Name: determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins
Uploaded: 2018-06-15T14:45:00
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Ce projet a été soutenu par NPU I, LO1417 (ministère de l’éducation, jeunesse et des Sports de la République tchèque).

1. préparation du matériel biologique
<ol><li>Préparer le matériel biologique exprimant la protéine fluorescent étiquetée d’intérêt, mais aussi un marqueur cytoplasmique. Suivez les procédures mentionnées dans l’Introduction.</li>
</ol>2. confocal Laser Scanning Microscopy
<ol><li>Détachant le matériel préparé à l’article 1 avec FM 4-64 colorant7.<ol>
<li>Appliquer un protocole de coloration qui est approprié pour la matière étudiée....

<ol>
	<li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses.">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li><li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-binding+protein+PCaP2+located+on+the+plasma+membrane+is+involved+in+root+hair+development+as+a+possible+signal+transducer.">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li><li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).</li><li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na/H+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+(GFP)+in+living+PS120+fibroblasts.">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li><li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles:+pertinence+to+myristoylated+proteins.">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li><li>Vosolsob&#283;, S., Petr&#225;&#353;ek, J., Schwarzerov&#225;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins.">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li><li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells.">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development.">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li><li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+a+novel,+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane.">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li><li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure.">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDP25,+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein,+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis.">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li><li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments.">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li><li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+BY-2+Cell+Line+as+the+&amp;#34;HeLa&amp;#34;+Cell+in+the+Cell+Biology+of+Higher+Plants.">Tobacco BY-2 Cell Line as the &amp;#34;HeLa&amp;#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li><li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells.">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li><li>La&#328;kov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy.">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li></ol>

La méthode décrite ici génère une estimation plus précise de la membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées en périphérie par rapport aux autres approches basées sur la mesure des intensités de fluorescence5. L’amélioration majeure de cette méthode est qu’elle prend en compte la diffraction de la lumière et la superposition de la membrane plasmique et les signaux cytoplasmiques. Bien que ces résultats de la méthode sont en corrélation avec les résultats d?...

Protéines de la voie périphérique associée à la membrane plasmique sont les éléments clés des voies de signalisation cellulaire. Un des rôles fondamentaux est leur transitoires plasma membrane association et dissociation, qui est importante pour la transduction du signal entre la membrane plasmique et le cytoplasme. Protéines de la voie périphérique associée à la membrane plasmique peuvent être fixés sur la membrane plasmique par ancres lipidiques (N-myristoylation, S-acylation ou prénylation) ou par domaines de liaison des lipides (interaction avec les phosphates du phosphatidylinositol, l’acide phosphatidique, etc.).
Liaison la membrane plasmique, les propriétés de ces protéines peuvent être examinés en vivo, par exemple, lorsqu’une protéine fluorescent-étiquetée est modifiée par une mutagenèse dirigée des principaux acides aminés, ou lorsqu’elle est traitée avec divers inhibiteurs affectant signalisation de lipide. Les distributions des protéines de la membrane de plasma périphérique sont principalement évaluées qualitativement, surtout dans les cas, lorsque la redistribution de la protéine est évidente. La méthode présentée est optimale pour des situations lorsque la redistribution de la protéine n’est que partielle et évaluation quantitative est nécessaire. Une approche fréquemment utilisée de quelle association de la membrane plasmique est estimée à partir confocal laser scanning des images de microscopie comme un rapport entre les intensités de fluorescence à la membrane plasmique et le cytoplasme1,2, est simple, mais pas précis. Les intensités de fluorescence à la membrane plasmique reflètent une superposition du signal-membrane plasmique et le cytoplasme en raison de la caractéristique de la diffraction de la lumière pour la technique de microscopie de fluorescence particulière et les éléments d’optique utilisés3. Par conséquent, le signal cytoplasmique est également inclus dans la région de la membrane. Pour cette raison, patron de coloration FM 4-64 ne peut servir comme un masque pour une membrane signal sélection4. En outre, des mesures simples de signal de la membrane à la position définie par la FM 4-64 coloration maximale toujours systématiquement surestiment le signal réel-la membrane plasmique de protéine périphérique associée à la membrane plasmique en raison de la superposition de la membrane et composé cytoplasmique. Aussi, le maximum de signaux observés pour fluorescent-étiquetées de protéines associées à la périphérie ne pas localiser conjointement avec le maximum de la membrane plasmique marqueur (c.-à-d., FM 4-64 styryl colorant), mais est décalé vers le cytoplasme. Une autre limitation est basée sur le fait que la FM pic d’émission 4-64 est plus large en comparaison avec les pics d’émission pour des protéines fluorescentes vertes telles que GFP en raison de la longueur d’onde et de dépendance de la diffraction de la lumière3.
Dans la méthode décrite ici, le signal de la protéine étiqueté est équipé de deux fonctions empiriques décrivant une distribution hypothétique de la membrane plasmique et le cytoplasme signal, respectivement. Cette décomposition du signal est appliquée à des profils de fluorescence linéaire qui sont appliqués à la surface de la cellule perpendiculairement à la membrane plasmique dans les images sources, qui sont des sections confocale régulières, deux canaux d’expression de la protéine fluorescent-étiquetée cellules marquées avec colorant FM 4-64.
La première fonction utilisée pour le montage décrit une diffraction d’un signal de cytoplasme au bord de la cellule. Il est obtenu à partir des profils de fluorescence acquis précédemment qui ont été mesurées dans les cellules exprimant un marqueur de protéine cytoplasme marqué par le chromophore même comme la protéine de périphérique associée à la membrane plasmique d’intérêt. La deuxième fonction décrivant une diffraction d’un signal de la membrane plasmique est dérivée de la fluorescence de FM 4-64. Tout d’abord, ce signal est approximé par une fonction gaussienne qui est utilisée pour une modélisation approximative de diffraction de la lumière d’une source ponctuelle. Deuxièmement, ce modèle, valable pour l’émission de rouge FM 4-64, est mathématiquement transformé au formulaire correspondant à une longueur d’onde d’émission du chromophore utilisé pour le marquage des protéines associées à la périphérie d’intérêt à la membrane plasmique. Les deux fonctions sont normalisées par l’intensité maximale et la moyenne de 10 % des valeurs plus élevées pour le signal FM 4-64 et protéine cytoplasmique, respectivement. Par cette décomposition signal (non-linéaire méthode des moindres carrés ajustement), le ratio de la membrane plasmique et la fraction du cytoplasme de la protéine étudiée peuvent estimer facilement et avec précision. La dimension physique réelle du coefficient de répartition calculée est de l’ordre du micromètre, parce que la concentration du volume cytoplasmique est comparée à la concentration de surface sur la membrane plasmique. Elle définit la distance entre la membrane plasmique et le cytoplasme, au sein duquel la même quantité de protéines est localisée dans la zone adjacente de la membrane plasmique. Cette valeur est équivalente à la partition coefficient K2 introduit précédemment5. La méthode est très rapide, nécessitant des sections confocale seule acquises à l’aide de la routine confocale à balayage laser microscope, et il n’est pas mathématiquement exigeant. Le noyau d’analyse a été implémenté dans un ensemble de R portable et une macro ImageJ supplémentaire a été écrit pour fournir une interface graphique pour exécuter l’analyse de dialogues intuitives. Logiciel et une description plus détaillée de la méthode (publié précédemment6) peut être trouvé à http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
Cette méthode convient pour tissus, des cellules isolées et des protoplastes dans la membrane plasmique des cellules individuelles se distingue nettement, exprimant une construction fluorescent-étiquetées d’interrogé protéine associée à la périphérie. Un chromophore compatible avec FM 4-64 la coloration doit être utilisé. FM 4-64 émet une fluorescence rouge ; par conséquent, la protéine étudiée peut être étiquetée par une protéine fluorescente avec bleue, verte ou jaune d’émission (p. ex., GFP, CFP, YFP). La transformation stable de matériel biologique est recommandée car elle permet des observations moins artificielles et plus reproductibles de la distribution des protéines. Il est nécessaire que la protéine étudiée a une distribution relativement homogène cytoplasmique. La localisation d’une protéine dans le réticulum endoplasmique ou d’un autre compartiment membranaire intracellulaire peut produire des résultats artificiels.
En outre, la même matière biologique exprimant un marqueur cytoplasmique doit être utilisée pour la comparaison. Cellules peuvent être transformés par une chomophore libre (le même que pour les protéines périphériques marquage, par exemple, GFP libre) ou étiqueté protéines d’intérêt avec la capacité de fixation de membrane aboli. Capacité de fixation de la membrane peut être supprimée, par exemple, de tailler avec précision le domaine de liaison à membrane ou par mutagénèse dirigée de résidus d’acides aminés essentiels (p. ex., sites pour la N-myristoylation, S-acylation, ou prénylation, etc.).
Pour la microscopie confocale à balayage, les cellules doivent être étiquetés par un marqueur de la membrane comme colorant FM 4-64. Si FM 4-64 la coloration n’est pas approprié pour le matériau étudié (en raison d’autofluorescence interférente, pénétration du colorant pauvres, etc.), la membrane plasmique peuvent être étiquetée, par exemple, par une protéine intégrale de membrane plasmique taggée à un chomophore approprié ( mCherry, DP, etc.). Il est essentiel que le marqueur a une localisation négligeable dans les compartiments de membrane intracellulaire (endomembranes).
Si vous travaillez avec les anticorps et fixe, fixable analogique FM 4-64FX ou membrane plasmique étiquetant par anticorps dirigé contre une cible appropriée peut être utilisé. Dans ce cas, il est essentiel d’évaluer les résultats avec beaucoup d’attention parce que les procédures de fixation peuvent conduire à une perte sélective des protéines à la fois le cytoplasme et la membrane plasmique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:944px;" width="944">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">FM 4-64</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:384px;">T13320</td>
			<td style="width:184px;">Plasma membrane dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:384px;">D4540 Sigma</td>
			<td style="width:184px;">Dye solvent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:184px;">Equipment for cell labelling and microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:384px;"></td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Ordinary computer</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:384px;"></td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins

Cette méthode fournit une approche rapide pour la détermination de la membrane plasmique partitionnement de toute protéine associée à la périphérie fluorescent-étiquetées en utilisant les profils d’intensité de fluorescence à travers la membrane de plasma. Profilés de fluorescence mesuré sont fixés par un modèle pour la membrane et le cytoplasme distribution de fluorescence le long d’une ligne appliquée perpendiculairement à la périphérie de la cellule. Ce modèle est construit à partir des valeurs d’intensité de fluorescence en exprimant un marqueur fluorescent-étiquetées de cytoplasme et avec FM 4-64-étiqueté la membrane plasmique des cellules de référence. La méthode peut être appliquée à différents types de cellules et des organismes ; Cependant, seulement les membranes plasmiques des cellules non-voisins peuvent être évaluées. Cette méthode rapide axée sur la microscopie est appropriée pour les expériences, où sont attendus des changements subtils et dynamiques des marqueurs associés à la membrane plasmique et il fallait être quantifiée, par exemple, dans l’analyse des versions mutantes de protéines, traitements de l’inhibiteur, et observations de la transduction du signal. La méthode est implémentée dans un ensemble de R multi-plateforme qui est couplé avec une macro ImageJ qui sert d’une interface conviviale.

DREPP10 est une protéine spécifiques aux plantes associées en périphérie-membrane plasmique qui est associée à la membrane plasmique via un N-myristoylation et une interaction électrostatique avec phosphatidylinositol phosphates11, 12. DREPP a été décrit comme un composant du mécanisme de signalisation calcique dans la cellule végétale et aussi interagit avec le cytosquelette<sup class="xref"...

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Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Nous présentons ici un protocole afin d’effectuer une analyse quantitative du niveau de l’association de la membrane plasmique fluorescent-étiquetées de protéine associée à la périphérie. La méthode est basée sur la décomposition computationnelle de membrane et composants cytoplasmiques du signal observé dans les cellules marquées avec la membrane plasmique marqueur fluorescent.

Détermination de la Membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées à la périphérie

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

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