Name: a combinatorial single-cell approach to characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity of human stem and progenitor populations
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations at JoVE.com

هذا العمل معتمد من المنح المقدمة من الجمعية السويدية لمكافحة السرطان، ومجلس البحوث السويدية، المجتمع السويدي للأبحاث الطبية، ومؤسسة سرطان الطفولة السويدية، راغنار سودربيرغ المؤسسة، وكنوت ومؤسسة والنبرغ أليس

1-إعداد لوحات تحلل
<ol><li>استخدام مقعد مجاناً الحمض النووي الريبي/الحمض النووي، إعداد المخزن المؤقت تحلل ما يكفي للآبار 96، مع 10% إضافية، بخلط المياه مجاناً nuclease ميليلتر 390, ميليلتر 17% 10 NP-40، 2.8 دنتب ملم 10 ميليلتر، 10 ميليلتر 0.1 M DTT ومثبط رناسي ميليلتر 5.3 (انظر الجدول للمواد). دوامة وتدور ?...

<ol>
	<li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell:+Self-renewal+versus+differentiation.">Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).</li><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+An+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li><li>Ye, F., Huang, W., Guo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+hematopoiesis+using+single-cell+technologies.">Studying hematopoiesis using single-cell technologies.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10, 27 (2017).</li><li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research.">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).</li><li>Wills, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis+reveals+genetic+associations+masked+in+whole-tissue+experiments.">Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments.</a> Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).</li><li>Velten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+lineage+commitment+is+a+continuous+process.">Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process.</a> Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).</li><li>Wilson, N. K., Nicola, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+functional+and+gene+expression+analysis+resolves+heterogeneity+within+stem+cell+populations.">Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Single+RNA+Transcripts+in+Situ.">Visualization of Single RNA Transcripts in Situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Kalisky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+single-cell+transcriptomic+technologies.">A brief review of single-cell transcriptomic technologies.</a> Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).</li><li>Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+transcriptomics+and+beyond.">Spatially resolved transcriptomics and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).</li><li>Bengtsson, M., St&#229;hlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+single+cells+from+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+reveals+lognormal+distribution+of+mRNA+levels.">Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels.</a> Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).</li><li>Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., St&#229;hlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+in+single+cells+and+modelling+of+RT-qPCR+induced+noise.">Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise.</a> BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10, 1096 (2013).</li><li>Tung, P. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+effects+and+the+effective+design+of+single-cell+gene+expression+studies.">Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies.</a> Scientific Reports. 7, 39921 (2017).</li><li>Teles, J., Enver, T., Pina, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+PCR+profiling+of+gene+expression+in+hematopoiesis.">Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis.</a> Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).</li><li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+profiling+of+planarian+stem+cells+using+fluorescent+activated+cell+sorting+and+its+&amp;#34;index+sorting&amp;#34;+function+for+stem+cell+research.">Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its &amp;#34;index sorting&amp;#34; function for stem cell research.</a> Development, Growth, &amp; Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).</li><li>Lang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCExV:+A+webtool+for+the+analysis+and+visualisation+of+single+cell+qRT-PCR+data.">SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).</li><li>de Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+oncogene+is+translocated+to+the+Philadelphia+chromosome+in+chronic+myelocytic+leukaemia.">A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia.</a> Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).</li><li>. indexed-sorting Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting">https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting</a> (2016)</li><li>Warfvinge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+analysis+defines+therapy+response+and+immunophenotype+of+stem+cell+subpopulations+in+CML.">Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML.</a> Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Breton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+(DCs)+are+derived+from+distinct+circulating+precursors+that+are+precommitted+to+become+CD1c++or+CD141++DCs.">Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).</li><li>Alberti-Servera, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+developmental+heterogeneity+among+early+lymphoid+progenitors.">Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors.</a> The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).</li><li>Giustacchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+uncovers+distinct+molecular+signatures+of+stem+cells+in+chronic+myeloid+leukemia.">Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 692 (2017).</li><li>Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+interrelatedness+of+distinct+B-lineage+compartments+in+multiple+myeloma+bone+marrow.">Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow.</a> Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations.">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li></ol>

وفي السنوات الأخيرة، أصبح تحليل التعبير الجيني خلية واحدة إضافة قيمة لتعريف عدم تجانس السكان خلية مختلفة23. ظهور التكنولوجيات تسلسل الحمض النووي الريبي نظرياً يوفر إمكانية قياس الترنسكربيتوم كامل من خلية، لكن هذه الأساليب هي تعقدت الاختلافات في أعماق تسلسل خلية إلى خلية، وا...

ويعتقد كل خلية الدم الفردية الموجودة في التسلسل هرمي خلوية، حيث تشكل الخلايا الجذعية قمة على رأس مجموعة من التزام متزايد المتكفل الوسيطة التي تميز في نهاية المطاف الميؤوس من شفائهم في خلايا المستجيب النهائي تحمل محددة 1من الوظائف البيولوجية. الكثير من المعرفة حول كيفية تنظيم نظم الخلايا الجذعية تم إنشاؤها في نظام المكونة للدم، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى القدرة على عزل مستقبلي متميز السكان المكونة للدم العالي التخصيب للخلايا الجذعية أو فروعه المختلفة2 عن طريق فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. وقد أتاح للعديد من هؤلاء السكان يتم تحليلها وظيفيا أو جزيئيا، في الغالب من خلال التعبير الجيني التنميط3،4. ومع ذلك عندما تحليل التعبير الجيني لمعظم السكان الفروق الفردية بين الخلايا بلغ وفقدت5. وبالتالي، عدم القدرة على الكشف عن الاختلافات خلية إلى خلية داخل الخلية غير متجانسة الكسور قد إرباك فهمنا للعمليات البيولوجية الحرجة إذا كان حساب مجموعات فرعية صغيرة من الخلايا للوظيفة البيولوجية تم استنتاجه من أن السكان6، 7. على العكس من ذلك، التحقيق في التوقيعات التعبير الجيني في القرار خلية واحدة تتيح إمكانية تحديد عدم التجانس والالتفاف حول التأثيرات تحجب من مجموعات فرعية زائداً من الخلايا8.
وقد وضعت العديد من البروتوكولات لتحليل التعبير الجيني خلية واحدة حتى الآن؛ مع كل نهج وبعد التحذيرات الخاصة به. وكان الأسلوب أقرب الحمض النووي الريبي الفلورسنت في الموقع التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك)، الذي يقيس عدد محدود من النصوص في وقت واحد ولكن هي فريدة من نوعها حيث يسمح للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي ومسلم9،11. تطوير أساليب المبكر باستخدام PCR و qPCR للكشف عن واحدة أو نسخ قليلة جداً وكانت أيضا12. ومع ذلك، هذه في الآونة الأخيرة تم استبدال بالأساليب المستندة إلى ميكروفلويديكس التي يمكن تحليل التعبير عن مئات نصوص كل خلية في مئات خلايا عن طريق قبكر في أن واحد وتسمح بالتالي لاستخدام تحليل التباين العالي ثلاثي الأبعاد تحدد مسبقاً الجينات لوحات10،13. مؤخرا التكنولوجيات المستندة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي قد أصبحت تستخدم على نطاق واسع لتحليل خلية مفردة، هذه من الناحية النظرية يمكن أن قياس الترنسكربيتوم كامل من خلية وأضفى بعدا استكشافية إلى التغايرية تحليل10، 14. مولتيبليكسيد قبكر تحليل وتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة لها ملامح مختلفة، وبالتالي أن الأساس المنطقي لاستخدام أي من الأساليب يعتمد على السؤال فضلا عن العدد الخلايا في المجموعة السكانية المستهدفة. ومن المستصوب الفائق، وتكلفة منخفضة للخلية جنبا إلى جنب مع خصائص غير منحازة، واستكشافية لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة عندما يتم التحقيق في الخلية غير معروف أو إعداد كبيرة من السكان. ومع ذلك، هو أيضا منحازة تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة تسلسل النصوص وفرة عالية أكثر تواترا بينما النصوص مع وفرة منخفضة معرضة للانقطاع عن الدراسة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى البيانات المعقدة إلى حد كبير أن يضع مطالب عالية على تحليل بيوينفورماتيك للكشف عن الإشارات الجزيئية الهامة التي غالباً ما تكون خفية أو المخفية في الضوضاء التقنية15. وهكذا، للأنسجة تتميز جيدا، قبكر خلية واحدة باستخدام تحليل تحدد مسبقاً التمهيدي لوحات مختارة للجينات وظيفيا هاما أو الواسمات الجزيئية بمثابة نهج حساسية واضحة لتحديد عدم تجانس السكان. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المقارنة للحمض النووي الريبي خلية واحدة-seq، تكلفة كل خلية أعلى بصفة عامة لأساليب qPCR خلية واحدة. وهنا يصف لنا نهجاً يجمع بين خلية واحدة RT-قبكر (تعديل من تيليس J. et al. 16)، إلى فهرس نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز17 والمعلوماتية الحيوية التحليل18 من أجل في نفس الوقت تميز التغايرية الجزيئية وإيمونوفينوتيبيك ضمن السكان.
في هذا النهج، هو الملون السكان خلية للفائدة، وخلايا مفردة يتم فرزها حسب الأصول مباشرة إلى المخزن المؤقت لتحلل في لوحات بكر 96-جيدا. في نفس الوقت، يتم تسجيل مستويات التعبير من مجموعة إضافية من علامات سطح الخلية لكل خلية واحدة خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز، أسلوب الذي يشار إليه كفهرس الفرز. بعد ذلك يتم تضخيمه بتفكيك خلية المواد وتحليل التعبير الجيني لمجموعة مختارة من الجينات مع RT-قبكر، باستخدام منصة موائع جزيئية. تمكن هذه الاستراتيجية التحليل الجزيئي لتوصيف خلية واحدة فضلا عن تزامن مفروزة التعبير علامة الخلية-سطح كل خلية فردية. عن طريق تعيين مجموعات فرعية متميزة جزيئيا من الخلايا مباشرة للتعبير عن علامات مفروزة المفهرسة، يمكن ربطها الفئات السكانية الفرعية إيمونوفينوتيبي محددة التي يمكن استخدامها لعزلتها المحتملين. ويرد الأسلوب خطوة بخطوة في الشكل 1. لوحة جينات محددة سلفا كما يسهم في دقة أعلى تعبير الجينات المستهدفة، حيث أنها تلتف القياس غير ذي صلة الجينات الوفيرة التي يمكن لولا ذلك أوككلودي إشارات التعبير الجيني خفية. وعلاوة على ذلك، يسمح التضخيم مستهدفة محددة، خطوة واحدة النسخ العكسي، وتضخيم لقياس قوة النصوص أعرب منخفضة، مثل عوامل النسخ أو الكشف غير بولي-أدينيلاتيد. الأهم من ذلك، تسمح أساليب qPCR لقياس مرناً من البروتينات الانصهار، ومهمة عند التحقيق في بعض الأمراض الخبيثة19. وأخيراً، التحقيق تركز عدد الجينات، انخفاض معدلات التسرب، والاختلافات التقنية المحدودة بين جعل الخلايا بسهولة تحليل هذا الأسلوب مقارنة بالأساليب الأبعاد أعلى، مثل الحمض النووي الريبي خلية واحدة-ما يليها باتباع البروتوكول، يمكن إجراء تجربة كاملة، من فرز الخلايا لتحليل النتائج، في غضون ثلاثة أيام، مما يجعل هذا طريقة غير معقدة وسريعة لتحليل التعبير الجيني وحيدة الخلية الحساسة، والفائق.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD14 PECY5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0149-42</td>
			<td>Clone: 61D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302010</td>
			<td>Clone: 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304608</td>
			<td>Clone: MEM-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302210</td>
			<td>Clone: HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD2 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300210</td>
			<td>Clone: RPA-2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300310</td>
			<td>Clone: HIT3a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>306008</td>
			<td>Clone: 6H6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235A PECY5</td>
			<td>BD Pharma</td>
			<td>559944</td>
			<td>Clone GAR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343604</td>
			<td>Clone: 561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303510</td>
			<td>Clone: Hit2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Clone: 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA BV421</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>560362</td>
			<td>Clone: HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f Pecy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0495-82</td>
			<td>Clone: eBioGOH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well u-bottom Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFEM</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorph tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CST beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>642412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accudrop Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>345249</td>
			<td>6-&#181;m particles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film Clear</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film Foil</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>AB-0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96M2-HS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 1.5 mL tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP40</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP</td>
			<td>Takara</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsout</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777-019</td>
			<td>RNAse inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuclease free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Reaction Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeno RNA Control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Sample/Loading Kit&#8212;10 IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M10-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X GE Sample Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control line fluid&#160;</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark HD</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMKHD-BMKHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M10-96.96GT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm real time PCR analysis</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179a.VPREB1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00356766_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174179_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00169233_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCR_ABL.52</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03043652_ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCR_ABL41</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03024541_ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00995536_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00996788_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNB1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01030099_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNB2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01084593_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNC</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01029304_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNE1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01026535_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171049_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR9</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01890924_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD10.MME</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00153510_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11a</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00158218_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c.ITAX</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174217_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123.IL3RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00608141_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133.PROM1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01009250_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD151</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00911635_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD220.INSR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00961554_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24.HSA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03044178_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCOR1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01094540_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26.DPP4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175210_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD274</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01125301_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD276</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00987207_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD32.FCGR2B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01634996_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD33</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01076281_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00990732_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD344.FZD4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00201853_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD352.SLAMF6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01559920_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01120071_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01058407_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41.ITGA2B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01116228_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f.ITGA6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01041011_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56.NCAM1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00941830_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00233521_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD97</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00173542_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD99</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00908458_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01026371_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1A</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00355782_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01597588_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1C</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175938_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEBPa</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00269972_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF1r</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00911250_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF2RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00531296_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF3RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01114427_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2A.TCF3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00413032_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBF1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01092694_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00923996_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00959427_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01554629_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00956711_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174690_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXO1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01054576_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02758991_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231112_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231119_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231122_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00382207_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HES1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01118947_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171406_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMGA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171569_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOXA5</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00430330_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOXB4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00256884_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ID2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs04187239_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF2BP1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00198023_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF2BP2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01118009_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKZF1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00172991_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL1RAP</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00895050_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL2RG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00953624_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRF8</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175238_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITGB7</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01565750_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174029_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lin28B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01013729_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00153473_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYL1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01089802_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meis1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01017441_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKi67</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01032443_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPL</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00180489_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPO</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00924296_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFIB</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01029175_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01062011_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02621230_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAG2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01851142_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPS18</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01375212_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shisa2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01590823_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spi1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02786711_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile.IgH</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00378435_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01097987_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00264235_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tim.3.HAVCR2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00958618_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00169795_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a combinatorial single-cell approach to characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity of human stem and progenitor populations

قد استخدمت منذ فترة طويلة إيمونوفينوتيبيك الوصف والتحليل الجزيئي تحدد عدم التجانس وتعريف السكان خلية متميزة. نظام مراقبة الأصول الميدانية أصلاً مقايسة خلية واحدة، لكن السابقة للتحليل الجزيئي، الخلايا الهدف غالباً مستقبلي معزولة بكميات كبيرة، وبالتالي فقدان القرار خلية واحدة. تحليل التعبير الجيني خلية واحدة يوفر وسيلة لفهم الاختلافات الجزيئية بين خلايا فردية في الخلية غير المتجانسة السكان. في جل خلية تحليل النتائج التمثيل المفرط لنوع الخلية متميزة في التحيزات وانسداد إشارات من خلايا نادرة مع الأهمية البيولوجية. باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز الفهرس بالإضافة إلى تحليل التعبير الجيني خلية واحدة، يمكن التحقيق السكان دون فقدان القرار خلية واحدة بينما هي أيضا القبض على الخلايا مع الخلايا الوسيطة التعبير علامة السطحية، مما يتيح تقييم أهمية التعبير علامة السطحية المستمرة. هنا، يمكننا وصف نهج يجمع بين النسخ العكسي خلية واحدة الكمي PCR (RT-qPCR) ونظام مراقبة الأصول الميدانية فهرس الفرز في نفس الوقت تميز الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك داخل الخلية السكان.
على النقيض من أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، يتيح استخدام qPCR مع التضخيم مستهدفة محددة لقياسات قوية منخفضة-وفرة النصوص مع عدد المنقطعين عن الدراسة، في حين أنه هو مرتبك لا بالقضايا المتصلة بخلية إلى الاختلافات في القراءة العمق. وعلاوة على ذلك، قبل مباشرة خلايا مفردة الفرز الفهرس إلى تفسخ المخزن المؤقت هذا الأسلوب، يسمح لتوليف كدنا ومستهدفة محددة قبل التضخيم تتم في خطوة واحدة، وكذلك فيما يتعلق بارتباط التوقيعات الجزيئية المشتقة في وقت لاحق مع سطح الخلية علامة التعبير. قد وضعت هذا النهج المبين للتحقيق واحد-الخلايا المكونة للدم، ولكن أيضا قد استخدمت بنجاح في أنواع الخلايا الأخرى.
وفي الختام، يسمح النهج المبينة في هذا التقرير لقياس حساسية التعبير مرناً للوحة من جينات محددة مسبقاً مع إمكانية وضع بروتوكولات لعزل المحتملين اللاحقة للفئات السكانية الفرعية جزيئيا متميزة.

بروتوكول وصف سريعة، وتنفيذه بسهولة وموثوق بها للغاية. ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن الإعداد التجريبية. يمكن تنفيذ البروتوكول كاملة، من الفرز من خلايا مفردة، إلى التضخيم مستهدفة محددة، وقياسات التعبير الجيني وتحليل أولى في غضون ثلاثة أيام. مثال على تحليل ال...

Watch this Scientific Journal Video about A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations at JoVE.com

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

معظم الجينات التعبير القياسات سحابة خلية فردية الاختلافات في الخلية غير المتجانسة السكان. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تحليل التعبير الجيني كيف خلية واحدة وفهرس الفرز بالتنوير تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ويمكن الجمع بين تحديد عدم التجانس وإيمونوفينوتيبيكالي تميز سكان الخلية جزيئيا متميزة.

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الخلايا الجذعية ومجالات السرطان مثل ما يبدو عليه عدم تجانس الخلايا الجذعية وكيف يمكن عزل العلاج في الخلايا السرطانية الحساسة. والميزة الرئيسية لهذه الدراسة هي أنها تجمع بين تحليل قوي تقنياً للتعبير الجيني أحادي الخلية جنباً إلى جنب مع vaccinosis لتوصيف آخر للمصب للسكان الفرعيين المستهدفين. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن استخدامها للتحقيق في السرطان وعدم تجانس الخلايا الجذعية، إلا أنها يمكن أن تعطي أيضًا رؤى حول إمكانية الفدائية الجينية والنسل.لبدء البروتوكول، على مقاعد البدلاء RNA / الحمض النووي خالية، إعداد ما يكفي من عازلة تحلل ل96 آبار مع 10٪ اضافية عن طريق خلط 390 microliters نواة المياه الحرة، 17 ميكرولترات من 10٪NP-40، 2.8 ميكرولتررس 10 مللي دينوب، 10 ميكرولتررز 0.1 د تى الضرس، و 5.3 ميكرولترات RNAse المانع. دوامة وتدور أسفل الأنبوب. المقبل، وتوزيع أربعة microliters من عازلة تحلل إلى كل بئر من لوحة PCR 96 جيدا وختم لوحات مع فيلم لاصق.تدور أسفل لوحات لجمع السائل في الجزء السفلي. إبقاء لوحات على الجليد حتى فرز الخلايا لمدة أقصاها 24 ساعة. مرة واحدة وقد تم إعداد الجهاز FACS بشكل صحيح، تنفيذ إعادة تحليل السكان المستهدفين عن طريق فرز ما لا يقل عن 100 الخلايا المستهدفة في أنبوب جديد microcentrifuge مع 100 ميكرولترات من العازلة وصمة عار.FACS تحليل الخلايا التي تم فرزها عن طريق تسجيل العينة مفروزة والتأكد من أنها في نهاية المطاف في بوابة الفرز. ثم قم بإعداد فرز لوحة أحادية الخلية عن طريق تمركز الانخفاض في A1 بشكل جيد في لوحة 96-well. عندما يكون محورها، فرز 50 إلى 106 جزيئات ميكرومتر في جميع الآبار حول حافة لوحة فارغة 96-جيدا لضمان أن جميع الآبار سوف تحصل على خلية في وسط كل بئر.إزالة الفيلم لاصق من لوحات. فرز خلية واحدة من لين CD34 زائد خلايا ناقص CD38 في 92 من أصل 96 آبار. قم بتنشيط فرز الفهرس في برنامج فرز FACS لحفظ ملف تعريف مناعي للنوعية لـ CD45RA و CD49F و CD90 لكل خلية مفردة.فرز بئرين مع 10 و 20 خلية على التوالي لعناصر التحكم الخطية في تضخيم PCR. وعادة ما تستخدم WELLS H1 وH2. احتفظ باثنين من الآبار دون أي خلايا حيث لا يوجد عناصر تحكم في القالب ، وعادة ما تآبار H3 و H4. ختم لوحات مع فيلم لاصق واضح وتدور لوحات في 300 مرة الجاذبية لمدة دقيقة واحدة.المفاجئة تجميد لوحات على الجليد الجاف. ثم تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. جعل النسخ العكسي ومزيج التضخيم الهدف محددة عن طريق إضافة 632.5 ميكرولترات من مزيج رد فعل مرتين، 101.2 microliters Taq/SuperscriptIII، 151.8 microliters مزيج التمهيدي، و 0.7 microliters ارتفعت في السيطرة RNA.دوامة الحل وتدور عليه لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. الحفاظ على مزيج على الجليد حتى يكون جاهزا لإضافتها إلى العينة. بعد ذلك، ذوبان لوحات lysate على الجليد.إضافة 8.75 ميكرولترات من النسخ العكسي المعدة من قبل ومزيج التضخيم المستهدف المحدد إلى 92 بئرًا ، بما في ذلك الضوابط الخطية وعدم وجود قوالب. إضافة 8.75 ميكرولترات من عدم وجود مزيج التحكم النسخ العكسي إلى الآبار الأربعة المتبقية. ثم ختم لوحات مع فيلم لاصق واضح وتدور لوحات لجمع السائل في الجزء السفلي.تنفيذ النسخ العكسي والتضخيم الهدف محددة عن طريق تشغيل لوحة في جهاز PCR وفقا لبرنامج preamp. إعداد لوحة تحميل assay عن طريق الأنابيب ثلاثة microliters من مُعَشف تحميل المقايسة إلى كل بئر من لوحة 96-well. إضافة ثلاثة microliters من كل التمهيدي إلى الآبار الفردية في لوحة تحميل المقايسة.ختم لوحة مع فيلم لاصق وتدور عليه. بعد الغزل لوحة، وإعداد لوحة التخفيف عن طريق الأنابيب ثمانية ميكروليتر من المياه الحرة النوى في جميع الآبار من لوحة 96 جيدا. إضافة اثنين microliters من عينة تضخيمها إلى لوحة التخفيف.ختم لوحة مع فيلم لاصق. مزيج من خلال دوامة لوحة لمدة 10 ثانية. ثم تدور أسفل لوحة.المقبل، وإعداد مزيج تحميل العينة عن طريق خلط بعناية 352 ميكرولترات من مزيج رئيسي مع 35.2 ميكرولترات من كاشف تحميل العينة. إعداد لوحة تحميل العينة عن طريق الاقتباس 3.3 ميكرولترات من مزيج التحميل إلى كل بئر من لوحة 96-well. إضافة 2.7 ميكرولترات من العينة المخففة في كل بئر من لوحة تحميل العينة.ختم لوحة مع فيلم لاصق وتدور عليه. إخراج رقاقة جديدة 96 من قبل 96 microfluidic. إعداد المداخل عن طريق بدس لهم مع حقنة مع قبعة على للتأكد من أنه يمكن نقلها.إضافة حجم كامل من المحاقن إلى كل صمام في حين إمالة رقاقة إلى 45 درجة والضغط على صمام أسفل. رئيس رقاقة مع وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية. تحميل كل مدخل مقايسة مع 4.25 ميكرولترات من كل من الآبار في لوحة تحميل المقايسة وتجنب فقاعات.إذا ظهرت الفقاعات في البئر، قم بإزالتها بطرف ماصة. مواصلة تحميل كل مدخل عينة مع 4.25 ميكرولترات من كل من الآبار في لوحة تحميل العينة، وتجنب فقاعات، وإذا ظهرت فقاعات إزالتها مع طرف ماصة. قم بتحميل الشريحة باستخدام وحدة تحكم الدائرة المتكاملة لـ Fluidics أو وحدة تحكم IFC.تحقق من أن الرقاقة تبدو حتى وأن جميع الغرف قد تم تحميلها. إزالة الغبار من سطح رقاقة عن طريق لمسها مع الشريط. وأخيرا، تشغيل رقاقة في تعدد microfluidic منصة التعبير الجيني.خريطة الحرارة من تشغيل ناجحة يعرض التعبير انتشار بالتساوي عبر العينات مع إشارة قوية من حوالي سبعة إلى 25 CTs. هذا منحنى التضخيم من ارتفعت في RNA السيطرة يتحقق من أن جميع الآبار لديها تعبير واضح عن حوالي 10 CT مع القليل من الاختلاف أو أي اختلاف، والتحقق من أن ردود الفعل قبل التضخيم وqPCR كانت ناجحة لجميع الخلايا. يمكن أن يكون تحليل المكون المبدئي أو PCA الذي يتصور أوجه التشابه بين مجموعات الخلايا باستخدام تقليل البعد مفيدًا لتمييز مجموعات الخلايا المتميزة جزيئًا عن بعضها البعض هنا لتحديد أربع مجموعات فرعية.لتحديد النمط المناعي للخلايا من مجموعات جزيئية مختلفة، قم بتحميل ملف FCS الفهرس في FlowJo. افتح محرر البرنامج النصي ولصق البرنامج النصي الفهرس، اضغط تشغيل. كل خلية ستكون الآن في بوابة منفصلة.إضافة كل خلية إلى محرر تخطيط ولونها وفقا لتجميع جزيئية المعرفة من SCXV المتاحة في ملف sample_complete_data.xls. تُظهر مخططات FACS تعبير علامة سطح الخلية لعلامات الخلايا الجذعية العاملة في الدم CD90 و CD45RA التي يمكن استخدامها للتمييز بين المجموعات وعزلها للتحليل الوظيفي. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ تقنية أخرى مثل تسلسل الحمض النووي الريبي من الأجناس الفرعية المكتشفة حديثا أو في المختبر وفي التجارب الحية للإجابة على سؤال إضافي مثل ما هي الآلية الجزيئية التي تسبب هذا التغاير وكيف تختلف السكان الفرعية وظيفيا.وقد مهدت هذه الاستراتيجية الطريق للباحثين ليس فقط للتحقيق في التغايرية في الدم العادي والخبيث، ولكن يمكن استخدامها أيضًا لعزل السكان الفرعيين المكتشفين بشكل مستقبلي لمواصلة دراستها.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

وحيدة الخلية التعبير الجيني عن طريق المتعددة RT-QPCR لتوصيف عدم التجانس من السكان اللمفاوية نادر

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

تحديد معدلات تسوس نسخة على نطاق الجينوم في الخلايا الليفية البشرية المتكاثرة وهادئة

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

إعداد وتعديل الجينات الرئيسيات نونومان الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...