Name: co-immunoprecipitation assay using endogenous nuclear proteins from cells cultured under hypoxic conditions
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions at JoVE.com

Agradecemos o Prof Assoc. Sin Tiong Ong para a utilização da estação de hipóxia. Este trabalho foi apoiado pelo seguinte: Singapura Ministério da educação, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (para cá), Lee Kong Chian da faculdade de medicina, Universidade Tecnológica de Nanyang arranque grant M4230003 (p.o.b.), o Conselho Sueco de pesquisa, o Erling Persson Fundação da família, a Novo Nordisk Foundation, o Stichting af Jochnick Foundation, associação sueca de Diabetes, a companhia de seguros Scandia, a pesquisa do Diabetes e Wellness, Fundação do cais von Kantzow, o Programa de investigação estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet, a ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e a Fundação de Wallenberg Alice e Knut.

Esta seção de protocolo, que usa o rim embrionário humano 293A célula (HEK293A), s segue as diretrizes do Comitê de ética pesquisa humana em Nanyang Technological University, Singapore.
1. indução de hipóxia em células HEK293A
<ol><li>Prepare-se quatro pratos de 10cm e sementes de 3 – 5 x 106 HEK293A células por prato em 10 mL Dulbecco modificado suplementado do Eagle (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio d...

<ol>
	<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factors+in+physiology+and+medicine.">Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine.</a> Cell. 148 (3), 399-408 (2012).</li><li>Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+inflammation+are+two+sides+of+the+same+coin.">Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).</li><li>Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization,+DNA+binding,+and+transactivation+properties+of+hypoxia-inducible+factor+1.">Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia.">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li><li>Kallio, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+in+hypoxic+cells:+Inducible+nuclear+translocation+and+recruitment+of+the+CBP/p300+coactivator+by+the+hypoxia-inducible+factor-1alpha.">Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha.</a> EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).</li><li>Ke, Q., Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-1+(HIF-1).">Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1).</a> Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).</li><li>Gustafsson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+requires+notch+signaling+to+maintain+the+undifferentiated+cell+state.">Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state.</a> Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+factor+inhibiting+HIF-1+defines+an+additional+mode+of+cross-coupling+between+the+Notch+and+hypoxia+signaling+pathways.">Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).</li><li>D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+HIF+crosstalk+in+immune+responses.">NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses.</a> FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).</li><li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension.">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+regulation+of+degradation+of+hypoxia-inducible+factor+1+alpha:+Role+of+subcellular+compartmentalization.">Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization.</a> Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).</li><li>Depping, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factors+(HIFs):+involvement+of+the+classical+importin+alpha/beta+pathway.">Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+oncogene+yes-associated+protein+1+nuclear+translocation+to+promote+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+invasion+via+epithelial-mesenchymal+transition.">Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition.</a> Tumour Biol. 39 (5), (2017).</li><li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+promotes+nuclear+translocation+and+transcriptional+function+in+the+oncogenic+tyrosine+kinase+RON.">Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON.</a> Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).</li><li>Moriya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+nature+of+overexpression+experiments.">Quantitative nature of overexpression experiments.</a> Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).</li><li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+overexpression:+Uses,+mechanisms,+and+interpretation.">Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation.</a> Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Notch-independent+mechanism+contributes+to+the+induction+of+Hes1+gene+expression+in+response+to+hypoxia+in+P19+cells.">A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells.</a> Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).</li><li>Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+assays+for+detection+and+characterization+of+protein+antimicrobials.">Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials.</a> J Vis Exp. (110), e53819 (2016).</li><li>Chilov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factor-1+(HIF-1):+heterodimerization+with+ARNT+is+not+necessary+for+nuclear+accumulation+of+HIF-1alpha.">Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).</li><li>Yin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arylsulfonamide+KCN1+inhibits+in+vivo+glioma+growth+and+interferes+with+HIF+signaling+by+disrupting+HIF-1alpha+interaction+with+cofactors+p300/CBP.">Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP.</a> Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).</li><li>Holmquist-Mengelbier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIF-1alpha+and+HIF-2alpha+to+common+target+genes+is+differentially+regulated+in+neuroblastoma:+HIF-2alpha+promotes+an+aggressive+phenotype.">Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype.</a> Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).</li><li>Koh, M. Y., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passing+the+baton:+The+HIF+switch.">Passing the baton: The HIF switch.</a> Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).</li><li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization.">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li><li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia.">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li><li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperate+house+genes':+The+dramatic+example+of+hypoxia.">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li></ol>

O complexo HIF-1 é um mestre regulador da homeostase celular oxigênio e regula uma infinidade de genes envolvidos em diferentes respostas adaptativas celulares à hipoxia. Identificação de novas proteínas de interação de HIF-1 é importante para a compreensão da transdução de sinal de hipoxia. Co-imunoprecipitação experimentos são comumente usados para estudos de IPP para delinear as vias de transdução de sinal de celular. No entanto, superexpressão de proteínas é ainda amplamente utilizada e isso pode ...

Hipóxia ocorre quando insuficiente oxigênio é fornecido para as células e tecidos do corpo. Desempenha um papel crítico em vários processos fisiológicos e patológicos, tais como a diferenciação de células-tronco, inflamação e câncer1,2. Hypoxia-inducible fatores (transplanta) funcionam como heterodímeros, compostos por uma subunidade α oxigênio-regulado e uma subunidade β constitutivamente expressa ARNT também conhecido como3. Até à data, foram identificadas três isoformas de três subunidades de HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) e as subunidades de HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3α). HIF-1 α e ARNT ubiquitously são expressos, Considerando que o HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 e ARNT3 têm mais restrito de padrões de expressão4. A complexo de proteína HIF-1 é o regulador chave da resposta hipoxia. Em condições de hipóxicos, HIF-1 α torna-se estabilizado, então translocates ao núcleo e dimeriza com ARNT5. Posteriormente, este complexo liga de nucleotídeos específicos conhecidos como elementos responsivos de hipóxia (HREs) e regula a expressão de genes-alvo envolvidos nos diversos processos, incluindo a angiogênese, eritropoiese e glicólise6. Além desta resposta "canônica", a via de sinalização de hipóxia é também conhecida por crosstalk com múltiplas resposta celular, sinalização de vias como entalhe e Nuclear Factor-kappa B (NF-κB)7,8,9.
A identificação das proteínas de interação romance HIF-1 é importante para uma melhor compreensão da hipóxia via de sinalização. Em contraste com ARNT, que é insensível aos níveis de oxigênio e constitutivamente expressa, níveis de proteína HIF-1 α estão fortemente regulamentados pelos níveis de oxigênio celular. No normoxia (21% de oxigênio), proteínas de HIF-1 α são rapidamente degradadas10,11. A meia-vida curta de HIF-1 α no normoxia apresenta desafios técnicos específicos para a deteção da proteína da célula extratos, bem como para a identificação das proteínas HIF-1 α-interagindo. Além disso, vários fatores de transcrição, incluindo aqueles do complexo HIF-1 translocar para o núcleo sob condições de hipóxia12,13,14. A maioria dos atuais métodos utilizados para estudos PPI é executada usando não-fisiológica superexpressão de proteínas. Tal superexpressão da proteína foi relatado para causar defeitos celulares diferentes através de vários mecanismos, incluindo a sobrecarga de recursos, desequilíbrio estequiométrico, interações promíscuas e via modulação15,16. Em termos de estudos PPI, a superexpressão da proteína pode levar a falso negativo positivo, ou mesmo falso, resultados, dependendo das propriedades da proteína e funções das proteínas Blumental. Portanto, os métodos atuais para estudos PPI tem que ser modificado a fim de revelar o IPP fisiologicamente relevantes sob condições de hipoxia. Nós demonstramos anteriormente a interação entre o HIF-1 e o fator de transcrição família Ets GA-proteína (GABP) em células de P19 hipóxicos, que contribui para a resposta do promotor Hes1 à hipóxia17. Aqui, descrevemos um co-imunoprecipitação para estudar PPIs entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. A interação entre o HIF-1 α e ARNT é mostrada como uma prova de conceito. Este protocolo é apropriado para demonstrar as interações entre os fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos, incluindo mas não limitado à identificação das proteínas de interação de HIF-1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Material</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4&#160;</td>
			<td style="width:161px;">1st BASE</td>
			<td style="width:135px;">1415</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Protein A/G Sepharose beads</td>
			<td style="width:161px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">ab193262</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Natural Mouse IgG protein</td>
			<td style="width:161px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">ab198772</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">EDTA</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610729</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610737</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610710</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Nitrocellulose Membrane &#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1620112</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Blotting-Grade Blocker</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1706404</td>
			<td style="width:229px;">Non-fat dry milk for western blotting applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10x Tris Buffered Saline (TBS)</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1706435</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10% Tween 20</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610781</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610732</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">10x Tris/Glycine Buffer&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610771</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1610374</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:135px;">7074</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:135px;">7076</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">SignalFire ECL Reagent</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:135px;">6883</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">21-030-CV</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:161px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:135px;">52332</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ARNT/HIF-1 beta Antibody&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">NB100-124&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Concentration: 1.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">HIF-1 alpha Antibody</td>
			<td style="width:161px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">NB100-479</td>
			<td style="width:229px;">Concentration: 1.0 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">YY1 Antibody</td>
			<td style="width:161px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">NBP1-46218</td>
			<td style="width:229px;">Concentration: 0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Qproteome Nuclear Protein Kit</td>
			<td style="width:161px;">Qiagen</td>
			<td style="width:135px;">37582</td>
			<td style="width:229px;">Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">GAPDH Antibody</td>
			<td style="width:161px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:135px;">sc-47724</td>
			<td style="width:229px;">Concentration: 0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol (&#8805;99%)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NP-40</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">127087-87-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">HEK293A cell line</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">R70507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Methanol&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Pierce Protease Inhibitor Tablets&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">88660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">QSP gel loading tip&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">QSP#010-R204-Q-PK</td>
			<td>1-200 uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Equipment/Instrument</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1703932</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:279px;">Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot&#160;Module and PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1658034</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">4561083</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">ChemiDoc XRS+ System</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1708265</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">I-Glove</td>
			<td style="width:161px;">BioSpherix</td>
			<td style="width:135px;">I-Glove</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BioTek</td>
			<td style="width:135px;">BTS1LFTA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Costar 5mL Stripette Serological Pipets</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">4487</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Costar 10mL Stripette Serological Pipets</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">4488</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Costar 25mL Stripette Serological Pipets</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">4251</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">3631</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">352095</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Small Cell Scraper</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">3010</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Gilson&#160;Pipetman L 4-pipettes kit&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Gilson</td>
			<td style="width:135px;">F167370</td>
			<td style="width:229px;">P2, P20, P200, P1000 and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:161px;">Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td style="width:135px;">616201</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PIPETBOY acu 2 Pipettor</td>
			<td style="width:161px;">INTEGRA Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">155 000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets</td>
			<td style="width:161px;">Justrite Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:135px;">896000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:161px;">Labnet</td>
			<td style="width:135px;">S0200</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:161px;">NuAire</td>
			<td style="width:135px;">NU-5820</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Orbital shakers</td>
			<td style="width:161px;">Stuart</td>
			<td style="width:135px;">SSL1</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tube rotator SB3</td>
			<td style="width:161px;">Stuart</td>
			<td style="width:135px;">SB3</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">MicroCL 21R Microcentrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">75002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">69580</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">LSE Digital Dry Bath Heaters</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">1168H25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Thermo Scientific&#160;1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">13-261-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Software</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Image Lab Software</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">1709691</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay using endogenous nuclear proteins from cells cultured under hypoxic conditions

Baixos níveis de oxigênio (hipóxia) desencadear uma variedade de respostas adaptativas com o Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complexos atuando como um regulador de mestre. HIF-1 consiste de uma subunidade α oxigênio-regulado de heterodimérica (HIF-1 α) e constitutivamente expressa a subunidade beta (HIF-1 β) também conhecido como aril hidrocarboneto do receptor nuclear translocator (ARNT), regulação de genes envolvidos em diversos processos, incluindo a angiogênese , eritropoiese e glicólise. A identificação das proteínas de interação de HIF-1 é a chave para a compreensão da hipóxia via de sinalização. Além do Regulamento de HIF-1 α estabilidade, a hipóxia também aciona a translocação nuclear de muitos fatores de transcrição, incluindo HIF-1 α e ARNT. Notavelmente, a maioria dos atuais métodos utilizados para estudar tais interações da proteína-proteína (PPIs) é baseada em sistemas onde os níveis de proteína são artificialmente aumentados através da superexpressão da proteína. Superexpressão da proteína, muitas vezes leva a resultados não-fisiológicos decorrentes de artefatos temporais e espaciais. Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação modificada após o tratamento de hipóxia usando proteínas nucleares endógenas e como uma prova de conceito, para mostrar a interação entre o HIF-1 α e ARNT de protocolo. Neste protocolo, as células hipóxicos foram colhidas em condições de hipóxicos e tampão de lavagem de o Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) também foi previamente equilibrado a hipoxia condições antes do uso para mitigar a degradação de proteína ou proteína complexa dissociação durante a reoxigenação. Além disso, as frações nucleares foram posteriormente extraídas para concentrar e estabilizar proteínas nucleares endógenas e evitar possíveis resultados espúrios muitas vezes vistos durante a superexpressão da proteína. Este protocolo pode ser usado para demonstrar endógenas e nativas de interações entre fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos.

Para avaliar a resposta celular a hipóxia, a expressão de níveis e Localização subcellular dos componentes do tratamento de hipóxia seguir HIF-1 complexo foram examinados. HEK293A as células foram cultivadas em condições de hipóxicos para 4h ou mantidos no normoxia como controles. Níveis de proteína HIF-1 α e ARNT foram examinados no celular ou nuclear/citoplasmática extrai pelo borrão ocidental. Como esperados, totais de níveis de HIF-1 α foram upregulated por hipóxia, ...

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Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação para estudar interações da proteína-proteína entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. Este método é adequado para demonstração das interacções entre factores de transcrição e reguladores transcricionais de co em hipóxia.

Co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Biologia

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

Identificar os efeitos das mutações BRCA1 em Recombinação Homóloga usando células que expressam BRCA1 tipo selvagem endógena

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Anti-Nuclear Antibody Triagem Usando Células HEp-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Aplicações da sonda Individual: Imagem Espectrometria de Massa e Análise única célula sob condições ambientais

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

Dosimetria para Irradiação Celular usando instalações de raios-X ortovoltage (40-300 kV)

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

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Ensaio de fisiologia térmica baseada em campo: recuperação de choque frio em condições ambientais

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