Name: a combinatorial single-cell approach to characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity of human stem and progenitor populations
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations at JoVE.com

עבודה זו נתמכת מענקים השוודית החברה לסרטן, המועצה למחקר השבדי, החברה השוודית למחקר רפואי, קרן סרטן ילדות שוודית, קרן Söderberg רגנר, ו קנוט, אליס ולנברג קרן

1. הכנת פירוק לוחות
<ol><li>באמצעות ספסל חינם RNA/DNA, להכין מאגר מספיק פירוק וולס 96, עם 10% נוספים, על ידי ערבוב מים חינם נוקלאז µL 390, 17 µL של 10% NP-40, 2.8 dNTP 10 מ מ µL, µL 10 0.1 M DTT, 5.3 µL RNAse מעכב (ראה טבלה של חומרים). מערבולת, ספין מטה.</li>
	<li>פזר µL 4 פירוק המאגר כדי כל טוב של צלחת PCR טוב 96, לאטום את הצלחות עם ...

<ol>
	<li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell:+Self-renewal+versus+differentiation.">Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).</li><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+An+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li><li>Ye, F., Huang, W., Guo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+hematopoiesis+using+single-cell+technologies.">Studying hematopoiesis using single-cell technologies.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10, 27 (2017).</li><li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research.">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).</li><li>Wills, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis+reveals+genetic+associations+masked+in+whole-tissue+experiments.">Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments.</a> Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).</li><li>Velten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+lineage+commitment+is+a+continuous+process.">Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process.</a> Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).</li><li>Wilson, N. K., Nicola, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+functional+and+gene+expression+analysis+resolves+heterogeneity+within+stem+cell+populations.">Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Single+RNA+Transcripts+in+Situ.">Visualization of Single RNA Transcripts in Situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Kalisky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+single-cell+transcriptomic+technologies.">A brief review of single-cell transcriptomic technologies.</a> Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).</li><li>Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+transcriptomics+and+beyond.">Spatially resolved transcriptomics and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).</li><li>Bengtsson, M., St&#229;hlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+single+cells+from+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+reveals+lognormal+distribution+of+mRNA+levels.">Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels.</a> Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).</li><li>Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., St&#229;hlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+in+single+cells+and+modelling+of+RT-qPCR+induced+noise.">Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise.</a> BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells.">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10, 1096 (2013).</li><li>Tung, P. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+effects+and+the+effective+design+of+single-cell+gene+expression+studies.">Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies.</a> Scientific Reports. 7, 39921 (2017).</li><li>Teles, J., Enver, T., Pina, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+PCR+profiling+of+gene+expression+in+hematopoiesis.">Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis.</a> Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).</li><li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+profiling+of+planarian+stem+cells+using+fluorescent+activated+cell+sorting+and+its+&amp;#34;index+sorting&amp;#34;+function+for+stem+cell+research.">Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its &amp;#34;index sorting&amp;#34; function for stem cell research.</a> Development, Growth, &amp; Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).</li><li>Lang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCExV:+A+webtool+for+the+analysis+and+visualisation+of+single+cell+qRT-PCR+data.">SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).</li><li>de Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+oncogene+is+translocated+to+the+Philadelphia+chromosome+in+chronic+myelocytic+leukaemia.">A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia.</a> Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).</li><li>. indexed-sorting Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting">https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting</a> (2016)</li><li>Warfvinge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+analysis+defines+therapy+response+and+immunophenotype+of+stem+cell+subpopulations+in+CML.">Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML.</a> Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Breton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+(DCs)+are+derived+from+distinct+circulating+precursors+that+are+precommitted+to+become+CD1c++or+CD141++DCs.">Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).</li><li>Alberti-Servera, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+developmental+heterogeneity+among+early+lymphoid+progenitors.">Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors.</a> The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).</li><li>Giustacchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+uncovers+distinct+molecular+signatures+of+stem+cells+in+chronic+myeloid+leukemia.">Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 692 (2017).</li><li>Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+interrelatedness+of+distinct+B-lineage+compartments+in+multiple+myeloma+bone+marrow.">Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow.</a> Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations.">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li></ol>

בשנים האחרונות, תא בודד מפענוח הביטוי הפך תוספת רבת ערך כדי להגדיר את הטרוגניות של אוכלוסיות שונות תא23. כניסתו של טכנולוגיות רצף הרנ א תיאורטית מספק אפשרות למדוד את transcriptome שלם של תא, עם זאת, שיטות אלה הן מסובך וריאציות של רצף לתא לבין נשירה. QPCR תא בודד מציע ניתוח רגיש, איתנה של ה...

כל תא דם בודדים הוא האמין להתגורר בהיררכיה של הסלולר, שבו תאי גזע טופס השיא על סדרת מחויב יותר ויותר אבות ביניים, כי בסופו של דבר סופני להבדיל לתוך התאים אפקטור הסופי נושא ספציפי תפקודים ביולוגיים1. רוב הידע על איך תא גזע מערכות מאורגנות נוצר במערכת hematopoietic, בעיקר בגלל היכולת לבודד פרוספקטיבי אוכלוסיות hematopoietic ברורים מאוד מועשר בתאי גזע או אבות שונים2 על-ידי מיון FACS. זו אפשרה עבור רבים של אוכלוסיות אלה כדי להיות מנותח באופן פונקציונלי או מולקולרי, בעיקר דרך ביטוי גנים פרופילים3,4. אולם כאשר ניתוח ביטוי גנים של צובר אוכלוסיות הבדלים אינדיבידואליים בין התאים שהגוף, איבדתי5. לפיכך, חוסר היכולת לזהות וריאציות לתא בתוך התא הטרוגנית שברים עשויים לבלבל את ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים קריטי אם קבוצות משנה קטנה של תאים חשבון עבור הפונקציה הנגזרת הביולוגי של האוכלוסייה הזאת6, 7. לעומת זאת, החקירה של ג'ין חתימות ביטוי ברזולוציה תא בודד מציעים אפשרות ניסחו הטרוגניות, לעקוף מאפילה השפעות של קבוצות משנה overrepresented של תאים8.
עד כה פותחו פרוטוקולים רבים לניתוח ביטוי גנים מתא בודד; עם כל גישה יש אזהרות משלו. השיטה המוקדמת ביותר היה RNA פלורסנט בחיי עיר הכלאה (RNA-דג), אשר מודד את מספר מוגבל של הפרוטוקולים בכל פעם אבל הוא ייחודי בכך שהוא מאפשר לחקירה של RNA לוקליזציה9,11. שיטות מוקדמות באמצעות PCR qPCR כדי לזהות שיחיד או תעתיקים מעטים מאוד היו גם פיתח12. עם זאת, אלה לאחרונה הוחלפו על-ידי שיטות מבוססות מיקרופלואידיקה אשר ניתן בו זמנית לנתח את הביטוי של מאות תעתיקים בכל תא מאות תאים דרך qPCR, ובכך לאפשר הטרוגניות גבוהה-ממדי באמצעות ניתוח מראש נקבע ג'ין לוחות10,13. לאחרונה טכנולוגיות מבוססות רצפי RNA יש להיות בשימוש נרחב עבור ניתוח תא בודד, ככל אלה תיאורטית יכול למדוד את כל transcriptome של התא ובכך להוסיף מימד גישוש הטרוגניות ניתוח10, 14. ניתוח qPCR Multiplexed ורצף RNA בתא יחיד יש תכונות שונות, ובכך הרציונל לשימוש באחת מהשיטות תלוי השאלה כמו גם מספר התאים באוכלוסיית היעד. תפוקה גבוהה ועלות נמוכה בכל תא יחד עם מאפיינים לא משוחד, גישוש של רצפי RNA בתא יחיד בעת רצוי התא לא ידוע או אוכלוסיות גדולות נחקרות. עם זאת, רצפי RNA בתא יחיד גם מוטה לטובת קביעת רצף תעתיקים שופע גבוהה בתדירות גבוהה יותר, בעוד תעתיקים עם שפע נמוכה נוטים נשירה. זה יכול להוביל נתונים מורכבים במידה ניכרת שמעבירות גבוהה-דרישות על ניתוח bioinformatic לגלות אותות מולקולריים חשוב כי הם לעיתים קרובות עדינים או מוסתרים רעש טכני15. לכן, בשביל לרקמות מאופיין היטב, qPCR תא בודד באמצעות ניתוח שנקבע מראש לוחות פריימר שנבחר עבור גנים חשיבות תפקודית או סמנים מולקולריים יכול לשמש גישה רגיש פשוטה כדי לקבוע את הטרוגניות של אוכלוסייה. עם זאת, יצוין כי לעומת העלות לכל תא RNA בתא יחיד-seq, הוא בדרך כלל גבוה יותר עבור שיטות qPCR תא בודד. כאן, אנו מתארים גישה המשלבת תא בודד RT-qPCR (שונה Teles ג'יי. et al. 16), לאינדקס FACS מיון במקביל17 ו ביואינפורמטיקה ניתוח18 על מנת לאפיין את הטרוגניות המולקולריים immunophenotypic בתוך אוכלוסיות.
בגישה זו, האוכלוסייה תא עניין היא מוכתמת, חד-תאים ממוינים על-ידי FACS ישירות לתוך מאגר פירוק ב 96-ובכן PCR צלחות. בו זמנית, רמות הביטוי של קבוצה נוספת של התא-פני סמני נרשמים לכל תא יחיד במהלך FACS-מיון, שיטה שבה מתייחסים כאל מיון אינדקס. החומר תא lysed לאחר מכן מוגבר וניתח בביטוי הגן של קבוצת גנים שנבחרו עם RT-qPCR, באמצעות פלטפורמה microfluidic. אסטרטגיה זו מאפשרת ניתוח מולקולרית של מיון מתא בודד, כמו גם בו זמנית האפיון תא-פני סמן ביטוי של תא בודד כל. על-ידי ישירות מיפוי מולקולרי ייחודי קבוצות משנה של תאים לביטוי סמני אינדקס ממוינים, subpopulations יכולים להיות מקושרים כדי immunophenotype ספציפי שיכול לשמש לבידוד פוטנציאליים שלהם. השיטה המותווה צעד אחר צעד באיור1. פאנל ג'ין שנקבע מראש עוד תורמת רזולוציה גבוהה יותר של ביטוי גנים יישוב, מאז זה עוקף מדידה של הגנים שופע לא רלוונטי יכול אחרת occlude אותות ביטוי הגן מעודן. יתר על כן, הגברה יעד ספציפיות, שעתוק במהופך צעד אחד, הגברה מאפשרת מדידה חזקים של תעתיקים ביטוי נמוך, כמו גורמי שעתוק או הלא-פולי-adenylated RNAs. חשוב לציין, שיטות qPCR מאפשרים מדידה של mRNA של פיוז'ן חלבונים, אשר חשובים כאשר חוקרים מסוימים במחלות ממאירות19. בסופו של דבר, המספר ממוקד של גנים חקרו, שיעורי הנשירה נמוך, ולא מוגבל הבדלים טכניים בין תאים להפוך שיטה זו נותחו בקלות לעומת שיטות מימד גבוה יותר, כגון RNA בתא יחיד-תת סעיף לפי הפרוטוקול, ניסוי כולו יכול להתבצע, מיון תאי לתוצאות שנותחה, בתוך שלושה ימים, ממציא זה שיטה מסובכת ומהיר עבור ניתוח ביטוי גנטי תא בודד רגיש, תפוקה גבוהה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD14 PECY5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0149-42</td>
			<td>Clone: 61D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302010</td>
			<td>Clone: 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304608</td>
			<td>Clone: MEM-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302210</td>
			<td>Clone: HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD2 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300210</td>
			<td>Clone: RPA-2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300310</td>
			<td>Clone: HIT3a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>306008</td>
			<td>Clone: 6H6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235A PECY5</td>
			<td>BD Pharma</td>
			<td>559944</td>
			<td>Clone GAR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343604</td>
			<td>Clone: 561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303510</td>
			<td>Clone: Hit2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Clone: 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA BV421</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>560362</td>
			<td>Clone: HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f Pecy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0495-82</td>
			<td>Clone: eBioGOH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well u-bottom Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFEM</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorph tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CST beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>642412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accudrop Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>345249</td>
			<td>6-&#181;m particles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film Clear</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film Foil</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>AB-0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96M2-HS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 1.5 mL tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP40</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP</td>
			<td>Takara</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsout</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777-019</td>
			<td>RNAse inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuclease free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Reaction Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeno RNA Control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Sample/Loading Kit&#8212;10 IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M10-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X GE Sample Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control line fluid&#160;</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark HD</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMKHD-BMKHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M10-96.96GT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm real time PCR analysis</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179a.VPREB1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00356766_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174179_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00169233_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCR_ABL.52</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03043652_ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCR_ABL41</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03024541_ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00995536_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00996788_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNB1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01030099_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNB2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01084593_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNC</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01029304_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNE1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01026535_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171049_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR9</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01890924_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD10.MME</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00153510_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11a</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00158218_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c.ITAX</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174217_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123.IL3RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00608141_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133.PROM1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01009250_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD151</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00911635_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD220.INSR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00961554_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24.HSA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03044178_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCOR1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01094540_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26.DPP4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175210_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD274</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01125301_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD276</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00987207_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD32.FCGR2B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01634996_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD33</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01076281_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00990732_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD344.FZD4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00201853_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD352.SLAMF6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01559920_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01120071_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01058407_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41.ITGA2B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01116228_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f.ITGA6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01041011_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56.NCAM1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00941830_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00233521_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD97</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00173542_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD99</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00908458_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01026371_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1A</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00355782_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01597588_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1C</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175938_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEBPa</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00269972_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF1r</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00911250_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF2RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00531296_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF3RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01114427_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2A.TCF3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00413032_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBF1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01092694_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00923996_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00959427_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01554629_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00956711_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174690_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXO1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01054576_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02758991_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231112_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231119_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231122_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00382207_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HES1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01118947_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171406_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMGA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171569_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOXA5</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00430330_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOXB4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00256884_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ID2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs04187239_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF2BP1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00198023_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF2BP2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01118009_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKZF1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00172991_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL1RAP</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00895050_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL2RG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00953624_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRF8</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175238_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITGB7</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01565750_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174029_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lin28B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01013729_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00153473_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYL1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01089802_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meis1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01017441_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKi67</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01032443_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPL</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00180489_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPO</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00924296_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFIB</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01029175_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01062011_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02621230_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAG2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01851142_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPS18</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01375212_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shisa2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01590823_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spi1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02786711_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile.IgH</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00378435_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01097987_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00264235_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tim.3.HAVCR2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00958618_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00169795_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a combinatorial single-cell approach to characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity of human stem and progenitor populations

Immunophenotypic אפיון וניתוח מולקולרית זמן רב השתמשו ניסחו הטרוגניות ולהגדיר אוכלוסיות תאים נפרדים. FACS הוא מיסודו assay מתא בודד, אולם לפני ניתוח מולקולרית, תאי היעד מבודדים לעיתים קרובות פרוספקטיבי בצובר, ובכך לאבד רזולוציה תא בודד. תא בודד מפענוח ביטוי מספק אמצעים כדי להבין את ההבדלים מולקולרי בין תאים בודדים באוכלוסיות הטרוגניות תא. בניתוח תא בכמות גדולה overrepresentation מסוג תאים נפרדים התוצאה הטיות occlusions של אותות מתאי נדיר עם חשיבות ביולוגית. על ידי ניצול FACS אינדקס מיון מצמידים ניתוח ביטוי גנטי מתא בודד, אוכלוסיות יכול ייחקרו ללא האובדן של תא בודד רזולוציה בזמן תאים עם ביטוי סמן משטח תאים ביניים גם נלכדים, המאפשרת הערכת הרלוונטיות של הביטוי סמן משטח רציף. כאן, אנו מתארים גישה המשלבת שעתוק במהופך תא בודד PCR (RT-qPCR) וסטטיסטי FACS אינדקס מיון במקביל לאפיין את מולקולרית והטרוגניות immunophenotypic בתוך התא אוכלוסיות.
לעומת שיטות רצף של RNA מתא בודד, השימוש qPCR עם הגברה ביעד מסוים מאפשר למדידות חזקים של הפרוטוקולים נמוך-שפע עם פחות תקלות, בזמן זה הוא לא מבולבל על ידי נושאים הקשורים לתא וריאציות בלקריאה עומק. יתר על כן, על-ידי ישירות מיון אינדקס חד-תאים לתוך פירוק מאגר בשיטה זו, מאפשר cDNA סינתזה הגברה קדם ביעד מסוים שיש לבצע צעד גם לגבי המתאם של חתימות מולקולרית נגזר לאחר מכן עם משטח תא סמן ביטוי. הגישה המתוארת פותחה כדי לחקור hematopoietic חד-תאים, אך גם שימשו בהצלחה על סוגי תאים אחרים.
לסיכום, הגישה המתוארים בזאת מאפשרת מדידה רגיש של mRNA הביטוי של הגנים שנבחרו מראש עם האפשרות על פאנל לפתח פרוטוקולים עבור בידוד פוטנציאליים עוקבות של subpopulations מולקולרי ייחודי.

פרוטוקול המתואר הוא מהיר, שבוצעו בקלות ואמינים ביותר. סקירה כללית של הסידור ניסיוני מוצג באיור1. פרוטוקול כולו, ממיון של חד-תאים, הגברה יעד ספציפיות, מדידות ביטוי גנים, ניתוח ראשוני יכול להתבצע בשלושה ימים. דוגמה של תוצאות שנותחה בדמות מפת החום מייצג ראשונ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations at JoVE.com

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בשדות תאי גזע וסרטן כגון איך נראית הטרוגניות של תאי גזע וכיצד ניתן לבודד טיפול בתאי סרטן רגישים. היתרון העיקרי של מחקר זה הוא שהוא משלב ניתוח ביטוי גנים חד-תאי חזק מבחינה טכנית יחד עם חיסון לאפיון במורד הזרם של תת-כפילויות יעד. למרות שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הסרטן ואת הטרוגניות תאי גזע, זה יכול גם לתת תובנות לתוך priming גנים ופוטנציאל שושלת.כדי להתחיל את הפרוטוקול, על ספסל נטול RNA / DNA, הכינו מספיק מאגר תמוגה ל-96 בארות עם תוספת של 10% על ידי ערבוב של 390 מיקרוליטרים נוקלאז מים חופשיים, 17 מיקרוליטרים של 10%NP-40, 2.8 מיקרוליטרים 10 מילימולרים dNTP, 10 מיקרוליטרים 0.1 מוליכים DTT, ו 5.3 מיקרוליטרים RNAse מעכב. וורטקס ותסתובבי במורד הצינור. לאחר מכן, להפיץ ארבעה microliters של חיץ תיזה לכל באר של צלחת PCR 96-well ולאטום את הצלחות עם סרט דבק.לסובב את הצלחות כדי לאסוף את הנוזל בתחתית. שמור את הצלחות על הקרח עד למיון התאים למשך 24 שעות לכל היותר. לאחר שמכונת FACS הוגדרה כראוי, בצע ניתוח מחדש של אוכלוסיית היעד על-ידי מיון לפחות 100 תאי יעד לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש עם 100 מיקרוליטרים של מאגר כתמים.FACS מנתח את התאים ממוינים על-ידי הקלטת המדגם ממוין ולוודא שהם בסופו של דבר בשער המיון. לאחר מכן להגדיר מיון לוח תא יחיד על ידי מרורכז את הירידה באר A1 בצלחת 96 היטב. כאשר הוא ממורכז, למיין 50 עד 106 חלקיקי מיקרומטר בכל הבארים סביב הקצה של צלחת ריקה 96 בארות כדי להבטיח כי כל הבארים יקבלו תא במרכז כל באר.הסר את סרט ההיבקות מהצלחות. מיין תא יחיד של Lin-CD34 בתוספת CD38 מינוס תאים לתוך 92 מתוך 96 בארות. הפעל מיון אינדקס בתוכנת המיון FACS כדי לשמור את הפרופיל האימונופניוטיפיק עבור CD45RA, CD49F ו- CD90 עבור כל תא בודד.מיין שתי בארות עם 10 ו- 20 תאים בהתאמה עבור פקדי ליניאריות בהגברת PCR. ולס H1 ו H2 משמשים בדרך כלל. שמור שתי בארות ללא תאים כמו אין פקדי תבנית, בדרך כלל בארות H3 ו H4. לאטום את הצלחות עם סרט דבק ברור ולסובב את הצלחות ב 300 פעמים כוח הכבידה במשך דקה אחת.הצמד להקפיא את הצלחות על קרח יבש. ואז לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. הפוך שעתוק ומגבר יעד ספציפי לערבב על ידי הוספת 632.5 microliters של תערובת תגובה פעמיים, 101.2 microliters Taq / SuperscriptIII, 151.8 מיקרוליטרים פריים לערבב, ו 0.7 microliters זינק בבקרה RNA.Vortex הפתרון ולסובב אותו למטה כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור. שמור את התערובת על הקרח עד שהוא מוכן להתווסף לדגימה. לאחר מכן, להפשיר את צלחות לייסאט על קרח.הוסף 8.75 מיקרוליטרים של שעתוק הפוך שהוכן בעבר ותערובת הגברה ספציפית של יעד ל-92 בארות, כולל ליניאריות וללא פקדי תבנית. הוסיפו 8.75 מיקרוליטרים ללא תערובת בקרת שעתוק הפוכה לארבעת הבירות הנותרות. לאחר מכן לאטום את הצלחות עם סרט דבק ברור ולסובב את הצלחות כדי לאסוף נוזל בתחתית.בצע שעתוק הפוך והגברת יעד ספציפית על-ידי הפעלת הלוחית במכונת PCR בהתאם לתוכנית preamp. הכינו את צלחת הטעינה על ידי צינורות שלושה microliters של reagent טעינת הבדיקה לכל באר של צלחת 96 היטב. הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של כל פריימר ל בארות בודדות בצלחת הטעינה.לאטום את הצלחת עם סרט דבק ולסובב אותו. לאחר סיבוב הצלחת, להכין את צלחת הדילול על ידי צינור שמונה microliters של מים חופשיים נוקלאז לתוך כל בארות של צלחת 96 היטב. מוסיפים שני מיקרוליטרים של דגימה מוגברת לצלחת הדילול.לאטום את הצלחת עם סרט דבק. מערבבים על ידי מערבולת הצלחת במשך 10 שניות. ואז לסובב את הצלחת.לאחר מכן, הכינו את תערובת הטעינה לדוגמה על ידי ערבוב זהיר של 352 מיקרוליטרים של תערובת אב עם 35.2 מיקרוליטרים של רגנט טעינה לדוגמה. הכן את צלחת הטעינה לדוגמה על ידי aliquoting 3.3 microliters של תערובת טעינה לכל באר של צלחת 96 היטב. הוסף 2.7 microliters מן המדגם מדולל לתוך כל באר של צלחת הטעינה מדגם.לאטום את הצלחת עם סרט דבק ולסובב אותו. להוציא חדש 96 על ידי שבב microfluidic. הכינו את הדחפים על ידי דקירתם במזרק עם כובע כדי לוודא שניתן להזיז אותם.מוסיפים את מלוא נפח המזרקים לכל שסתום תוך הטיית השבב ל-45 מעלות ולחיצה על השסתום. הקם את השבב באמצעות בקר IFC. לטעון כל מדף assay עם 4.25 microliters מכל בארות בצלחת הטעינה בדיקה ולהימנע בועות.אם בועות מופיעות באר, הסר אותן עם קצה פיפטה. המשך לטעון כל מדף מדגם עם 4.25 מיקרוליטרים מכל אחת מה בארות בצלחת הטעינה לדוגמה, הימנעות בועות, ואם בועות מופיעות להסיר אותם עם קצה פיפטה. טען את השבב באמצעות בקר מעגל Fluidics המשולב או בקר IFC.תבדקו השבב נראה שווה ושת כל התאים נטענו. הסר אבק מפני השטח של השבב על ידי נגיעה בו עם סרט הדבקה. לבסוף, הפעל את השבב בפלטפורמת ביטוי הגנים המיקרופלואידיים מולטיפלקס.מפת חום של ריצה מוצלחת מציגה את הביטוי להתפשטות שווה על פני דגימות עם אות חזק של סביב שבעה עד 25 CTs. עקומת הגברה זו של RNA שליטה זינק מוודא כי כל הבארים יש ביטוי ברור של סביב 10 CT עם וריאציה מועטה עד ללא וריאציה, מאמת כי התגובות מראש הגברה qPCR היה מוצלח עבור כל התאים. ניתוח רכיבים עקרוניים או PCA אשר מדמיין את הדמיון בין קבוצות תאים באמצעות הפחתת ממדים יכול להיות שימושי כדי להבחין אשכולות של תאים שונים מולקולרית אחד מהשני כאן זיהוי ארבע קבוצות משנה.כדי לזהות את האימונופנוטיפ של תאים מאשכולות מולקולריים שונים, טען את קובץ FCS של האינדקס לתוך FlowJo. פתח את עורך קבצי ה- Script והדבק את קובץ ה- Script של האינדקס, הקש Run. כל תא יהיה עכשיו בשער נפרד.הוסף כל תא לתוך עורך הפריסה וצבע אותם בהתאם לקיבוץ המוגדר מולקולרית מ- SCXV הזמין בקובץ sample_complete_data.xls. עלילות FACS מציגות את ביטוי סמן פני התא עבור סמני תאי הגזע ההמוטופיטיים CD90 ו- CD45RA אשר ניתן להשתמש בהם כדי להפלות בין האשכולות ולבודד אותם לניתוח פונקציונלי. בעקבות הליך זה, טכניקה אחרת כמו רצף RNA של subpopulations שהתגלו לאחרונה או במבחנה וניסויים במבחנה ובויו ניתן לבצע כדי לענות על שאלה נוספת כמו איזה מנגנון מולקולרי גורם הטרוגניות זו וכיצד תת-התפקוד שונה מבחינה תפקודית.אסטרטגיה זו סללה את הדרך לחוקרים לא רק לחקור את ההטרוגניות בהמוטופיסיס רגיל וממאאיר, אלא גם לשמש לבידוד פוטנציאלי של תת-התת-כפילויות שהתגלו כדי להמשיך לחקור אותן.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...