: den Körper aus der Schale entfernen. (A) Grab eines der Kiemendeckel Platten durch Einfügen einer Pinzette vorsichtig durch die Öffnung. Ziehen Sie vorsichtig, um die Platte zu entfernen und das Tier aussetzen. (B) ziehen Sie das Tier durch den Soma Teil direkt unterhalb der Cirri greifen. (C) dieser Bereich zeigt die allgemeine Anatomie der Eichel Seepocken. Mantel und potenziell befruchtete Eier (im Eierstock) bleiben in der Schale, wenn Körper herausgezogen wird. Ein Hinweis auf Barnacle Anatomie (für eine tiefer gehende Konto siehe Anderson)9: die Wandplatten von einem Barnacle Neigung nach innen, und zusammen bilden sie einen Vulkan-wie Kegel. Eine Öffnung der Blende fällt unter die beiden Kiemendeckel Platten bilden eine Tür oder ein Operculum, um die Blende zu schließen. Eichel Seepocken haben in der Regel eine kalkhaltige basale Platte, die fest auf das Substrat geklebt wird; Allerdings fehlen einige Arten von Seepocken diese kalkhaltigen Platte (z. B. S. Balanoides). Seepocken absondern, das Exoskelett aus dem dunkel pigmentierte Mantel (Carapax). Die äußere Oberfläche des Mantels doppellagig ist verkalkt, um steif, während die innere Oberfläche des Mantels nicht verkalkt und daher flexibel ist. Innerhalb der Blende sind die Cirri in einer zurückgezogenen Position vorhanden. Dies sind der thorakalen Anhängsel, die Rankenfußkrebse für Aussetzung Fütterung verwenden. Die Eierstöcke befinden sich in der Nähe der Basis der Barnacle, während die Hoden in der Soma liegen. Diese Zahl wurde von Panova Et Al. übernommen 21 und wurde mit freundlicher Genehmigung von Springer veröffentlicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg"> Abbildung 4 : Bestimmung der rRNA Integrität durch Kapillare Gelelektrophorese. RNA wurde von zwei verschiedenen Homogenisierung Methoden vorbereitet: Ultraschall (A) und (B) Keramik Perlen. Die Einheit auf der y-Achse, FU, steht für Fluoreszenz-Einheiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg"> Abbildung 5 : Genexpression ergibt sich aus zwei verschiedenen Studien von Genen, die wichtig für die Muskeltätigkeit in B. Improvisus. (A) dieses Panel zeigt die differentielle Expression gemessen am qPCR Splice-Varianten des Na+/+ ATPase NAK1 als Reaktion auf verschiedene Salzgehalte und pCO2 k3Ebenen. Bei der Behandlung von niedrigen Salzgehalt, Ausdruck der langen Isoform (NAK1-L) steigt im Verhältnis zu den kurzen (ANOVA, P < 0,001). (B) dieses Panel zeigt den Ausdruck der Aquaporine bei Erwachsenen von B. Improvisus während ihrer Exposition gegenüber verschiedenen Salzgehalte2. qPCR wurde verwendet, um die Aquaporin Ausdruck Ebenen relativ Aktin bestimmen. Erwachsene Personen waren bei 3 verschiedenen Salzgehalte (3, 20 und 33 PSU) für 14 Tage inkubiert. Für die RNA-Vorbereitung wurden der Soma, Cirri und Mantel der Erwachsenen getrennt. In beiden Abbildungen zeigen Fehlerbalken die Standardabweichung. Die ** und *** zeigen das Signifikanzniveau (ANOVA), 0,01 und 0,001, beziehungsweise. Diese Zahlen wurden von Lind Et Al. modifiziert 2 , 3. beide Figuren sind mit freundlicher Genehmigung von PLoS ONE veröffentlicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Siedlungsphase</td>
			<td>Gesamtbetrag der RNA (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Freies Schwimmen</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exploration: Enge Suche</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beigefügten cyprid</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neu verwandelt juvenile</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Renditen von RNS. Diese Tabelle zeigt die RNA-Menge mit einer RNA-vorbereitungssatz von Pools von 20 Cyprid Individuen gesammelt in den verschiedenen Phasen bei der Abrechnung extrahiert.

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The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Die Nonnengänse (Amphibalanus) Balanus Improvisus ist ein Modell für die Untersuchung Muskeltätigkeit und Antifouling. Natürliche saisonale Laichen führt jedoch eine unvorhersehbare Versorgung mit Cyprid Larven. Hier ist ein Protokoll für die All-Year-Round Kultivierung von B. Improvisus beschrieben, einschließlich der Erstellung von Larven. Die Verwendung von kultivierten Seepocken in genexpressionsstudien wird dargestellt.

Die Barnacle Balanus Improvisus als Marine Modell - Kultivierung und Genexpression

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VACUSIP eine verbesserte Inex Methode für<em&gt; In Situ</em&gt; Messung von partikulären und gelösten Verbindungen, die durch Active Suspension Feeders Verarbeitet

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

Entwicklung neuer Methoden zur Quantifizierung der Fisch-Dichte mit Unterwasser-Stereo-Video-Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

Methods for Image-based Surveys of Benthic Macroinvertebrates and Their Habitat Exemplified by the Drop Camera Survey for the Atlantic Sea Scallop

Methoden zur Image-basierte Umfragen von benthischen Makroinvertebraten und ihren Lebensraum am Beispiel der Drop-Kamera-Umfrage für die Atlantik-Jakobsmuschel

Underwater imaging has long been used in the field of marine ecology but decreasing costs of high-resolution cameras and data storage have made the ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Individuelle Kultivierung von Copepoden Tigriopus und Quantitative Analyse ihres Verhaltens Mate-Bewachung

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster (Nephrops norvegicus)

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster Nephrops norvegicus

Langfristige Video Tracking Cohoused Wassertiere: A Case Study of der Bewegungsorgane Tagesaktivität der Kaisergranat (Nephrops Norvegicus)

We present a protocol related to a video-tracking technique based on the background subtraction and image thresholding that makes it possible to ...

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Microfocus X-ray CT microCT Imaging of Actinia equina Cnidaria, Harmothoe sp. Annelida, and Xenoturbella japonica Xenacoelomorpha

Mikrofokus-Röntgen-CT (microCT) Bildgebung von Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) und Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...