Name: the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00
Duration: 7 min 47 s
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이 연구는 그랜트 2017-04559 스웨덴 연구 위원회 (VR)과 EU 지원된 프로젝트 해안가에서 앤 더 스 Blomberg에 의해 지원 되었다. 특히, 자란 시설의 설립, 년간, 지원 되었습니다 교부 금에 의해 R. 존슨은 당을 다음 자금 지원 기관에서: SSF (스웨덴 전략 연구 재단) 해양 과학 프로그램 및 기술 및 MISTRA 해양 페인트 프로그램을 통해입니다. 켄트 Berntsson는 culturingfacility를 설정 하는 초기 단계에서 쓸모 있었다. 추가 해양 진화 생물학 (www.cemeb.science.gu.se)에서 왔다 자란 시설 설립을 위한 자금, 스웨덴 연구 위원회 FORMAS와 VR에서 Linnaeus 교부 금에 의해 지원.

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저자는 선언할 수 없다.

Tjärnö 해양 연구소 (스웨덴)에서 따개 비 문화 20 년 이상를 실행 하 고 많은 다른 연구 분야에서 연구를 위해 사용 되었습니다. 30 과학 논문 출판 되었습니다 antifouling13,22, 유체역학23, 화학 생태학24연구를 포함 하 여 지난 년 동안 자란 시스템을 활용, 기후 변화16 ,5, 진화 생물학 및 분자 생물학2.
실험실 환경 (개인 야생 인구를 대표 하지 않을 수 있습니다)에 더 적응은 특정 개인의 선택을 방지 하려면 필드에서 매년 새로운 broodstock를 수집 하는 것이 좋습니다. 또한, 정상적인 년 동안 성인 사망률의 50-80%는 대략 이후 매년, 문화를 젊 어지게 하는 좋은 연습 이기도 합니다. 그러나, 목표는 타고 난된 라인 하거나 실험 진화의 연구를 설정 하 여, 실험실 reared 가족만 사용할 수 있습니다.
Tjärnö 해양 연구소에서 패널 B. improvisus 를 수집 하는 좋은 시간은 그 당시에 바다에서 cyprid 애벌레의 좋은 공급 6 월-8 월입니다. 따개 비 정착이 시작 될 때 참조를 수동으로 제거 하는 다른 패널 주간 정착 B. improvisus (예를 들어, 홍합, tunicates, 이끼, 또, nemerteans/tubeworms, 및 다른 따개 비 종) 보다 종에서 확인 된 패널 (예를들면, 칫 솔로). Tjärnö, 주위 3 얕은-물 따개 비 종 존재 (B. improvisus, Semibalanus balanoides, Balanus crenatus)이 있다. 그러나, B. improvisus 7 월-8 월 동안 지배적인 부드러운 하드 표면 fouler 이다. S. balanoides 의 정착 기간 이른 봄 동안 있으며 주로 자연 기판 (예:, 돌)을 좋아한다. B. crenatus 패널에 낮은 숫자는 여름 동안 발생할 수 있습니다.
그것은 또한 특정 특성으로 특정 linages를 설립 하는 경우에 필수적인 것입니다, 교양된 cyprids에서 또는 실험 진화의 연구에 새로운 성인 따개 비 세대 시작 가능. 어른 들의 새로운 세대를 시작 하는 가장 편리한 방법은 실험실에서 열가 소성 패널에 cyprids 정착 하는 것입니다. 실험적 치료 또는 노출 필드에 새로 정착된 cyprids이이 패널을 사용할 수 또한. 비상의 경우, 하나는 근처 사이트에서 (예를 들어, Tjärnö 해양 연구소의 경우 Idefjorden) B. improvisus 는 일반적인 바위에 성인을 사용할 수도 있습니다. 이러한 이미 설정 된 성인 따라서 쟁반에 배치 되는 패널에 성인으로 서 동일한 방식에서으로 처리 되며 시스템을 통해 흐름 통해 먹이. 흐름 세포 barnacles25패널 설정 또한 사용할 수 있습니다. 이들은 플랑크톤에는 cyprids 정착 하지 않는, 애벌레에 대 한 유일한 타협 표면으로 패널 측에 그물과 흐름을 통해 챔버.
장기적인 작동 따개 비 문화 등 모든 생활 단계를 설정 하기 위한 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 문화 B. improvisus 에 사용 되는 메서드는, 훌륭한 정도, 또한 free-swimming, planktotrophic 애벌레와 다른 해양 무척 추 동물에 적용. 자란 절차 일부 종족은 이미 잘 설명 되어 있습니다 (예를 들면, 파란 홍합, 굴의 다른 종에 대 한)26, 다른 해양 무척 추 동물에는 그들의 일생에 걸친 장기 문화의 몇 가지 예만 주기. 문화 barnacles (B. amphitrite)를 최초의 성공적인 시도의 하나 Rittschof 그 외 여러분 에 의해 수행 됐다 15. 장기 재정 및 개인 자원 시설 재배는 따개 비를 설정 하기 전에 장소에 있어야 한다. 올해의이 종류의 유지 관리-따개 비의 주위 문화 적어도 한 사람 작업 하프 타임 필요 합니다. 미래 자동화 미세27의 경작 주로 생산 라인에 몇 가지 단계에 대 한 몇 가지 가능성이 있을 수 있습니다. 또한, 성공 하기 위해서는, 높은-품질 바닷물의 다량에 접근이 필수적입니다. Microalgae, Artemia, barnacles의 경작 어떤 특정 안전 절차는 포함 되지 않습니다. 그러나, 일부 antifouling 물질 또는 독성 화학 물질의 특별 한 조치를 할 수 있습니다.
패널은 오염에 대 한 주에 여러 번 체크 했다. 문화에서 사용 하는 해 수 Tjärnö 해양 연구소 밖에 서 요금 피에 40 m 깊이에서 펌핑 하 고 실험실 물 시스템에 들어가기 전에 2 개의 모래 필터를 통해 전달 했다. 경우 물 필터링 했다, 문화에 더 많은 오염 될 수 있습니다. 암 및 다른 무척 추 동물 (예를 들어, stolon 건물 또과 육 식 nemerteans)는 필드에서 바닷물의 공급을 통해 시스템을 입력 하는에서 문화에 패널을 정기적으로 청소 필수적 이다. 예를 들어 아무 애벌레도 불구 하 고 생산 하는 경우 잘 먹이 달리 문화 되었습니다 사실 있을 것 양호한 상태로, 짝짓기를 억제 하기 위해 표시 되는 nemerteans의 문제일 수 있습니다. 당연히, 많은 Tjärnö 해양 연구소에서 문화에 오염 생물의 스웨덴 서해안에 대 한 특정 되었고 오염 생물의 유행 되며 다른 지역에서 도전의 더 많은 것. 스웨덴의 서해안에는 패널에 다른 따개 비 종에 의해 오염 데 보통 아니다. 때때로, S. balanoides 의 설립 발견 되었습니다, 하지만 이것은 매우 한계 문제 (가장, 한 S. balanoides 오염 물질 10000 B. improvisus 샘플에 대 한). 종 오염의 부족 대부분 여름 동안 때 larvaefrom B. improvisus 매우 지배 했다 새로운 문화를 확립 하 정권에 의존 했다. 또한, 또한 있었다 패널에 B. improvisus 의 맑은 농축 이기 때문에이 종 부드러운 표면13에 대 한 선택적.
죽은 성인 barnacles 제거에 필수적 이다입니다. 빈 껍질 패널에 남아 있습니다, 그들은 모두 Artemia nauplii 뿐만 아니라 다양 한 오염 종족에 대 한 대피 소 될 수 있습니다. 또한, 그것은 죽은 개인 개인, 아마 분해 동안 독성 화합물의 출시와 함께 이웃의 영향을 발견 되었습니다. 성인 사망률의 추가적인 결과 일부 개인 남아 있을 것입니다 혼자와 너무 멀리 떨어져 (비록 barnacles의 크기에 관하여 동물의 세계에서 가장 긴 성 기를가지고) 짝짓기 있도록 다른 성인에서 이다28. 이러한 개인 생존 하지만 애벌레에 대 한 비 생산적 이다. 그러나, 이러한 고독한 성인 개인 베이스 플레이트를 해치지 않고 부드럽게 제거 될 수 있다 고 짝짓기 수 있도록 다른 사람에 가까이 수평으로 배치. Barnacles 또한 각 성인 한 패널을 배치 하 여 성관계 수 있습니다 하지만 십자가 발생할 수 있도록 충분히 가까이. 이 방법에서는, 유전 라인 생산된14될 수 있습니다.
그것은 높은 품질의 사료를 생산 하 고 피드 문화 거의 매일 중요입니다. 심지어 며칠 음식 없이 애벌레의 감소 릴리스에서 발생할 수 있습니다. 식단 구성의 이전 테스트 규조류는 성장과 따개 비 nauplii의 생존을 위해 필수적으로 나타났습니다. 몇몇 규조류 종으로 적절 한 것을 먹이, 비록 작은 또는 독방 셀 (직경에서 10 μ m) nauplii의 섭취 할 수 있습니다. S. marinoi, C. 단순, T. pseudonana 종 모두 B. improvisus nauplii, 물론 육성 하기 쉬운 적절 한 피드 수를 입증 해야 합니다. 또한, 피드 품질은 기 하 급수적으로 성장 하는 조류에 대 한 일반적으로 더 높은. 그것은 또한 알려졌다 규조류 B. amphitrite15의 생산적인 문화 구축을 위한 필수적입니다. 규조류의 중요성의 이론은 그들은 독특한 지방산 프로필 있고 특히 높은 불포화 20:5 지방산29풍부 이다. 그것은 보였다 그 특정 지방산 굴 애벌레30의 성공적인 개발을 위해 중요 하다.
년 동안, 따개 비 문화에 해로운 질병의 아무 incidences 되었습니다. 굴과 홍합, 같은 많은 상업적인 무척 추 동물 강포한에서 질병 보다 일반적 이며 매우 해로울 수 있습니다. 바이러스의 해로운 효과 또한 강포한 인구에서 보고 되었습니다. 프랑스에서 네이티브 굴 포르투갈 굴 Crassostrea angulata 1925 년에 대체 되었다 그러나이 종 197031주위는 iridovirus에 의해 전 멸 했다. 더 최근에, 태평양 굴 Crassostrea giga 문화, 전세계에 ostreid herpesvirus 132연관 될 것으로 보인다에서 대규모 사망 이벤트 되었습니다. 병원 균, 박테리아, 또는 바이러스 barnacles에 보고 지금까지 출판 되었습니다. 그러나, B. improvisus에 지속적인 게놈 프로젝트, 바이러스 시퀀스에 발견 했다 (Alm Rosenblad 그 외 여러분, 게시 되지 않은 데이터) 하지만 질병의 증 후에 아무 명백한 링크와 함께. 항생제의 혼합물; 세균 감염의 위험을 최소화 하기 위해 문화에 적용 된 이전 그러나,이 절차는 현재 중단 하 고 지금까지,이 모든 오염 문제를 발생 했습니다.
해 수 (위에서 설명한)로 열을 하는 경우 과열 문화 생산 라인에서 가장 심각한 위험이 있을 수 있습니다. 그것은, 물론, 센서 및 적절 한 경고 시스템 사용 (예를 들어, 책임 있는 사람에 게 전자 메일 이나 텍스트 메시지를 보내는) 될 수 있지만, 과열에 대하여 보호 어렵다. 과거에 이런이 종류의 성인 문화에 상당한 살인에 이어지고 있다. 이 과정의 엄청난 하 고 시간과 비용의 장기 투자를 망칠 수 있습니다. 특히, 타고 난된 유전자 라인 설립 되었습니다 경우 치명적인 것입니다. 같은 라인의 장 수를 보장, 실수로 손실 로부터 그들을 보호 하는 barnacles cryopreservation 방법론을 개발 하는 것이 좋습니다 것입니다. 그것은 태평양 굴에서 애벌레 아래로 고정 하 고 부분적인 성공33으로 부활 수 있습니다 보고 되었습니다. Cryobanking 다양 한 종34의 유전 자원 보존에 유용한 도구가 되었습니다. B. amphitrite 에서 심지어 nauplii 냉동35, 생존을 위해 보고 하 고 냉동 다운 개인의 20% 성공적으로 cyprids36로 metamorphosed 발견 됐다. 그러나, 문화의 장기적인 지속 가능성에 대 한 동결을 적용 지금까지 채택 되지 않았습니다, 하지만이 실제로 선택 된 라인;의 유지 관리를 위해 필요한 것 이 강력한 해양 modelsystem에 B. improvisus 를 단단히 구축 하는 중요 한 단계 것입니다.
여기, 프로토콜 B. improvisus (즉, cirri, 소마, 및 벽난로)의 성인에서 다양 한 조직에의 해 부에 대 한 제시 했다. 그러나, 그것은 다른 조직 또한 추출 될 수 있다 강조 한다. 예를 들어, 막 베이스 종 Tetraclita japonica formosana 의 외부 및 내부 맨 틀 사이의 부드러운 조직 되어 신중 하 게 절연과 RNA 추출 및 유전자 식37의 RNA seq 분석에 사용. 여기에 설명 된 개요 최적화 된 추출 프로토콜 시작 물자의 최소한의 금액에서 시퀀싱에 대 한 높은-품질 RNA의 충분 한 양을 제공 한다. 첫째, 균질 튜브에 직접 개별 애벌레의 컬렉션 1 개의 관에서 다른 쪽으로 전송 하는 동안 손실을 최소화합니다. 또한, 여러 가지 방법 중 테스트, RNA의 측면에서 가장 효율적인 얻을 것을 입증 하는 세라믹 구슬 및 무결성, 쥡니다 또는 유 봉 균질에 비해 균질. 유전자 발현 또는 게놈 실험 계획, 하나는 명심 barnacles에 높은 유전 변이의 도전 이상 B. improvisus에 대 한 있다. 따개 비 범위에서 3-5%, 지역 (Alm Rosenblad 그 외 여러분, 게시 되지 않은 데이터) 코딩에 유전적 다양성이 있다. 이것, 물론, 정량 분석에 대 한 프라이 머의 디자인에 특정 요구를 두고, 지역을 식별 및 사용 뇌관에 대 한 일관 된 식 결과 betweenbatches를 얻기 위하여 어디에 더 보존. 대상 유전자에 대 한 보존된 지역 처럼 aquaporins Na + K + ATPases, 개인의 수백을 포함 하는 cyprids의 인구에서 가져온 RNA-seq 데이터에서이 유전자의 순서 가변성을 공부 하 여 확인할 수 있습니다. 게놈 분석 DNA 샘플링 됩니다. 그러나, B. improvisus 에서 양질의 DNA를 얻는 전하실 수 있습니다21.
결론적으로, 설립된 따개 비 문화 다양 한 실험 연구에에서 도움이 될 입증 되었습니다. 특히, 모든 년 주위 애벌레 생산 수를 자연스럽 게 발생 산란 기간에 제한 되지 않고 실험을 실시 ( B. improvisus, 이것은 여름 동안). 취득된 애벌레는 실험 연구, 게놈 전체 transcriptome 연구 뿐만 아니라 정착 분석, 동작 분석, 특정 유전자에 대 한 표현 연구 등의 다양 한 세트를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Barnacles는 고착 성인 해양 갑각류 그리고 free-swimming, planktonic 애벌레. 대부분 1, 200 종의 barnacles의 얕은 물에 서식 하 고 많은 종종 낮은 염 분에 노출 되는. 1 종, (B. improvisus), Balanus (Amphibalanus) improvises 베이 따개 비 거의 민물 용납 수 고 찰스 다윈 우루과이1리오 데 라 플라타의 강어귀에서 작은 개울에서이 종 설명. 극단적인 관용 tolow 염 분은 B. improvisus osmoregulatory 메커니즘2,3의 연구에 대 한 특히 적합 모델. 이 따개 비 소금기 조건을 선호 하지만 약 1.6 psu에서 salinities와 함께 바다에 살고 있는 수 40 psu4로 높은. 그것은 소금기 있는 발트 해에서 발견 하는 유일한 따개 비 종입니다. B. improvisus 은 미국 대륙의 동해에서 발생 한 것으로 생각 하지만 오늘 발견 된다 분산으로 인해 전세계 배송5. 그것 주요 오염 유기 체와 바위, jetties와 보트 선체에 일반적으로 발견 되 고 따라서 해양 고 소금기 있는 물6,7건축에 미생물 파울 링의 메커니즘을 이해 하기 위한 일반적인 관심의.
마찬가지로 다른 대부분 barnacles, B. improvisus 는 십자가;와 자웅 동체 복제는 길쭉한 성 기 및 내부 수정을 사용 하 여 인접 개인 사이 짝짓기를 통해 발생 합니다. 생식 기간은 주로 5 월에서 9 월입니다. B. improvisus 는 7 원양 애벌레 단계 (6 nauplii 한 cyprid 단계8다음). Nauplius 애벌레 free-swimming 이며 비 먹이 cyprid 유 충으로 탈피 하기 전에 몇 주까지 물 열에 피드로 수정 란 해치. cyprid 정착에 적합 한 사이트를 찾을 수 여러 단서를 사용 하 고 무 청소년 따개 비9로 변 태를 겪 습. 종은 실험실에서 경작 될 수 있으며 바다 (실험실 문화에서 2-3 년)에 1-2 년의 수명이 있다. 평균, B. improvisus (최대 약 20 m m)로 지름 10 m m를 성장 하 고 (비록 그것은 붐비는 조건 하에서 키가 성장할 수 있는) 약 6 mm의 최대 높이 도달. 종 수 쉘 접시의 방사형 패턴된 석탄 기지와 tergal 접시1,10의 모양 부드러운 석도 껍질 (흰색 또는 회색 빛이 나)으로 식별.
따개 비 B. improvisus 를 위한 osmoregulation, 분자 및 생리 적 메커니즘 뿐 아니라 생태 상호 작용 및 진화 결과에 초점을 맞춘 연구 모델로 여러 유리한 특징 있다. 그것은 또한 널리 antifouling 연구과 메커니즘 관련된7,11,,1213특히 생물학, 정착의 조사에 대 한 모델로 사용 됩니다. 그러나, 자연 계절 산란 연구 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 1 년 내내 그것의 전체 수명 주기를 통해이 따개 비를 문화 능력은, 그러므로, 분자와 기계 론 적인 연구의 다양 한 형식을 사용할 수 있도록 하는 주요 자산. 또한, 전세계 해양/소금기 있는 바닷물의 존재 필드와 실험 연구의 조합 수 있습니다. 제어 번 식도 장기 자란14, 알려진된 혈통의 가족을 만들 수 있습니다 그리고 몇 개월의 세대 시간 장기 실험적인 발전을 허용할 수 있습니다. 또한 있다 초안 게놈 및 여러 transcriptomes 사용할 수 있는, 그리고 이러한 리소스 여러 유전자 (예를들면, osmoregulation에 있는 중요성의 유전자)2,3의 복제에 대 한 사용 되었습니다.
이 프로토콜의 목표 고 성인 또는 애벌레의이 유기 체에 유전자 표현 연구를 수행 하기 위해 연중 따개 비 B. improvisus 의 문화를 유지 하는 방법을 설명 하는 것입니다. Rittschof 외. 15 는 짧게 barnacles nauplii의 출시에서 Balanus amphitrite종족에 대 한 cyprids의 타협을 경작 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 B. improvisus Tjärnö 해양 연구소 (스웨덴)의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 적응 되었습니다 및 생산 라인의 모든 단계에 대 한 자세한 설명이 나와 있는, 따개 비의 양육 및 생산을 포함 하 여 애벌레, 뿐만 아니라 성인과 애벌레에 대 한 피드 관리. 완전 한 절차의 개요 그림 1을 참조 하십시오. 자란 시스템을 사용 하 여 몇 가지 일반적인 실험 설정 함께 exemplified 이며 나+의 기능 유전체학 연구에 /K+ ATPase 그리고 aquaporins elucidating osmoregulation2, 그들의 가능한 기능 3. 그것은 때로는 필수적인 특정 조직에서 유전자 발현을 검토 하 고 따개 비 해 부의 기초의 일부 적용 됩니다. 높은-품질 바닷물의 좋은 공급, B. improvisus, 따개 비 그리고 다른 잠재적으로 많은 종의 경작 가능 해야 세계 해양 연구소.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1244px;" width="1243">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels</td>
			<td style="width:364px;">Plastic produkter, Bromma, Sweden</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:385px;">transparent glas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-L PET bottle</td>
			<td style="width:364px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artemia</td>
			<td>INVE Aquaculture, Belgium</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>We have tested different companies; this is really the best one</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5)</td>
			<td style="width:364px;">CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&#160;</td>
			<td style="width:153px;">strain 1077/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)</td>
			<td style="width:364px;">CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&#160;</td>
			<td style="width:153px;">strain 1085/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millipore cartridge filter system</td>
			<td style="width:364px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cartridge with a nominal pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:364px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:153px;">cartridge CWSS01S03</td>
			<td>High capacity for large volumes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polycarbonate bottle</td>
			<td style="width:364px;">Nalgene</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA later</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">76106</td>
			<td>&#160;Fixation solution to preserve RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:364px;">Invitrogen/Thermofisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>DNAse kit to remove DNA from prepared RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:364px;">Biorad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>cDNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green supermix</td>
			<td style="width:364px;">Biorad</td>
			<td>1708880</td>
			<td>Dye for QPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RNeasy minikit</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA extraction of adults or many cyprids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes</td>
			<td style="width:364px;">Precellys</td>
			<td style="width:153px;">KT03961-1-003.2</td>
			<td>Ceramic beads for homogenisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">74004</td>
			<td>RNA extraction of few cyprids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression

Barnacles는 고착 성인 해양 갑각류 그리고 free-swimming, planktonic 애벌레. 따개 비 Balanus (Amphibalanus) improvisus 낮은 염 분에 극단적인 관용 때문에 특히 관련 osmoregulatory 메커니즘의 연구에 대 한 모델 이다. 그것은 또한 널리 antifouling 연구에 관하여 특히 생물학, 정착의 모델로 사용 됩니다. 그러나, 자연 계절 산란 연구 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 프로토콜 개발 되었습니다 B. improvisus 의 모든 연중 재배 및 모든 상세한 설명 단계 생산 라인에 대 한 설명입니다 (즉, 패널, 컬렉션의 양육에 성인 문화의 설립 따개 비 애벌레, 그리고 성인과 애벌레에 대 한 피드 관리). 설명 또한 문제 해결에 제공 하 고 중요 한 매개 변수 (예를 들어, 오염 제거, 양질의 사료 생산, 필요한 인력 및 높은-품질 바닷물의 중요성)에 대해 설명 합니다. 자란 시스템에서 각 일괄 처리 극대로 대략 12000 nauplii 있고 주 당 거의 50000 애벌레까지 생성 될 수 있다 그래서 일주일에 4 개의 일괄 처리를 제공할 수 있습니다. 문화 B. improvisus 에 사용 되는 방법, 아마, 대부분은 또한 무료 swimminglarvae와 다른 해양 무척 추 동물에 적용입니다. 프로토콜은 다양 한 조직의 해 부에 대 한 유전자 발현에 대 한 연구에 대 한 높은-품질 RNA의 생산 뿐만 아니라 성인에서 되 게 됩니다. 그것은 또한 설명된 어떻게 교양된 성인 그리고 reared cyprids 다양 한 외부 요인에 관하여 유전자 발현을 조사 하기 위한 실험 설계에에서 이용 될 수 있다. 유전자 발현에서 교양된 barnacles의 사용은 나+의 가능한 osmoregulatory 역할의 연구와 함께 삽화가 /K+ ATPase 그리고 aquaporins.

B. improvisus의 성인 barnacles의 경작에 대 한 설명 절차 nauplius의 4 개의 일괄까지 애벌레 생산 수 있습니다 주당. 그것은 거의 매일 밤 nauplius 애벌레를 수집 가능한 것 하지만이 더 많은 사람과 인프라 필요 (는 broodstock에 많은 barnacles, 문화 것입니다 릴리스 애벌레 지속적으로). 애벌레 생산에 대 한 추가 제한 요소가 특히 규조류 Skeletonema에 관한 높은 품질의 공급 여부를 것 처럼 보인다. 극대, 자란 시스템에서 각 일괄 처리 약 12000 nauplii, 주 당 50000 nauplii까지 경작 될 수 있도록 구성 되어 있습니다. 그러나, 몇 주 수 있습니다 생산 10 배 적은 애벌레까지. 단일 성인 하루14, 1-2 성인 애벌레 각 일괄 처리에 대 한 발표는 즉 당 최대 7000 애벌레를 생성할 수 있습니다. 일주일, 내 수집된 nauplii의 약 70-90% 정착 분석 및 분자 연구에 사용할 수 있는 cyprids (극대로 대략 30000 cyprids / 주, 저조한)으로 개발할 것입니다.
그것은 배치, 사이 cyprid 기능에 변화가 있다는 것을 강조 했다 한다 그리고 일반적으로, 더 큰 변이 사이 일괄 처리 내에서 일괄 처리 보다 있다. 예를 들어 정착 성공 정착 분석 실험에서 30와 다른 일괄 처리에 대 한 70% 사이 다릅니다. 대부분, 이것은 다른 샘플링 기간 동안 애벌레를 방출 하는 성인의 특정 쌍 사이의 개별 유전자 변이 의해 발생 합니다. 그것은, 물론, 반복된 실험 (생물 복제) 결과 대 한 보다 일반적인 진술을 만들 수 있다면 다양 한 일괄 처리에서에서 cyprids를 포함 해야 것이 좋습니다. 일괄 배치 변화 적절 한 컨트롤과 유전자 표현 연구에 정규화를 적용 한다 실험적인 디자인에 요구를 넣습니다. 그러나, 몇 가지 통계 표준화 절차 구현 된 후에는 상당히 배치 사이 변이 감소, 일괄 처리의 일부 효과 일반적으로 여전히 명백한 (되지 않은 데이터).
제공 된 프로토콜에 따라 그것은, 평균, 500을 얻을 수 따개 비 (표 1)의 단계에 관계 없이 작은 20 cyprids에서 높은-품질 RNA의 ng. RNA의 품질은 일반적으로 (두 봉우리의 예상된 위치는 그림 4에 표시 된) 18와 28S 봉우리 사이의 비로 측정 됩니다. 그러나, barnacles 및 다른 많은 절지동물, 28S rRNA (분석 방법의 일환)으로 열 하면 분해 하 고 18 피크20함께 마이그레이션합니다. 이 때문에 거기에, 원칙, 하나 하나의 rRNA 피크 barnacles에 대 한 분석의이 종류에서. 이 테스트 (그림 4) 세라믹 구슬에 의해 균질 높은 무결성으로 RNA를 제공 하 고는, 따라서, 방법의 선택에서에서 분명 하다. RNA 샘플 (읽기, 수가,는 시퀀싱 하는 동안 멀티플렉싱의 수준에 따라) 당 70 백만 읽기의 평균 발생 금액 및 시퀀싱에 대 한 높은-품질 시퀀싱 라이브러리를 생성 하는 품질에 충분 하다. RNA의 금액 또한 많은 유전자의 cDNA 합성 및 정량 식 분석을 위해 충분 하다.
그림 5 에서는 aquaporins 나+의 정량 분석에서 결과 /K+ ATPase (NAK1) 결합 이체, 식 변화 변화 환경 단서2,3에 대 한 응답에서 조사 되었다. 긴 및 짧은 상대 식의 비교는 두 가지 짧은 NAK (그림 5A)에 관하여 낮은 염 분에 긴 NAK1 mRNA에 대 한 증가 하는 NAK1 쇼의 변종 결합. 따라서, 데이터 대체 접합는 긴 양식 낮은 염 분 조건에서 우위를 나타냅니다. Aquaporins, 경우 그것은 명백한 두 물 수송 paralogs AQP1 및 AQP2 차동 식 (그림 5B) 표시. 특히, 맨 틀 직물에서 그것은 명백한는 AQP1는 실질적으로 다운 낮은 salinities에 통제는 AQP2에 나타나지 않습니다. 대신, AQP2는 낮은 salinities, 그러나 soma에 약간 증가 식을 보여 줍니다. 이러한 결과 다른의 기능 역할의 조사에 대 한 기반을 제공 B. improvisus 이온 운송업 자 및 aquaporins 따개 비 osmoregulation에.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg"> 그림 1 : 전체 절차 및 성인 유전자 표현 연구에 대 한 RNA 추출 배양의 개요. 시작 하려면 새로운 문화, 위원회는 프레임에 연결 하 고 1-3 m 깊이에서 바다에 배포. 몇 주 후, 성인/청소년 패널 실험실에 쟁반에서 선반에 수직으로 배치 됩니다. 각 트레이 성인 약 40 패널을 보유 하고있다. 패널 당 약 100 성인, 총 ≈에 4000 성인 개인은 트레이 당 경작. 성인 barnacles Artemia 를 품고 고 지켜질 수 년-주위. Nauplius 애벌레는은 쟁반 을 통해 체질 필터링에서 일주일에 여러 번 수집. 수집 된 nauplii 양동이 물 욕조에 26 ° C에서 보관 하 고 먹이 microalgae로 전송 됩니다. 그들이 먹이 비 cyprids, 필터링 의해 수집으로 털 갈이 때까지 nauplii reared 있습니다. 새로운 패널의 정착 cyprids 패널, 중 년에 대 한 새로운 패널을 제공 하 여 실험실에서 설정할 수 있습니다-주변 문화 또는 변경 된 외부 조건 특정 실험 설정에 대 한 사용 될. RNA는 청소년/성인 실험의 끝에 또는 특정 시간 시점에서 다음 추출 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg"> 그림 2 : 이미지의 자란 절차에서 몇 가지 중요 한 단계. (A)이이 이미지 패널 분야에서 새로운 인구를 수집 하기 위한 프레임을 보여 줍니다. (B)이이 이미지 랙 트레이에 배치 됩니다에 B. improvisus 의 성인 barnacles와 패널을 보여 줍니다. 패널 약 2 cm 떨어져 배치 됩니다. (C)이이 이미지 패널과 왼쪽 먹이 탱크는 따개 비와 쟁반을 보여 줍니다. 각 트레이 체 nauplius 애벌레의 컬렉션에 대 한 배치는 콘센트가입니다. (D)이이 이미지 Artemia 생산 피드 성인 barnacles를 보여줍니다. (E)이 화면은 nauplii에 26 ° c 설정 물 욕조에 배치 하는 양동이의 양육 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg"> 그림 3 : 성인 barnacles의 해 부에 초기 단계의 설명: 그것의 포탄에서 시체를 제거. 부드럽게 조리개를 통해 포 셉을 삽입 하 여 opercular 접시 중 하나는 (A) 잡아. 접시를 제거 하 고 동물을 노출 부드럽게 당겨. (B) 바로 아래는 cirri 소마 부분을 잡아서 동물 밖으로 당겨. (C)이이 패널 도토리 barnacles의 전반적인 구조를 보여 줍니다. 시체를 꺼내은 맨 틀 및 (난소)에서 잠재적으로 수정된 계란 포탄 구멍에 있어. 따개 비 해부학에 대 한 참고 (자세한 계정 참조 앤더슨)9: 벽 격판덮개는 따개 비의 안쪽, 경사와 함께, 그들은 형성 한다 화산 모양의 원추형. 개방, 조리개, 문, 또는 operculum, 조리개를 형성 두 opercular 판으로 덮여 있다. 도토리 barnacles 일반적으로 있다 층;에 단단히 붙어 석 기저 판 그러나, 일부 종의 barnacles이 석 플레이트 (예를 들면, S. balanoides) 부족합니다. Barnacles 음울 안료 맨 틀 (등 딱지)에서 외 골격을 분 비. 두 계층 맨 틀의 외부 표면은 석 회 질 맨 틀의 안쪽 표면은 하지 석 회화 되며 따라서 유연 하면서 엄격한 될. 조리개, 내부는 cirri은 끌어 넣어진된 위치에 존재 한다. 이들은 흉부 부속 barnacles 정지 먹이 기를 위해 사용 하는. 난소는 testes soma에 거짓말을 하는 동안에 따개 비의 기지에 가깝습니다. 이 수치는 Panova 그 외 여러분 에서 채택 되었습니다. 21 스프링 거에서 허가 함께 게시 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg"> 그림 4 : 모 세관 젤 전기 이동 법에 의해 rRNA 무결성의 결정. RNA는 두 개의 서로 다른 균질 화 방법에 의해 준비 되었다: (A) 쥡니다 및 (B) 세라믹 구슬. 푸, y 축에 단위 형광 단위를 의미합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg"> 그림 5 : 유전자 발현에서 osmoregulation에 대 한 중요 한 유전자의 2 개의 다른 연구에서 결과 B. improvisus. (A)이이 패널 표시 차동 식 나+의 결합 이체의 정량에 의해 측정으로 /K+ ATPase NAK1 다양 한 salinities 및 pCO2 레벨3. 낮은 염 분 치료에 긴 isoform (NAK1 L)의 식 짧은 상대적인 증가 (ANOVA, P < 0.001). (B)이이 패널 B. improvisus 의 성인 다양 한 salinities2에 그들의 노출 동안 aquaporins의 식을 보여줍니다. 정량은 말라 상대적인 aquaporin 식 수준을 결정 하 사용 되었다. 성인 개인 14 일 동안 3 다른 salinities (3, 20, 및 33 PSU)에서 인 큐베이 팅 했다. RNA 준비에 대 한 소마, cirri, 및 성인의 분리 되었다. 두 인물에서 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. * *과 * * * 표시 레벨의 중요성 (ANOVA), 0.01, 0.001, 각각. 이러한 수치 린드 외 에서 수정 된 2 , 3. 두 인물 PLoS 하나에서 허가 함께 게시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>정착 단계</td>
			<td>RNA (ng)의 총 금액</td>
		</tr>
<tr>
<td>자유 수영</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>탐색: 주변 검색</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>연결 된 cyprid</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>새로 metamorphosed 청소년</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: RNA의 생산량. 이 표에서 RNA 준비 키트 20 cyprid 개인 합의 과정 중 여러 단계에서 수집 된의 풀에서 추출한 RNA 수량을 보여줍니다.

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The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

따개 비 (Amphibalanus) Balanus improvisus osmoregulation 및 antifouling 공부에 대 한 모델입니다. 그러나, 자연 계절 산란 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 여기, B. improvisus 의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 프로토콜 설명, 애벌레의 생산을 포함 합니다. 유전자 표현 연구에 교양된 barnacles의 사용을 보여 줍니다.

해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Research

JoVE Journal

Environment

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

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마이크로 포커스 X 선 CT (마이크로CT) 액티니아 에퀴나의 이미징 (Cnidaria), 하모토 sp. (안넬리다), 그리고 Xenoturbella 자포니카 (제나코엘로모파)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...