Name: a combinatorial single-cell approach to characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity of human stem and progenitor populations
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00
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この仕事、医学研究、スウェーデン小児がん財団、ラグナル協会財団と、クヌートとアリス バレンベリー財団でスウェーデンの癌協会、スウェーデン研究評議会、スウェーデン会からの助成金によってサポートします。

1. 溶解プレートの準備
<ol><li>390 μ L ヌクレアーゼ フリー水、10% の 17 μ L を混合することによって、余分な 10% の 96 ウェルの十分な換散バッファーを準備 RNA/DNA 無料ベンチを使用して NP 40 2.8 μ 10 mM dNTP 10 μ L 0.1 M DTT、5.3 μ L RNAse 阻害剤 (材料の表を参照してください)。渦とスピン ・ ダウン。</li>
	<li>96 ウェル PCR プレートの各ウェルに換散バッファーの 4 μ L を配布し、接着フ?...

<ol>
	<li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell:+Self-renewal+versus+differentiation.">Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).</li><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+An+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li><li>Ye, F., Huang, W., Guo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+hematopoiesis+using+single-cell+technologies.">Studying hematopoiesis using single-cell technologies.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10, 27 (2017).</li><li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research.">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).</li><li>Wills, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis+reveals+genetic+associations+masked+in+whole-tissue+experiments.">Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments.</a> Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).</li><li>Velten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+lineage+commitment+is+a+continuous+process.">Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process.</a> Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).</li><li>Wilson, N. K., Nicola, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+functional+and+gene+expression+analysis+resolves+heterogeneity+within+stem+cell+populations.">Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+effects+and+the+effective+design+of+single-cell+gene+expression+studies.">Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies.</a> Scientific Reports. 7, 39921 (2017).</li><li>Teles, J., Enver, T., Pina, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+PCR+profiling+of+gene+expression+in+hematopoiesis.">Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis.</a> Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).</li><li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+profiling+of+planarian+stem+cells+using+fluorescent+activated+cell+sorting+and+its+&amp;#34;index+sorting&amp;#34;+function+for+stem+cell+research.">Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its &amp;#34;index sorting&amp;#34; function for stem cell research.</a> Development, Growth, &amp; Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).</li><li>Lang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCExV:+A+webtool+for+the+analysis+and+visualisation+of+single+cell+qRT-PCR+data.">SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).</li><li>de Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+oncogene+is+translocated+to+the+Philadelphia+chromosome+in+chronic+myelocytic+leukaemia.">A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia.</a> Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).</li><li>. indexed-sorting Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting">https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting</a> (2016)</li><li>Warfvinge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+analysis+defines+therapy+response+and+immunophenotype+of+stem+cell+subpopulations+in+CML.">Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML.</a> Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Breton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+(DCs)+are+derived+from+distinct+circulating+precursors+that+are+precommitted+to+become+CD1c++or+CD141++DCs.">Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).</li><li>Alberti-Servera, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+developmental+heterogeneity+among+early+lymphoid+progenitors.">Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors.</a> The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).</li><li>Giustacchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+uncovers+distinct+molecular+signatures+of+stem+cells+in+chronic+myeloid+leukemia.">Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 692 (2017).</li><li>Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+interrelatedness+of+distinct+B-lineage+compartments+in+multiple+myeloma+bone+marrow.">Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow.</a> Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations.">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li></ol>

近年では、1 細胞遺伝子発現解析は様々 な細胞集団23の不均一性を定義する貴重な追加になりました。RNA シーケンス テクノロジーの出現は、しかし、これらのメソッドは、セルのセル配列の深さやドロップ アウトの変化によって複雑な理論的にセルの全体のトランスクリプトームを測定する可能性を提供します。何百ものすべてのセルが重要な遺伝子の発現の敏感でロバ?...

それぞれ個々 の白血球細胞が幹細胞が最終的に末期特定を運ぶ最終的なエフェクター細胞に分化ますますコミットの中間の前駆細胞の一連の上に頂点を形成、細胞の階層内に存在すると考えられています。生体機能1。幹細胞システムの構成方法に関する知識の多くは前向きの高濃縮幹細胞や前駆細胞様々 な2 異なる造血集団を切り離すことができるため主造血系で発生しています。FACS を並べ替えています。これが分析する機能や分子、主に遺伝子発現プロファイリング3,4を介してこれらの人口の多くはできました。ただし一括集団個体差細胞の遺伝子発現解析は、平均し、5を失った。したがって、異種細胞内細胞の変化を検出する無能を混同するかもしれない重要な生物学的プロセスの私達の理解場合細胞の小さなサブセットは、人口6の推定される生物学的機能の 7。逆に、単一セルの解像度で遺伝子発現シグネチャの調査は、不均一性を表し、セル8のあるサブセットから覆っの影響を回避する可能性を提供しています。
日付 1 細胞遺伝子発現解析のための多くのプロトコルが開発されました。それぞれの方法で、独自の注意事項があります。最も早い方法であった RNA 蛍光その場で交配 (RNA-魚)、一度に転写産物の限られた数を測るが、RNA 局在9,11の調査のことでユニークです。単一または非常に少数の成績証明書も検出する PCR と qPCR 使用初期の方法は、12を開発しました。ただし、これらが最近交換済み qPCR を通して細胞の何百もの細胞 1 個あたりの成績の何百もの式を同時に分析でき、したがって高次元不均一性解析の使用を許可するマイクロ流体法によるあらかじめ決められた遺伝子パネル10,13。最近 RNA シーケンス技術普及して単一細胞解析、これらは理論的にセルの全体のトランスクリプトームを測定することができ、それにより不均一性解析10、に探索的次元を追加14. 多重 qPCR 解析と単一細胞 RNA シーケンスが異なる機能を持っている、従ってメソッドのいずれかを使用するための理論的根拠はターゲット人口のセルの数だけでなく、質問に決まります。高スループットと単一細胞 RNA シーケンスの公平な探索特性と共にセルあたりの低コストは、不明なセルまたは大規模な集団を調査したときに望ましいです。ただし、単一細胞 RNA シーケンスは低豊富で成績証明書が脱落しやすいより頻繁高い豊富な成績証明書のシーケンスに偏っても。これはバイオ情報解析は、しばしば微妙なや技術的ノイズ15に隠された重要なの分子シグナルを明らかにするために高需要を置くかなり複雑なデータにつながることができます。したがって、よ特徴付けられた組織の単一セル qPCR による解析済みプライマー パネルの機能的に重要な遺伝子や分子マーカーの選択することができますの不均一性を決定するための敏感な簡単なアプローチとして、人口。しかし、それは比較するに注意する必要があります単一細胞 RNA シーケンス、セルあたりのコストが単一セル qPCR 法一般的に高くなっています。ここでは、単一セル Rt-qpcr (Teles J.らから変更を組み合わせたアプローチについて述べる16)、FACS インデックスに集団内で分子と肺浸潤の不均質性を特徴付けるために17バイオインフォマティクス解析18を同時に並べ替え。
このアプローチで興味の細胞を染色すると、単一セルは、96 ウェル PCR プレートの換散バッファーに直接 FACS によって並べ替えられます。同時に、細胞表面マーカーの追加セットの表現のレベルは、FACS-並べ替え、インデックス並べ替えと呼ばれますメソッド中に単一セルごとに記録されます。物質分離細胞は増幅されその後、RT qPCR、マイクロ流体プラットフォームを使用して、選択した一連の遺伝子の遺伝子発現分析します。この方法により、個々 のセルのセル表面のマーカー式の並べ替えられた同時と同様シングル セル特性の分子分析です。細胞の分子特定サブセットをインデックス付きの並べ替えられたマーカーの発現に直接マップによって subpopulations は、将来の分離に使用できます特定イムノフェノ タイプにリンクできます。メソッドの説明図 1で一歩一歩。微妙な遺伝子式信号を見えなくことができますそれ以外の場合は無関係の豊富な遺伝子の測定を回避できますので、さらにパネルであらかじめ決められた遺伝子は目標とされた遺伝子の表現のより高い解像度に貢献します。さらに、特定のターゲットの増幅、1 つのステップの逆のトランスクリプションおよび増幅できます低表現された成績証明書、転写因子や非ポリ adenylated Rna のような堅牢な測定。重要なは、qPCR 法19特定の悪性疾患を調査するときに重要である融合蛋白質から mRNA の測定を可能にします。最後に、遺伝子の数は集中を調査した、低ドロップ アウト率と単一細胞 RNA シーケンスより高い次元のメソッドと比較して限られた細胞をこのメソッドを簡単に分析した技術的な差プロトコルに従うことによって実験全体から実行できます、このシンプルで簡単な高感度、高スループットの単一細胞遺伝子発現解析法を作って 3 日以内、分析結果にセルを並べ替えします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD14 PECY5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0149-42</td>
			<td>Clone: 61D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302010</td>
			<td>Clone: 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304608</td>
			<td>Clone: MEM-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302210</td>
			<td>Clone: HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD2 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300210</td>
			<td>Clone: RPA-2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300310</td>
			<td>Clone: HIT3a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>306008</td>
			<td>Clone: 6H6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235A PECY5</td>
			<td>BD Pharma</td>
			<td>559944</td>
			<td>Clone GAR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343604</td>
			<td>Clone: 561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303510</td>
			<td>Clone: Hit2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Clone: 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA BV421</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>560362</td>
			<td>Clone: HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f Pecy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0495-82</td>
			<td>Clone: eBioGOH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well u-bottom Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFEM</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorph tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CST beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>642412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accudrop Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>345249</td>
			<td>6-&#181;m particles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film Clear</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film Foil</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>AB-0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96M2-HS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 1.5 mL tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP40</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP</td>
			<td>Takara</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsout</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777-019</td>
			<td>RNAse inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuclease free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Reaction Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeno RNA Control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Sample/Loading Kit&#8212;10 IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M10-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X GE Sample Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control line fluid&#160;</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark HD</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMKHD-BMKHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M10-96.96GT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm real time PCR analysis</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179a.VPREB1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00356766_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174179_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00169233_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCR_ABL.52</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03043652_ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCR_ABL41</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03024541_ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00995536_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00996788_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNB1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01030099_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNB2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01084593_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNC</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01029304_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNE1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01026535_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171049_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR9</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01890924_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD10.MME</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00153510_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11a</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00158218_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c.ITAX</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174217_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123.IL3RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00608141_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133.PROM1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01009250_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD151</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00911635_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD220.INSR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00961554_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24.HSA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03044178_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCOR1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01094540_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26.DPP4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175210_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD274</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01125301_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD276</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00987207_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD32.FCGR2B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01634996_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD33</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01076281_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00990732_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD344.FZD4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00201853_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD352.SLAMF6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01559920_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01120071_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01058407_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41.ITGA2B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01116228_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f.ITGA6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01041011_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56.NCAM1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00941830_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00233521_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD97</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00173542_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD99</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00908458_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01026371_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1A</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00355782_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01597588_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1C</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175938_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEBPa</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00269972_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF1r</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00911250_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF2RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00531296_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF3RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01114427_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2A.TCF3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00413032_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBF1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01092694_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00923996_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00959427_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01554629_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00956711_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174690_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXO1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01054576_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02758991_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231112_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231119_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231122_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00382207_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HES1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01118947_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171406_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMGA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171569_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOXA5</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00430330_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOXB4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00256884_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ID2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs04187239_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF2BP1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00198023_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF2BP2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01118009_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKZF1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00172991_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL1RAP</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00895050_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL2RG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00953624_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRF8</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175238_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITGB7</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01565750_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174029_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lin28B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01013729_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00153473_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYL1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01089802_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meis1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01017441_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKi67</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01032443_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPL</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00180489_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPO</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00924296_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFIB</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01029175_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01062011_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02621230_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAG2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01851142_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPS18</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01375212_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shisa2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01590823_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spi1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02786711_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile.IgH</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00378435_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01097987_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00264235_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tim.3.HAVCR2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00958618_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00169795_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a combinatorial single-cell approach to characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity of human stem and progenitor populations

肺浸潤の評価と分子解析長い不均一性を表し、明確な細胞集団を定義に使用されています。FACS は本質的に単一セルの試金、しかし分子解析する前に、標的細胞は、一括で分離されたよく前向き単一セルの解像度を失うこと。単一細胞の遺伝子発現解析は、異種細胞集団の個々 のセルの分子の違いを理解するための手段を提供します。一括細胞分析で異なる細胞型の overrepresentation 結果バイアスと希少な細胞からの信号の咬合の生物学的重要性。FACS インデックス並べ替え結合した単一細胞遺伝子発現解析を活用することにより集団調査できる単一セルの解像度の損失なし中間細胞表面マーカーの発現と細胞もキャプチャされます, 中の評価を有効にします。連続表面マーカー発現の関連性。ここでは、逆のトランスクリプションの単一セルを組み合わせたアプローチについて述べる定量的 PCR (RT qPCR) および FACS インデックスを同時に分子を特徴付ける並べ替えおよび細胞集団内で肺浸潤の不均一性。
単一細胞 RNA 配列方法と対照をなして特定のターゲットの増幅と qPCR を使用少ない落ちこぼれで低豊富な転写産物の堅牢な測定のためにはしない読み取りの細胞間の変動に関連する問題によって混同される中深さ。また、直接インデックス並べ替え単一セル換散には、このメソッドをバッファーにより cDNA を合成して特定のターゲット中古増幅の細胞表面で分子の署名の後派生の相関に関しては同様に 1 つのステップで実行するにはマーカー式。造血の単一細胞を調べるのにも他のセルタイプで正常に使用されている記述方法をしました。
結論としては、記載方法は明確な分子集団のそれに続く分離のためのプロトコルを開発するパネルの可能性は、事前に選択された遺伝子の mRNA 発現の高感度に測定できます。

説明されたプロトコルは、簡単に実行、迅速かつ信頼性の高いです。実験のセットアップの概要については、図 1にされます。特定のターゲットの増幅、遺伝子発現測定および予備的な分析に、単一セルの並べ替えから、プロトコル全体は、3 日間で実行できます。96 プライマーといずれかの慢性骨髄性白血病 (CML) 患者から 96 セルまたは健康な?...

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A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically 分子細胞集団を特徴付けます。

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

この方法は、幹細胞の異質性がどのように見えるか、敏感な癌細胞の治療をどのように分離できるかなど、幹細胞分野やがん分野の重要な質問に答えることができます。この研究の主な利点は、技術的に堅牢な単細胞遺伝子発現解析とバクチノーシスを組み合わせて、標的亜集団のさらなる下流特性化を行う点である。この方法は、癌および幹細胞の不均一性を調べるのに使用することができるが、それはまた、遺伝子のプライミングおよび系統電位に関する洞察を与えることができる。このプロトコルを開始するには、RNA/DNAフリーベンチで、390マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、10%NP-40の17マイクロリットル、2.8マイクロリットル10ミリモルdNTP、10マイクロリットル0.1モルDTT、および5.3マイクロリットル阻害剤を混合することによって、10%余分な96ウェルに十分なリシスバッファーを調製します。渦とチューブをスピンダウン。次に、96ウェルPCRプレートのウェルに4マイクロリットルのライシスバッファーを分配し、粘着フィルムでプレートを密封します。プレートを回転させ、底面の液体を集める。プレートを氷の上に置いておき、セルの並べ替えが最大24時間続くまで保管します。FACSマシンが適切にセットアップされたら、少なくとも100個のターゲットセルを100マイクロセントリフュージチューブに仕分けし、100マイクロリットルの汚れバッファーを持つ新しいマイクロ遠心分離管に選別して、ターゲット集団の再分析を行います。FACS は、並べ替えられたサンプルを記録して並べ替えられたセルを分析し、並べ替えゲートで終了することを確認します。その後、96ウェルプレートのウェルA1にドロップをセンタリングすることによって、単一セルプレートのソートを設定します。中央に配置されたら、空の96ウェルプレートの端の周りのすべての井戸に50〜106マイクロメートルの粒子をソートし、すべての井戸が各ウェルの中央に細胞を得ることを保証します。プレートから粘着フィルムを取り除きます。Lin-CD34とCD38マイナスセルの単一のセルを96個のウェルのうち92個に並べ替えます。FACSソートソフトウェアでインデックスソートを有効にして、単一のセルごとにCD45RA、CD49F、CD90の免疫フェノミクスプロファイルを保存します。PCR増幅における直線性制御のために、それぞれ10個と20個の細胞を持つ2つのウェルをソートします。通常はウェルスH1とH2が使用されます。テンプレートコントロールなしのセルなしで2つの井戸を保ちます, 通常、ウェルH3とH4.プレートを透明な粘着フィルムで密封し、1分間300倍の重力でプレートを回転させます。スナップはドライアイスの上にプレートを凍結します。その後、マイナス80度で保存します。逆転写および特異的な標的増幅ミックスを2回の反応ミックスの632.5マイクロリットル、101.2マイクロリットルTaq/上付きIII、151.8マイクロリットルプライマーミックス、およびコントロールRNAにスパイク0.7マイクロリットルを加えることによって、溶液をボルテックスし、チューブの底に液体を収集するためにそれを回転させます。サンプルに加える準備ができるまで氷の上にミックスを保管してください。次に、氷の上のライセートプレートを解凍します。線形性とテンプレートコントロールを含む92のウェルに、以前に準備された逆転写と特異的なターゲット増幅ミックスの8.75マイクロリットルを追加します。残りの4つのウェルに逆転写制御ミックスなしの8.75マイクロリットルを加えます。その後、プレートを透明な粘着フィルムで密封し、プレートを回転して底部に液体を集める。プリアンププログラムに従ってプレートをPCR機で実行することにより、逆転写および特異的標的増幅を行います。96ウェルプレートの各ウェルに3マイクロリットルのアッセイローディング試薬をピペット処理して、アッセイローディングプレートを準備します。アッセイローディングプレートの個々のウェルに各プライマーの3マイクロリットルを加えます。粘着フィルムでプレートを密封し、それを回転させます。プレートを回転させた後、8マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を96ウェルプレートのすべてのウェルにピペットして希釈プレートを準備します。希釈板に2マイクロリットルの増幅サンプルを加えます。粘着フィルムでプレートを密封します。プレートを10秒間渦盛りして混ぜます。その後、プレートを回転させます。次に、352マイクロリットルのマスターミックスを35.2マイクロリットルのサンプルローディング試薬と慎重に混合してサンプルローディングミックスを調製します。96ウェルプレートの各ウェルに3.3マイクロリットルのローディングミックスをアリクォートしてサンプルローディングプレートを準備します。希釈したサンプルから2.7マイクロリットルをサンプルローディングプレートの各ウェルに加えます。粘着フィルムでプレートを密封し、それを回転させます。96マイクロ流体チップで新しい96を取り出します。入り江をキャップを付けて注射器で突き刺して、移動できることを確認します。チップを45度に傾け、バルブを押し下げながら、各バルブにシリンジのフルボリュームを追加します。IFC コントローラを使用してチップを使用します。各アッセイ入口に、アッセイローディングプレートの各ウェルから4.25マイクロリットルを入れ、気泡を避けます。気泡がウェルに現れた場合は、ピペットチップでそれらを取り除きます。サンプルローディングプレートの各ウェルから4.25マイクロリットルの各サンプル入口をロードし続け、気泡を避け、気泡がピペットチップでそれらを取り除いているように見える場合。内蔵流体回路コントローラまたはIFCコントローラでチップをロードします。チップが均等に見え、すべてのチャンバーがロードされていることを確認します。チップの表面にテープで触れてほこりを取り除きます。最後に、マルチプレックスマイクロ流体遺伝子発現プラットフォームでチップを実行します。成功した実行のヒート マップは、7 ~ 25 個の CT の強い信号を持つサンプルに均等に広がる表現を表示します。コントロールRNAのスパイクのこの増幅曲線は、すべてのウェルが、全ての細胞に対して事前増幅およびqPCR反応が成功したことを検証し、変化がほとんどない10CT程度の明確な発現を有することを確認する。分析分析を用いて細胞群間の類似性を可視化する主成分分析またはPCAは、分子的に異なる細胞のクラスターをここで4つのサブグループを同定するのに役立つ可能性がある。異なる分子クラスターから細胞の免疫フェノタイプを識別するには、インデックスFCSファイルをFlowJoにロードします。スクリプトエディタを開き、インデックススクリプトを貼り付け、[実行]を押します。各セルは別のゲートに入ります。各セルをレイアウトエディタに追加し、ファイルsample_complete_data.xlsで利用可能なSCXVから分子定義のグループに従って色を付けます。FACSプロットは、造血幹細胞マーカーCD90およびCD45RAの細胞表面マーカー発現を示しており、クラスター間を判別し、機能的分析のためにそれらを分離するために使用することができる。この手順に従って、新たに発見された亜集団のRNAシーケンシングやインビトロおよびインビボ実験のような他の技術は、どのような分子メカニズムがこの不均一性を引き起こし、亜集団がどのように機能的に異なるのかのような追加の質問に答えるために行うことができる。この戦略は、研究者が正常および悪性造形の不均一性を調査するだけでなく、発見された亜集団を前向きに分離してさらに研究する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

準備とヒト以外の霊長造血幹・前駆細胞の遺伝子の改変

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...