Name: co-immunoprecipitation assay using endogenous nuclear proteins from cells cultured under hypoxic conditions
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions at JoVE.com

우리는 hypoxia 워크스테이션의 사용에 대 한 assoc. 교수 죄 Tiong 옹 감사합니다. 이 작품은 다음에 의해 지원 되었다: 싱가포르의 교육부, 모 1T1-02/04 MOE2015-t 2-2-087 (Y.A.)를, 의학, 난 양 기술 대학 시작 하기 위해 그랜트를 M4230003 (P.O.B.)의 리 홍콩 Chian 학교 스웨덴 연구 위원회는 가족 Erling 페르손 재단, Novo Nordisk 기초, Stichting af Jochnick 재단, 스웨덴 당뇨병 협회, Scandia 보험 회사, 당뇨병 연구와 복지 재단, 정박 폰 Kantzow의 기초는 카롤 린스 카 Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단에서 당뇨병에 전략적 연구 프로그램.

인간 미 발달 신장 293A를 사용 하 여이 프로토콜 섹션 (HEK293A) 셀 s 난 양 기술 대학교, 싱가포르에서 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1입니다. HEK293A 세포에서 산소의 유도
<ol><li>준비 4 10 cm 요리와 씨 3-5 Dulbecco의 수정 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 2 m L-글루타민, m이 글의 중간 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당) 10 mL에 접시 당 106 HEK293A 셀 x 110 mg/L 나트륨 pyruvate, 100...

<ol>
	<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factors+in+physiology+and+medicine.">Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine.</a> Cell. 148 (3), 399-408 (2012).</li><li>Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+inflammation+are+two+sides+of+the+same+coin.">Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).</li><li>Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization,+DNA+binding,+and+transactivation+properties+of+hypoxia-inducible+factor+1.">Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia.">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li><li>Kallio, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+in+hypoxic+cells:+Inducible+nuclear+translocation+and+recruitment+of+the+CBP/p300+coactivator+by+the+hypoxia-inducible+factor-1alpha.">Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha.</a> EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).</li><li>Ke, Q., Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1+(HIF-1).">Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1).</a> Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).</li><li>Gustafsson, M. 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L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+promotes+nuclear+translocation+and+transcriptional+function+in+the+oncogenic+tyrosine+kinase+RON.">Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON.</a> Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).</li><li>Moriya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+nature+of+overexpression+experiments.">Quantitative nature of overexpression experiments.</a> Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).</li><li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+overexpression:+Uses,+mechanisms,+and+interpretation.">Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation.</a> Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Notch-independent+mechanism+contributes+to+the+induction+of+Hes1+gene+expression+in+response+to+hypoxia+in+P19+cells.">A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells.</a> Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).</li><li>Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+assays+for+detection+and+characterization+of+protein+antimicrobials.">Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials.</a> J Vis Exp. (110), e53819 (2016).</li><li>Chilov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factor-1+(HIF-1):+heterodimerization+with+ARNT+is+not+necessary+for+nuclear+accumulation+of+HIF-1alpha.">Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).</li><li>Yin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arylsulfonamide+KCN1+inhibits+in+vivo+glioma+growth+and+interferes+with+HIF+signaling+by+disrupting+HIF-1alpha+interaction+with+cofactors+p300/CBP.">Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP.</a> Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).</li><li>Holmquist-Mengelbier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIF-1alpha+and+HIF-2alpha+to+common+target+genes+is+differentially+regulated+in+neuroblastoma:+HIF-2alpha+promotes+an+aggressive+phenotype.">Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype.</a> Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).</li><li>Koh, M. Y., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passing+the+baton:+The+HIF+switch.">Passing the baton: The HIF switch.</a> Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).</li><li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization.">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li><li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia.">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li><li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperate+house+genes':+The+dramatic+example+of+hypoxia.">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li></ol>

HIF 1 복잡 한 세포 산소 항상성의 마스터 레 귤 레이 터 이며 hypoxia 다른 세포질 적응 응답에 관련 된 유전자의 과다를 조절 합니다. 소설 HIF 1 상호 작용 단백질의 식별 hypoxic 신호 변환의 이해를 위해 중요 하다. Co immunoprecipitation 실험 세포 신호 변환 통로 윤곽을 그리 다 PPIs 연구 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 단백질 overexpression 여전히 널리 사용 되 고이 실험 부작용으로 이어질 수 있습니다. ?...

Hypoxia는 부적당 한 산소 세포와 신체의 조직에 제공 될 때 발생 합니다. 그것은 줄기 세포 분화, 염증 및 암1,2등 다양 한 생리 및 병리학 프로세스에서 중요 한 역할을 한다. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 (HIFs) heterodimers는 산소 레 귤 레이트 된 α 소 단위와 constitutively 표현된 β 소 단위 라고도 ARNT3의 구성으로 작동 합니다. HIF α 소 단위 (HIF 1α, HIF 2α 및 HIF 3α) 및 3 개의 HIF β 소 단위 (ARNT/HIF-1β, ARNT2 및 ARNT3)의 3 개의 isoforms 날짜 확인 되었습니다. HIF 1α 및 ARNT는 표현 편 반면 HIF 2α, HIF-3α, ARNT2 및 ARNT3는 더 제한 된 표현 패턴4. 복잡 한 HIF 1 단백질은 저 산소 증 응답의 키 레 귤 레이 터 이다. Hypoxic 조건 하에서 HIF 1α 안정 된다, 핵에 translocates 그리고 ARNT5dimerizes. 그 후,이 복잡 한 저 산소 증 응답 성분 (HREs)으로 알려진 특정 뉴클레오티드를 한다 신생, 적혈구 및 분해6을 포함 하 여 다양 한 프로세스에 관련 된 타겟 유전자의 표현을 규제. 이 "정식" 응답 뿐만 아니라 hypoxia 신호 통로 또한 알려져 누화를 노치 등 핵 인자-카파 B (NF κB) 통로 신호 하는 여러 세포 응답7,8,9.
소설 HIF 1 상호 작용 단백질의 식별 통로 신호 하는 산소의 더 나은 이해를 위해 중요 하다. ARNT 산소 수준에 둔감 하 고 constitutively 표현 되는 달리 HIF 1α 단백질 수준 세포 산소 수준에 의해 밀접 하 게 통제 된다. Normoxia (21% 산소), HIF 1α 단백질은 빠르게 저하10,11. Normoxia에서 HIF 1α의 짧은 반감기에는 HIF 1α 상호 작용 단백질의 식별을 위해 뿐만 아니라 셀 추출에서 단백질의 검출에 대 한 특정 기술적인 도전을 선물 한다. 또한, 여러 전사 인자 HIF 1 단지 포함 한 hypoxic 조건12,13,14에서 핵으로 이동. PPI 연구에 사용 되는 현재 방법의 대부분은 단백질의 생리 적 비 overexpression를 사용 하 여 수행 됩니다. 이러한 단백질 overexpression 리소스 오버 로드, 화학 량 론 불균형, 무차별 상호 작용 및 통로 변조15,16를 포함 하 여 여러 메커니즘을 통해 다른 세포 결함을 일으킬 수 보고 되었습니다. PPI 연구에서 단백질 overexpression 거짓 긍정적인, 또는 심지어 거짓 부정, 단백질 속성과 overexpressed 단백질의 기능에 따라 결과 발생할 수 있습니다. 따라서, PPI 연구에 대 한 현재 메서드 hypoxic 조건 하에서 순수 관련 PPIs를 공개 하기 위해 수정할 수 있다. 우리는 이전 HIF 1 Ets 가족 녹음 방송 요인 조지아-의무적인 단백질 (GABP) hypoxic P19 셀에서 hypoxia17 Hes1 발기인의 반응에 기여 하는 상호 작용을 시연 했다. 여기, 우리는 hypoxic 조건 하에서 생 핵 단백질 사이의 PPIs를 공부 하는 공동-immunoprecipitation 프로토콜을 설명 합니다. HIF 1α ARNT의 상호작용 개념의 증거로 서 표시 됩니다. 이 프로토콜은 hypoxic 조건 transcriptional 공동 규제 및 녹음 방송 요인 사이 상호 작용을 보여주는 적합 하지에 국한 HIF 1 상호 작용 단백질의 id.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4&#160;</td>
			<td style="width:161px;">1st BASE</td>
			<td style="width:135px;">1415</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Protein A/G Sepharose beads</td>
			<td style="width:161px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">ab193262</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Natural Mouse IgG protein</td>
			<td style="width:161px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">ab198772</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610729</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610737</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610710</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Nitrocellulose Membrane &#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1620112</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Blotting-Grade Blocker</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1706404</td>
			<td style="width:229px;">Non-fat dry milk for western blotting applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10x Tris Buffered Saline (TBS)</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1706435</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10% Tween 20</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610781</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610732</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10x Tris/Glycine Buffer&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610771</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610374</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:135px;">7074</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:135px;">7076</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">SignalFire ECL Reagent</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:135px;">6883</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21-030-CV</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:161px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:135px;">52332</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ARNT/HIF-1 beta Antibody&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">NB100-124&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Concentration: 1.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">HIF-1 alpha Antibody</td>
			<td style="width:161px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">NB100-479</td>
			<td style="width:229px;">Concentration: 1.0 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">YY1 Antibody</td>
			<td style="width:161px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">NBP1-46218</td>
			<td style="width:229px;">Concentration: 0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Qproteome Nuclear Protein Kit</td>
			<td style="width:161px;">Qiagen</td>
			<td style="width:135px;">37582</td>
			<td style="width:229px;">Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">GAPDH Antibody</td>
			<td style="width:161px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:135px;">sc-47724</td>
			<td style="width:229px;">Concentration: 0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol (&#8805;99%)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NP-40</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">127087-87-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">HEK293A cell line</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">R70507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Methanol&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Pierce Protease Inhibitor Tablets&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">88660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">QSP gel loading tip&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">QSP#010-R204-Q-PK</td>
			<td>1-200 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Equipment/Instrument</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1703932</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:279px;">Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot&#160;Module and PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1658034</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">4561083</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ChemiDoc XRS+ System</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1708265</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">I-Glove</td>
			<td style="width:161px;">BioSpherix</td>
			<td style="width:135px;">I-Glove</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BioTek</td>
			<td style="width:135px;">BTS1LFTA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Costar 5mL Stripette Serological Pipets</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">4487</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Costar 10mL Stripette Serological Pipets</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">4488</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Costar 25mL Stripette Serological Pipets</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">4251</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">3631</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">352095</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Small Cell Scraper</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">3010</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Gilson&#160;Pipetman L 4-pipettes kit&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Gilson</td>
			<td style="width:135px;">F167370</td>
			<td style="width:229px;">P2, P20, P200, P1000 and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:161px;">Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td style="width:135px;">616201</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PIPETBOY acu 2 Pipettor</td>
			<td style="width:161px;">INTEGRA Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">155 000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets</td>
			<td style="width:161px;">Justrite Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:135px;">896000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:161px;">Labnet</td>
			<td style="width:135px;">S0200</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:161px;">NuAire</td>
			<td style="width:135px;">NU-5820</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Orbital shakers</td>
			<td style="width:161px;">Stuart</td>
			<td style="width:135px;">SSL1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tube rotator SB3</td>
			<td style="width:161px;">Stuart</td>
			<td style="width:135px;">SB3</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">MicroCL 21R Microcentrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">75002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">69580</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">LSE Digital Dry Bath Heaters</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">1168H25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Thermo Scientific&#160;1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">13-261-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Software</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Image Lab Software</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1709691</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay using endogenous nuclear proteins from cells cultured under hypoxic conditions

낮은 산소 수준 (hypoxia) 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 1 (HIF 1) 복잡 한 마스터 레 귤 레이 터 역할 적응 응답의 다양 한 트리거. HIF 1는 heterodimeric 산소 레 귤 레이트 된 α 소 단위 (HIF-1α)의 구성 및 constitutively β 소 단위 (HIF-1β)로 알려진 aryl 탄화수소 수용 체 핵 translocator (ARNT), 신생을 포함 한 다양 한 프로세스에 관련 된 유전자 조절 표현 적혈구 및 분해. HIF 1 상호 작용 단백질의 id 신호 전달 경로 hypoxia의 이해에 열쇠 이다. HIF 1α 안정성의 규제 외 hypoxia 또한 ARNT HIF 1α 등 많은 녹음 방송 요인의 핵 전 좌를 트리거합니다. 특히, 같은 단백질 단백질 상호 작용 (PPIs)를 공부 하는 데 사용 하는 현재 방법의 대부분은 단백질 overexpression 통해 단백질 레벨은 인위적으로 증가 하는 시스템 기반으로 합니다. 종종 단백질 overexpression 시간적, 공간적 유물에서 발생 하는 비 생리 적 결과를 리드. 여기 우리가 설명 하는 수정 된 co immunoprecipitation 생 핵 단백질를 사용 하 여 저 산소 증 치료 하 고 개념, HIF 1α와 ARNT 간의 상호 작용을 보여 증명 프로토콜. 이 프로토콜에 hypoxic 세포 hypoxic 조건 하에서 수확 했다 및 Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS) 워시 버퍼는 또한 복잡 한 단백질 또는 단백질 저하를 완화 하기 위해 사용 하기 전에 hypoxic 조건에 미리 equilibrated reoxygenation 중 분리입니다. 또한, 핵 분수 이후에 집중 하 고 내 생 핵 단백질 안정화 고 단백질 overexpression 동안 자주 본 가짜 결과 방지 추출 되었다. 이 프로토콜은 녹음 방송 요인과 hypoxic 조건 transcriptional 공동 레 귤 레이 터 간의 내 인 성 및 기본 상호 작용을 보여 주기 위해 사용할 수 있습니다.

Hypoxia, 식에 세포질 응답을 평가 하는 수준 및 HIF 1 복잡 한 다음 산소 치료의 구성 요소의 subcellular 지 방화 시험 되었다. HEK293A 셀 4 h hypoxic 조건 하에서 경작 또는 normoxia 컨트롤로 유지. HIF 1α 및 ARNT 단백질 수준 전체 셀에 시험 되었다 또는 서쪽 오 점 여 핵/세포질 추출. 으로 예상, 총 HIF 1α 레벨 upregulated hypoxia, 여 총 세포 lysates ARNT 수준을 크게 없었던 반면 (<strong class="xf...

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Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

여기는 hypoxic 조건 하에서 생 핵 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하는 공동-immunoprecipitation 프로토콜에 설명 합니다. 이 메서드는 hypoxia에서 transcriptional 공동 규제 및 녹음 방송 요인 사이 상호 작용의 데모에 적합 합니다.

Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

연구

생물학

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

내생 와일드 타입 BRCA1을 표현 세포를 사용하는 동종 재조합에 BRCA1 변이의 효과를 확인

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

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Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

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