Name: a combinatorial single-cell approach to characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity of human stem and progenitor populations
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations at JoVE.com

이 작품은 의료 연구, 스웨덴어 유년기 암 재단, 라 그 나 Söderberg 재단, 그리고는 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단에 대 한 스웨덴의 암 사회, 스웨덴 연구 위원회, 스웨덴의 사회에서 교부 금에 의해 지원

1입니다. 세포 접시의 준비
<ol><li>390 µ L nuclease 무료 물, 10%의 17 µ L를 혼합 하 여 10% 추가, 96 웰 스에 대 한 충분 한 세포의 용 해 버퍼 준비 RNA/DNA 무료 벤치를 사용 하 여 NP-40, 2.8 µ L 10 mM dNTP, 10 µ L 0.1 M DTT와 5.3 µ L RNAse 억제제 ( 재료의 표참조). 와 동 그리고 아래로 회전입니다.</li>
	<li>96 잘 PCR 플레이트의 각 음에 세포의 용 해 버퍼의 4 µ L 고 접착 필름으로 접시를 봉인. 접시의 바?...

<ol>
	<li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell:+Self-renewal+versus+differentiation.">Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).</li><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+An+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li><li>Ye, F., Huang, W., Guo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+hematopoiesis+using+single-cell+technologies.">Studying hematopoiesis using single-cell technologies.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10, 27 (2017).</li><li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research.">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).</li><li>Wills, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis+reveals+genetic+associations+masked+in+whole-tissue+experiments.">Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments.</a> Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).</li><li>Velten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+lineage+commitment+is+a+continuous+process.">Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process.</a> Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).</li><li>Wilson, N. K., Nicola, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+functional+and+gene+expression+analysis+resolves+heterogeneity+within+stem+cell+populations.">Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li><li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq:+Advances+and+future+challenges.">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+effects+and+the+effective+design+of+single-cell+gene+expression+studies.">Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies.</a> Scientific Reports. 7, 39921 (2017).</li><li>Teles, J., Enver, T., Pina, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+PCR+profiling+of+gene+expression+in+hematopoiesis.">Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis.</a> Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).</li><li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+profiling+of+planarian+stem+cells+using+fluorescent+activated+cell+sorting+and+its+&amp;#34;index+sorting&amp;#34;+function+for+stem+cell+research.">Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its &amp;#34;index sorting&amp;#34; function for stem cell research.</a> Development, Growth, &amp; Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).</li><li>Lang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCExV:+A+webtool+for+the+analysis+and+visualisation+of+single+cell+qRT-PCR+data.">SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).</li><li>de Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+oncogene+is+translocated+to+the+Philadelphia+chromosome+in+chronic+myelocytic+leukaemia.">A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia.</a> Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).</li><li>. indexed-sorting Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting">https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting</a> (2016)</li><li>Warfvinge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+analysis+defines+therapy+response+and+immunophenotype+of+stem+cell+subpopulations+in+CML.">Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML.</a> Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).</li><li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation.">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li><li>Breton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+(DCs)+are+derived+from+distinct+circulating+precursors+that+are+precommitted+to+become+CD1c++or+CD141++DCs.">Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).</li><li>Alberti-Servera, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+developmental+heterogeneity+among+early+lymphoid+progenitors.">Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors.</a> The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).</li><li>Giustacchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+uncovers+distinct+molecular+signatures+of+stem+cells+in+chronic+myeloid+leukemia.">Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 692 (2017).</li><li>Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+interrelatedness+of+distinct+B-lineage+compartments+in+multiple+myeloma+bone+marrow.">Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow.</a> Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations.">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li></ol>

최근 몇 년 동안, 단일 셀 유전자 표정 분석은 다양 한 세포 인구23의 정의에 가치 추가 되었다. 그러나 이러한 메서드는 셀 시퀀싱 깊이 탈락에 의해 복잡 하 게 RNA 시퀀싱 기술의 출현 이론적으로 셀의 전체 transcriptome 측정 하는 가능성을 제공 합니다. 단일 셀 정량 제공 중요 한 유전자에 있는 모든 세포의 수백의 식의 과민 하 고 강력한 분석 기술 노이즈 감소 마찬가지로 처리 ?...

각 개별 혈액 세포 어디 줄기 세포 형성 결국 말기 특정 들고 최종 효과 기 세포로 분화 하는 점점 더 최선을 다하고 중간 창시자의 시리즈 위에 정점 세포 계층 구조에서 것으로 생각 됩니다. 생물 학적 기능1. 줄기 세포 시스템 구성 방식에 대 한 지식을 많이 크게 능력을 고도로 농축 줄기 세포 또는 다양 한 창시자2 가지 조 혈 인구 prospectively 분리 때문에 조 혈 시스템에 생성 된 FACS 정렬. 이 분석 기능 또는 분자로, 주로 유전자 발현 프로 파일링3,4를 통해 이러한 인구의 많은 수 있다. 그러나 때 대량 인구 개별 차이 세포의 유전자 발현을 분석은 평균 밖으로 하 고5를 잃었다. 따라서, 이기종 셀 분수 내 셀 변화를 감지 하는 무능 경우 셀의 작은 하위 집합 그 인구6,의 유추 생물 학적 기능에 대 한 중요 한 생물 학적 과정에 대 한 우리의 이해 혼동 수 있습니다. 7. 반대로, 유전자 식 서명 단일 셀 해상도 조사가 윤곽을 그리 다 셀8overrepresented 하위 집합에서가 영향을 회피 하는 가능성을 제공.
현재까지 단일 셀 유전자 표정 분석을 위한 많은 프로토콜 개발 되었습니다; 각 접근 자체 주의 데. 가장 이른 방법은 이었다 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기), 한 번에 제한 된 수의 성적을 측정 하지만 독특한 RNA 지역화9,11의 조사에 대 한 수 있습니다. 단일 또는 거의 기록 했다 또한 감지를 PCR과 정량 Pcr를 사용 하 여 초기 방법 개발12. 그러나,이 요즘 대체 되었습니다 동시에 정량 셀의 수백에 셀 당 증명서의 수백의 식을 분석 하 고 따라서 높은 차원이 분석을 사용 하 여 허용 수 있는 마이크로-기반 방법으로 사전 결정 유전자 패널10,13. 최근 RNA 시퀀싱 기반 기술을 널리 사용이 될 단일 세포 분석을 위해 이러한 이론적으로 수 셀의 전체 transcriptome 측정 하 고 그로 인하여 추가 답사 차원이 분석10, 14. Multiplexed 정량 분석 및 단일 셀 RNA 시퀀싱 다른 기능을가지고, 따라서 방법 중 하나를 사용 하 여에 대 한 근거는 타깃 셀의 수 뿐만 아니라 질문에 따라 달라 집니다. 높은 처리량 및 단일 셀 RNA 시퀀싱의 편견, 탐구 특성 함께 셀 당 저가 알 수 없는 셀 또는 큰 인구 조사 때 바람직한. 그러나, 단일 셀 RNA 시퀀싱은 또한 낮은 풍부와 성적 증명서는 중단 하는 경향이 높은 풍부한 성적표를 더 자주 시퀀싱으로 편 파. 이 종종 미묘한 또는 기술적인 잡음15에 숨겨진 중요 한 분자 신호를 공개 bioinformatic 분석에 높은 수요를 상당히 복잡 한 데이터 발생할 수 있습니다. 따라서, 잘 특징이 조직에 대 한 단일 셀 정량 분석을 사용 하 여 미리 결정 뇌관 패널 기능적으로 중요 한 유전자 또는 분자 마커 선택의 질을 결정 하는 민감한, 간단한 접근 될 수 있는 인구입니다. 그러나, 주목 해야 한다 그에 비해 단일 셀 RNA-seq, 셀 당 비용은 단일 셀 정량 방법에 대 한 일반적으로 더 높은. 여기, 우리가 결합 하 여 단일 셀 실시간 정량 Pcr (Teles J. 그 외 여러분 에서 수정 하는 방법 설명 16), FACS 인덱스 인구 내에서 분자와 immunophenotypic이 특징에17 및 생물 정보학 분석18 를 동시에 정렬.
이 방법에서는, 관심사의 세포 인구, 스테인드 그리고 단일 세포 세포의 용 해 버퍼 96 잘 PCR 접시에서에 직접 FACS에 의해 정렬 됩니다. 동시에, 세포 표면 마커 추가 집합 식 수준의 FACS 라고 인덱스 정렬 방법-정렬, 하는 동안 각 단일 셀에 대 한 기록 됩니다. Lysed 세포 물자는 연속적으로 증폭 하 고 실시간 정량, 미세 플랫폼을 사용 하 여 선택된 된 유전자의 유전자 발현 분석. 이 전략에는 각 개별 셀의 세포 표면 마커 식의 정렬 된 단일 셀으로 동시 특성화의 분자 분석 수 있습니다. 직접 인덱스 정렬 된 표시자의 식 세포의 분자로 고유 하위 집합을 매핑하여,를 모집단 그들의 잠재 격리에 대 한 사용할 수 있는 특정 immunophenotype에 연결할 수 있습니다. 메서드를 설명 하는 그림 1에서 단계적으로. 미리 정해진된 유전자 패널 더 미묘한 유전자 식 신호를 가리고 그렇지 않으면 수 없는 풍부한 유전자의 측정 circumvents 이후 타겟된 유전자 발현의 높은 해상도에 기여 한다. 또한, 특정 대상 확대, 한 단계 반전 녹음 방송, 그리고 증폭 녹음 방송 요인 또는 비 폴 리 adenylated RNAs 같은 낮은 표현된 성적표의 강력한 측정에 대 한 수 있습니다. 중요 한 것은, 정량 방법에서 특정 악성 질병19를 조사할 때 중요 한 융해 단백질 mRNA의 측정에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, 유전자의 집중된 수 조사, 낮은 드롭 아웃 요금, 및 제한 된 셀 확인이이 방법은 쉽게 분석 기술 차이 단일 셀 RNA-이 같은 높은 차원 방법에 비해 프로토콜에 따라, 전체 실험 수행할 수 있습니다, 정렬 셀 분석된 결과를 3 일 이내 중요 한, 높은 처리량 단일 셀 유전자 표정 분석에 대 한 단순 하 고 빠른 방법 만들기에서.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD14 PECY5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0149-42</td>
			<td>Clone: 61D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302010</td>
			<td>Clone: 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304608</td>
			<td>Clone: MEM-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302210</td>
			<td>Clone: HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD2 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300210</td>
			<td>Clone: RPA-2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300310</td>
			<td>Clone: HIT3a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123 PECY5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>306008</td>
			<td>Clone: 6H6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235A PECY5</td>
			<td>BD Pharma</td>
			<td>559944</td>
			<td>Clone GAR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343604</td>
			<td>Clone: 561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303510</td>
			<td>Clone: Hit2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Clone: 5E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA BV421</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>560362</td>
			<td>Clone: HI100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f Pecy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0495-82</td>
			<td>Clone: eBioGOH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well u-bottom Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFEM</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorph tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CST beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>642412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accudrop Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>345249</td>
			<td>6-&#181;m particles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film Clear</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive film Foil</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>AB-0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96M2-HS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 1.5 mL tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP40</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP</td>
			<td>Takara</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsout</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777-019</td>
			<td>RNAse inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuclease free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Reaction Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11753-100</td>
			<td>from CellsDirect kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeno RNA Control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4386995</td>
			<td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Sample/Loading Kit&#8212;10 IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M10-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X GE Sample Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control line fluid&#160;</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>From 96.96 Sample/Loading Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark HD</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMKHD-BMKHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M10-96.96GT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm real time PCR analysis</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179a.VPREB1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00356766_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174179_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00169233_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCR_ABL.52</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03043652_ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCR_ABL41</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03024541_ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00995536_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00996788_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNB1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01030099_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNB2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01084593_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNC</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01029304_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNE1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01026535_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCNF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171049_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR9</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01890924_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD10.MME</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00153510_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11a</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00158218_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c.ITAX</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174217_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123.IL3RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00608141_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133.PROM1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01009250_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD151</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00911635_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD220.INSR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00961554_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24.HSA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs03044178_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCOR1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01094540_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD26.DPP4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175210_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD274</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01125301_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD276</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00987207_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD32.FCGR2B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01634996_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD33</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01076281_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00990732_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD344.FZD4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00201853_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD352.SLAMF6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01559920_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01120071_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01058407_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41.ITGA2B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01116228_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f.ITGA6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01041011_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56.NCAM1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00941830_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00233521_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD97</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00173542_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD99</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00908458_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK6</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01026371_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1A</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00355782_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01597588_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDKN1C</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175938_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEBPa</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00269972_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF1r</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00911250_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF2RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00531296_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSF3RA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01114427_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2A.TCF3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00413032_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBF1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01092694_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00923996_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOR</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00959427_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01554629_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00956711_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174690_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXO1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01054576_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02758991_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231112_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231119_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA3</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231122_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFI1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00382207_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HES1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01118947_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171406_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMGA2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00171569_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOXA5</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00430330_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOXB4</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00256884_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ID2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs04187239_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF2BP1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00198023_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF2BP2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01118009_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKZF1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00172991_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL1RAP</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00895050_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL2RG</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00953624_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRF8</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00175238_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITGB7</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01565750_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00174029_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lin28B</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01013729_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00153473_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYL1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01089802_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meis1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01017441_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKi67</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01032443_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPL</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00180489_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPO</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00924296_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFIB</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01029175_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notch1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01062011_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pten</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02621230_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAG2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01851142_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPS18</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01375212_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shisa2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01590823_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spi1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs02786711_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile.IgH</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00378435_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs01097987_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00264235_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tim.3.HAVCR2</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00958618_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWF</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>Hs00169795_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a combinatorial single-cell approach to characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity of human stem and progenitor populations

Immunophenotypic 특성 및 분자 분석이 윤곽을 그리 다 뚜렷한 세포 인구를 정의 하 오랫동안 사용 되어 왔습니다. 그러나 FACS은 본질적으로 단일 세포 분석 실험, 분자 분석 하기 전에, 대상 셀은 종종 prospectively 절연 되어 대량, 따라서 단일 셀 해상도 잃고. 단일 셀 유전자 표정 분석 이종 세포 인구에 있는 개별 셀 사이의 분자 차이 이해 하는 수단을 제공 합니다. 대량 세포 분석에서 고유한 셀 형식의 overrepresentation 생물 학적 중요성으로 편견 및 희소 한 세포에서 신호 않기에 결과. FACS 인덱스 정렬 단일 셀 유전자 표정 분석을 결합 하 여 인구 조사 수 단일 셀 해상도의 손실 없이 중간 세포 표면 마커 식 세포 또한 점령 하 고, 하는 동안 평가 활성화 연속 표면 마커 식의 관련성입니다. 여기, 우리는 단일 셀 반전 녹음 방송 결합 하는 접근 방식을 설명 정량 PCR (RT-정량) 및 FACS 색인 동시에 분자의 특성을 정렬 하 고 셀 인구 내의 immunophenotypic이.
단일 셀 RNA 시퀀싱 방법, 달리 특정 대상 증폭 정량 Pcr 사용 하 여 동안 수 있습니다 적은 낙후, 낮은 풍부 성적표의 강력한 측정 셀 변화에 읽기에 관련 된 문제에 의해 혼동 하지는 깊이입니다. 또한,에 의해 직접 인덱스 정렬 단일-세포 세포의 용 해로,이 방법은 버퍼 수 있게 cDNA 합성 및 특정 대상 사전 증폭 세포 표면 분자 서명 이후에 파생된의 상관 관계 뿐만 아니라 한 단계에서 수행할 수 표식 식입니다. 기술된 접근, 조 혈 단일 세포를 조사 하지만 또한 다른 세포 유형에 성공적으로 사용 되었습니다 개발 되었습니다.
끝으로, 여기에 설명 된 접근 분자로 별개 부분 모집단의 후속 예비 격리 프로토콜을 개발 하 패널에 대 한 가능성과 함께 미리 선택 된 유전자의 mRNA 표현의 중요 한 측정에 대 한 수 있습니다.

설명 하는 프로토콜은 빠르고 쉽게 수행 하 고 신뢰할 수 있는. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 전체 프로토콜 특정 대상 확대, 유전자 식 측정 및 예비 분석 단일 셀의 정렬에서 3 일 동안에서 수행할 수 있습니다. 96 뇌관 및 만성 골수성 백혈병 (CML) 환자에서 96 셀 이나 건강 세 일치에서 96 셀을 사용 하 여 단일 셀 유전자 표정 분석?...

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A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

이 방법은 줄기 세포 이질성이 어떻게 보이는지 및 민감한 암세포에 있는 치료가 어떻게 고립될 수 있는지와 같은 줄기 세포 및 암 필드에 있는 중요한 질문에 대답할 수 있습니다. 이 연구의 주요 장점은 표적 하위 인구의 추가 하류 특성화를 위해 암시노시스와 함께 기술적으로 견고한 단세포 유전자 발현 분석을 결합한다는 것입니다. 이 방법은 암과 줄기 세포 이질성을 조사하기 위하여 이용될 수 있더라도, 또한 유전자 프라이밍 및 혈통 잠재력에 통찰력을 줄 수 있습니다.프로토콜을 시작하려면 RNA / DNA가없는 벤치에서 390 마이크로 리터 뉴클레아제 프리 워터, 10 %NP-40, 2.8 마이크로 리터 10 밀리미터 dNTP, 10 마이크로 리터 0.1 μg DTT 및 5.3 개의 미세 리터를 혼합하여 96 개의 우물에 대한 충분한 용해 버퍼를 준비하십시오. 소용돌이와 튜브 아래로 회전. 다음으로, 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 용해 버퍼 4개를 배포하고 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.플레이트아래로 회전하여 하단의 액체를 수집합니다. 셀이 최대 24시간 동안 정렬될 때까지 접시를 얼음 위에 보관하십시오. FACS 기계가 제대로 설정되면, 얼룩 버퍼의 100 마이크로 리터와 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 적어도 100 대상 세포를 정렬하여 대상 인구의 재분석을 수행합니다.FACS는 정렬된 샘플을 기록하여 정렬된 셀을 분석하고 정렬 게이트에서 작동하는지 확인합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 잘 A1의 드롭을 중심으로 단일 셀 플레이트 정렬을 설정합니다. 중앙에 있는 경우, 빈 96웰 플레이트 의 가장자리 주변의 모든 우물에 50~106마이크로미터 입자를 정렬하여 모든 우물이 각 우물의 중앙에 세포를 얻을 수 있도록 합니다.플레이트에서 접착제 필름을 제거합니다. Lin-CD34 플러스 CD38 마이너스 셀의 단일 셀을 96 개의 우물 중 92개로 정렬합니다. FACS 선별 소프트웨어에서 인덱스 정렬을 활성화하여 각 단일 셀에 대해 CD45RA, CD49F 및 CD90의 면역페노티픽 프로파일을 저장합니다.PCR 증폭에서 선형 도급 제어를 위해 각각 10 및 20 셀로 두 개의 우물을 정렬합니다. 웰스 H1과 H2는 일반적으로 사용됩니다. 템플릿 컨트롤없이 두 개의 우물을 유지, 일반적으로 우물 H3와 H4. 선명한 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 300배 의 중력으로 1분 동안 회전시합니다.스냅은 마른 얼음에 접시를 동결. 그런 다음 영하 80도에서 보관하십시오. 대조RNA에서 스파이크된 2회 반응 믹스 632.5 마이크로리터, 101.2 마이크로리터 Taq/SuperscriptIII, 151.8 마이크로리터 프라이머 믹스, 0.7 마이크로리터를 첨가하여 역전사 및 특정 표적 증폭 믹스를 만듭니다.용액을 소용돌이치고 아래로 회전하여 튜브 바닥에 있는 액체를 수집합니다. 샘플에 추가 될 준비가 될 때까지 얼음에 믹스를 유지합니다. 다음으로, 얼음에 용해 판을 해동.이전에 준비된 역전사 및 특정 표적 증폭 믹스의 8.75 마이크로리터를 선형성 및 템플릿 컨트롤 없음을 포함하여 92개의 우물에 추가합니다. 나머지 4개의 우물에 역전사 제어 믹스가 없는 8.75 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 명확한 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉하고 바닥에 액체를 수집하기 위해 판을 회전.프리앰프 프로그램에 따라 PCR 기계에서 플레이트를 실행하여 역전사 및 특정 표적 증폭을 수행합니다. 분석 적재 판을 96웰 플레이트의 각 웰에 분석 적재 시약 3마이크로리터를 배관하여 준비합니다. 각 프라이머의 마이크로리터 3개를 분석 적재 플레이트의 개별 우물에 추가합니다.접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 아래로 회전. 플레이트를 회전한 후, 뉴클레아제 자유물의 8마이크로리터를 96웰 플레이트의 모든 우물로 배관하여 희석판을 준비한다. 희석 플레이트에 증폭된 시료 2개를 추가합니다.접착제 필름으로 접시를 밀봉합니다. 접시를 10초 동안 소용돌이로 섞는다. 그런 다음 접시를 아래로 회전합니다.다음으로, 35.2 마이크로리터의 마스터 믹스를 35.2 마이크로리터의 시료 로딩 시약과 신중하게 혼합하여 시료 적재 믹스를 준비한다. 96웰 플레이트의 각 웰에 3.3 마이크로리터의 적재 믹스를 알리싱하여 시료 적재 플레이트를 준비한다. 희석된 샘플에서 2.7 마이크로리터를 샘플 로딩 플레이트의 각 웰에 넣습니다.접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 아래로 회전. 96 마이크로 유체 칩에 의해 새로운 96을 꺼내. 캡이 달린 주사기로 입구를 찔러 서 서 움직일 수 있는지 확인합니다.칩을 45도로 기울이고 밸브를 누르는 동안 각 밸브에 주사기의 전체 볼륨을 추가합니다. IFC 컨트롤러로 칩을 프라임합니다. 각 분석 입구에 4.25 마이크로리터를 적재하여 각 우물에서 분석 적재 플레이트에 적재하고 거품을 피하십시오.거품이 우물에 나타나면 파이펫 팁으로 제거합니다. 시료 적재 판의 각 우물에서 4.25 마이크로리터로 각 샘플 입구를 계속 적재하고 거품을 피하고 피펫 팁으로 거품이 제거되는 것처럼 보입니다. 통합 유체 회로 컨트롤러 또는 IFC 컨트롤러로 칩을 로드합니다.칩이 균일하게 보이고 모든 챔버가 로드되었는지 확인합니다. 테이프로 터치하여 칩 표면에서 먼지를 제거합니다. 마지막으로, 멀티플렉스 미세 유체 유전자 발현 플랫폼에서 칩을 실행한다.성공적인 실행의 열 맵은 약 7~25개의 CD의 강력한 신호로 샘플 전체의 균일하게 확산된 식을 표시합니다. 제어 RNA에서 스파이크의 이 증폭 곡선은 모든 우물이 거의 또는 전혀 변이없이 약 10 CT의 명확한 발현을 가지고 있음을 확인, 사전 증폭 및 qPCR 반응이 모든 세포에 성공했다는 것을 검증. 치수 감소를 사용하여 세포 그룹 간의 유사성을 시각화하는 원리 성분 분석 또는 PCA는 4개의 하위 그룹을 식별하는 여기에서 분자적으로 구별되는 세포의 클러스터를 구별하는 데 유용할 수 있다.다른 분자 클러스터에서 세포의 면역 페노형을 식별하려면 인덱스 FCS 파일을 FlowJo에 로드합니다. 스크립트 편집기를 열고 인덱스 스크립트를 붙여 넣은 다음 실행을 누릅니다. 각 셀은 이제 별도의 게이트에 있게 됩니다.각 셀을 레이아웃 편집기에 추가하고 파일 sample_complete_data.xls 사용할 수 있는 SCXV의 분자 정의 그룹에 따라 색상을 지정합니다. FACS 플롯은 군집을 구별하고 기능 분석을 위해 이를 격리하는 데 사용할 수 있는 조혈 줄기 세포 마커 CD90 및 CD45RA에 대한 세포 표면 마커 발현을 보여준다. 이 절차에 따라, 새로 발견 된 하위 집단의 RNA 시퀀싱 또는 시험관 내 및 생체 내 실험과 같은 다른 기술은 분자 메커니즘이 이 이질성을 일으키는 원인이 되는 것과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있으며 하위 집단은 기능적으로 어떻게 다른지.이 전략은 연구원이 정상 및 악성 조혈증에서 이질성을 조사할 뿐만 아니라 발견 된 하위 집단을 장래 분리하여 추가 연구를 하는 데 사용할 수있는 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...