Name: expression and purification of mammalian bestrophin ion channels
Uploaded: 2018-08-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels at JoVE.com

הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH EY025290, GM127652, אוניברסיטת רוצ'סטר סטארט-אפ מימון.

1. הפקת BacMam ביטוי Baculoviruses
<ol><li>להכניס את רצף קידוד של חלבון bestrophin בתרבית של הרצוי פג BacMam וקטור18 עם רצף זיהוי פרוטאז וירוס לחרוט טבק (אס), ואחריו GFP-10 x שלו-תג-קצה קרבוקסילי של החלבון.</li>
	<li>Transiently transfect את פלסמיד ביטוי לתוך דבק HEK293 תאים19,20,<sup class=...

<ol>
	<li>Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+bestrophins:+multifunctional+membrane+proteins+linked+to+best+disease+and+other+retinopathies.">Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies.</a> Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin,+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+a+novel+gene,+VMD2,+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best's+disease).">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li><li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy.">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1's+essential+role+in+mediating+Ca2+-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE.">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Tsunenari, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+bestrophin+family+of+anion+channels.">Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).</li><li>Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+insights+into+the+function+of+a+Ca(2+)-activated+Cl(-)+channel.">Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel.</a> Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels.">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li><li>Johnson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin+1+and+retinal+disease.">Bestrophin 1 and retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).</li><li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies.">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).</li><li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans.">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein,+bestrophin-1,+cause+retinitis+pigmentosa.">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).</li><li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best+disease)+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration.">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).</li><li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+(ADVIRC).">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li><li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEST1:+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies.">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li><li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells.">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers.">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nature Communications. 4, 2540 (2013).</li><li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2+-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A/16B+Ca2+-gated+Cl-+channels.">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li><li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2/CaV2.2+channels.">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).</li><li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels.">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).</li><li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rem,+a+member+of+the+RGK+GTPases,+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase.">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+and+cross-linking+mass+spectrometry+(CX-MS)+for+structural+elucidation+of+large+protein+assemblies.">Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies.</a> Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).</li><li>Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+and+development+for+rare+genetic+disorders.">Drug discovery and development for rare genetic disorders.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר צינור שימושי עבור הביטוי ולטיהור bestrophin בתרבית של תעלות יונים שישמש עבור ניתוחים עתידיים במבחנה . בעוד המכשיר FPLC נדרש עבור גודל-הדרה כרומטוגרפיה, מזרק משאבה מספיקה עבור כל השלבים של כרומטוגרפיית זיקה כולל איגוד, שטיפה ו- eluting. בעת שימוש משאבת מזרק כדי לדחוף פתרונות (מזר...

Bestrophins הם משפחה של תעלות יונים והתפאורה דרך מינים שונים של חיידקים בני אדם1. בבני אדם, הגן BEST1 הממוקם על כרומוזום 11q12.3, מקודד חלבון הממברנה Bestrophin-1 (BEST1) מתבטאת בעיקר קרום basolateral של הפיגמנט ברשתית תאי אפיתל (RPE) של העיניים2,3 ,4. מורכבת של חומצות אמינו 585, הראשון ~ 350 מהם מאוד נשמרים בין המינים ומכילים את אזור transmembrane, BEST1 משמש CaCC בני האדם-1,-5,-6. יתר על כן, את homologs BEST1 בעופות וגם קלבסיאלה pneumoniae לפעול homopentamers7,8, מציע רמה גבוהה של שימור לאורך כל האבולוציה.
בבני אדם, מעל 200 מוטציות בגן BEST1 קלינית קושרו לקבוצה של מחלות ניוון רשתית הנקראת bestrophinopathies1,9. דווחו חמש bestrophinopathies ספציפיים, כולל מחלת הטוב ביותר, ניוון שרירים בגיל מבוגר vitelliform, vitreoretinochoroidopathy אוטוזומלית דומיננטית, אוטוזומלית bestrophinopathy רצסיבי רטיניטיס פיגמנטוזה3,4 ,10,11,12,13,14. מחלות אלו, אשר להוביל ירד ראייה ועיוורון אפילו, הם כיום חשוכת. על מנת לפתח טיפולים רפואיים ותרופות פוטנציאל אישי, זה קריטי להבין כמה מוטציות גורמי מחלות אלה BEST1 להשפיע על תפקוד ומבנה של ערוץ BEST115. לענין זה, חוקרים צריך להשיג את ערוצי bestrophin מטוהרים (פראי סוג ו/או חשבונאי) ולנהל במבחנה ניתוחים5,8.
הצעד הראשון מפתח היא הביטוי של bestrophin ערוצים מכל המינים העליונים בתאי יונקים. התמרה חושית baculovirus של תאים HEK293-F (מערכת BacMam) היא שיטה חזקה לבטא heterologously קרום חלבונים16,17, פרוטוקול זה מנצל וקטור BacMam אופטימיזציה (pEG BacMam) לביטוי חזקים של יעד חלבון18, אשר במקרה הזה הוא homolog bestrophin יונקים. וקטור זה שימש עבור הביטוי של קרום חלבונים שונים, כולל G-חלבון בשילוב קולטנים, רצפטורים גרעיניים אחרים יון ערוצי18. יש גם ראיות כי החלבונים המיוצרים מתאימים קריסטלוגרפיה18. עם רמות גבוהות של הביטוי בתאים HEK293-F, החלבונים ואז יטוהר באמצעות כרומטוגרפיה; באופן ספציפי, במקרה של bestrophins, זיקה וגם גודל הוצאת גזים יכול לשמש.
לאחר פרוטוקול זה הוא מכויל עבור ערוץ bestrophin, חלבון מטוהרים ניתן ואז לנתח אותם עבור הפונקציה שלה מבנה דרך מישורי ליפידית, קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, בהתאמה5,8. בסך הכל, שיטות אלה מספקים צינור חזק חקירות פונקציונלי ומבניים של bestrophins, תעלות יונים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC327265000&#160;</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC446212500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC301870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC197530010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA4058704&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ63039MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leupeptin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ61188MB&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepstatin A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ20037MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC215740050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DDM sol-grade</td>
			<td style="width:148px;">Anatrace</td>
			<td style="width:119px;">D310S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DDM anagrade</td>
			<td style="width:148px;">Anatrace</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sf-900 II SFM</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10902179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12338018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High pressure homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">Avestin</td>
			<td style="width:119px;">Emulsiflex-C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap column</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td>17-5248-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex-200 column</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AKTA Pure</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-15 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-4 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC810024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-0.5 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC505024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-PROTEAN precast gel</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PolyJet transfection reagent</td>
			<td style="width:148px;">SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEG BacMam vector</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of mammalian bestrophin ion channels

הגנום האנושי מקודד ארבע paralogs bestrophin, כלומר BEST1, BEST2, BEST3 ו BEST4. BEST1, מקודדת על ידי הגן BEST1 , היא Ca2 +-מופעל Cl– ערוץ (CaCC) המתבטא בעיקר אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). החשיבות פיזיולוגיים ופתולוגיים של BEST1 מודגש על ידי העובדה כי מעל 200 מוטציות שונות בגן BEST1 קושרו מבחינה גנטית לקשת של פחות חמישה הפרעות ניווניות ברשתית, כמו vitelliform הטוב ביותר ניוון מקולרי (מחלת הטובה ביותר). לכן, הבנת את ביופיזיקה של ערוצי bestrophin ברמת מולקולה בודדת בעל חשיבות עליונה. עם זאת, קבלת תעלות יונים יונקים מטוהרים מהווה לעיתים קרובות משימה מאתגרת. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול עבור הביטוי של bestrophin בתרבית של חלבונים עם מערכת העברת גנים baculovirus BacMam וטיהור שלהם על ידי זיקה ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. החלבונים מטוהרים יש פוטנציאל להיות מנוצל עוקבות ניתוחים פונקציונליים ומבניים, כגון הקלטה אלקטרופיזיולוגיות השומנים bilayers ו קריסטלוגרפיה. חשוב לציין, צינור זה ניתן להתאים ללמוד את פונקציות והמבנים של תעלות יונים אחרים.

עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתאים transiently transfected דבק HEK293 (איור 1 א') הוא אינדיקטור טוב עבור רמת ביטוי חלבון המוקרנת בתאים HEK293-F ההשעיה (איור 1B). אם החלבון היעד אינה ביטוי היטב או הוא בזיהוי שגיאות מקומי בתאים HEK293 לאחר ארעי תרביות תאים, מומלץ לשקול ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels at JoVE.com

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

הטיהור של תעלות יונים היא לעתים קרובות מאתגרת, אבל ברגע מושגת, זה יכול העלול לאפשר במבחנה חקירות פונקציות ומבנים של הערוצים. כאן, אנו מתארים את נהלי stepwise הביטוי ואת טיהור bestrophin בתרבית של חלבונים, משפחה של Ca2 +-הפעלת ערוצי Cl– .

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

מדידת ריכוז יון בשכבת הגבול Unstirred עם תיקון פתוח-קלאמפ פיפטה: השלכות בשליטה של תעלות יונים על ידי נוזל לזרום

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...