Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Forfatterne takke Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, og Marie Claire Pflimlin fra Roche og Tifany Schaer og Deborah Paolucci fra HiQScreen for deres fremragende teknisk bistand.

Xenopus laevis er opstaldet og håndteres ifølge Genève Canton dyr retningslinjer.
1. Radioligand bindende
<ol><li>
Forberedelse af assay plade
	<ol>
<li>Forberede 1,5 L i analysebuffer med 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl og 15 mM Tris; justere pH med HCl til 7,4.</li>
		<li>Forberede forbindelser skal testes på 50.76 µM (fx, en 5 µL sammensatte på 10 mM i en 980 µL analysebuffer i et microcentrifuge rør). Bland dem godt bruge en vortex maskine med høj hastighed til 2 – 5 s.</li>
		<li>Forberede en pre fortynding af reference sammensatte flumazenil af pipettering 1 µL af sammensat (10 mM) til 1,970 µL af analysebuffer. Bland dem godt bruge en vortex maskine med høj hastighed til 2 – 5 s.</li>
		<li>Fortynde en [3H] flumazenil stamopløsning med analysebuffer ved 4 ° C til 4 nM i en 50 mL polypropylen tube.</li>
		<li>Med pipette overfoeres 50 µL/brønd af analysebuffer til kolonne 1 og 3-11 af en 96-brønd mikrotiterplade som vist i den plade layout repræsenteret i figur 2.</li>
		<li>Afpipetteres 73.2 µL af de forbindelser, fortyndet på 50.76 µM (Se trin 1.1.2) i kolonne 12 på pladen.</li>
		<li>Fortynd hver sammensatte, ved hjælp af en geometrisk progression over 9 trin (1E-10 -1E-06 M), med en 23.12 µL overførsel volumen og fylde kolonner 3-11. Bland fortyndingen grundigt. Ændre spidsen efter hver fortynding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fortynd cellemembraner
	<ol>
<li>Tø cellemembraner tidligere isoleret fra en HEK293 overexpressing menneskelige GABAA receptor (0,025-0,15 mg/mL) at opnå 80 mL ved stuetemperatur (RT) og overføre suspension til analysebuffer ved 4 ° C.</li>
		<li>Resuspend membran løsning stadig ved 4 ° C med en væv homogeniseringsapparat for 30 – 40 s på 10.000-12.000 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fortyndet diazepam for kontrolelementet ikke-specifik binding (NSB)
	<ol>
<li>Fortynde en 4 mM diazepam stamopløsning med analysebuffer til en koncentration af 40 µM i 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Start reaktionen
	<ol>
<li>Afpipetteres 50 µL af 4 nM [3H] flumazenil i hvert hul i 96-brønd pladen og holde det i en beholder, isvand.</li>
		<li>Tilsæt 100 µL af GABAA receptor subtype membraner præparat, som har en proteinkoncentration på 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Der afpipetteres 50 µL af 40 µM diazepam i kolonne 2.</li>
		<li>Inkuber plade i 1 time på køl.</li>
		<li>Tilsæt 50 µL af analysebuffer i hver brønd med en 96-brønd filterplade til efterfølgende membran adskillelse og radioaktivitet måling og stoppe reaktionen bagefter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaktionen standses
	<ol>
<li>Udarbejde en vask buffer med 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.</li>
		<li>Filtrer løsning ved hjælp af en 96-brønd celle mejetærsker. Vaske plade 3 x med 300 µL af iskold vask buffer pr. hul.</li>
		<li>Forsegle bunden af pladen med en plastfolie og tilføje 40 µL af scintillation cocktail for flydende scintillation tælle i hvert godt og tørre det med ethanol 70%.</li>
		<li>Ryst forsigtigt plade i mindst 1 time på RT. Lad det stå i mindst en time ved RT.</li>
		<li>Måle radioaktivitet (i CPM) ved at placere pladen på en scintillation counter. Giver mulighed for en måling i 3 min. pr. brønd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dataanalyse
	<ol>
<li>Bestemme, betyde for 8 replikater af ikke-specifik binding (NSB) og den samlede bindende (TB) såvel som for dubletter eller tre af prøverne. Beregne % specifikke bindende (SB) for gennemsnit af hver prøve efter følgende ligning: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Her samlede SB = det gennemsnitlige TB minus den betyde NSB.</li>
		<li>Plot i abscissen % SB versus i ordinat hæmmer koncentrationer. Passe til dataene ved hjælp af enkelt websted konkurrence analyse ligning: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Her y = % af SB, A = minimum af y, B = y, maksimalt C = IC-50, X = log10 af koncentrationen af de konkurrerende sammensatte, D = hældningen af kurven (en Hill koefficient).</li>
		<li>Beregne bindende affinitet (Ki) ved hjælp af den halve maksimal hæmmende koncentration (IC50), dissociationskonstant (Kd) af [3H] flumazenil på de respektive membraner9, og koncentrationen af [3H] Flumazenil i analysen efter følgende data ved hjælp af ligningen: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. receptor udtryk og optagelser i Xenopus oocyter
<ol><li>Æggestokkene høst og oocyt forberedelse
	<ol>
<li>Forberede den sterile Barth løsning med 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (3)2.4h2O og 0,41 mM CaCl2.6H2O, ved pH 7,4 , suppleret med 100 enhed/mL af penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 0,25 µg/mL af amphotericin B.</li>
		<li>Forberede den 1 x OR2 medium (ingen CaCl2) med 88.5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, pH-værdi på 7,4.</li>
		<li>Offer en Xenopus Laevis kvindelige af dyb anæstesi i 20 min. i afkølede Tricaine methanesulfonate (i en koncentration på 150 mg/L, justeret på pH 7,4) og natriumhydrogencarbonat (300 mg/L) efterfulgt af halshugning.</li>
		<li>Høste æggestokkene hurtigt med ren saks og pincet og placere dem i 2 petriskåle (10 cm) fyldt med 40 mL 1 x Barth løsning og antibiotika/antimykotikum.</li>
		<li>Gemme æggestokkene ikke adskilles i op til 2 uger i Barth løsning ved 4 ° C.</li>
		<li>For dissociation, skære æggestokkene med en ren barberblad i små fraktioner (1 – 2 cm3) og inkuberes dem i 50 mL af OR2 medium uden CaCl2 (OR2-noCaCl2) indeholdende 0,2% collagenase (Type I) på 17-19 ° C i en 100 mL spinner kolben med en langsom agitation for 4-5 h. Bekræft, at den magnetiske bar er placeret ca 3-5 cm over bunden af spinner kolben at undgå knusning af oocytter.</li>
		<li>Efter 4-5 h, kontrollere, at de fleste af oocyter er frigjort fra deres follikel (dvs., de svømmer rundt individuelt). Vaske dem 5 x med 200 mL af OR2 suppleret med 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Overfør defolliculated oocyter til petriskåle (10 cm) fyldt med Barth løsning og antibiotika/antimykotika og holde dem mindst natten over ved 17 ° C før cDNA eller mRNA injektionen.</li>
		<li>Den næste dag, vælge, under en kikkert, en sund oocyt præsentere en klar og tydelig animalsk kontra en vegetal pole (mørk brun til dyr pole versus lys gul for vegetal pole). Bruge ren Pasteur pipetter og afhænde oocyter én efter én i en steril konisk 96-injektion godt plade. Bemærk: Ingen særlig pleje er nødvendig i placeringen af oocytter til mRNA injektioner; for cDNA injektioner er det uundværligt at orientere oocyter med den dyre stang opad.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA eller cDNA automatiske injection
	<ol>
<li>Syntetisere mRNAs ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit til anbefalede instruktionerne. Rengør instrumenterne og tabellen med RNase og de passende beskyttelse handsker. Bemærk: Kvaliteten af mRNA er afgørende at give en god udtryk, og det er nødvendigt at forhindre mRNA forringelse under proceduren injektion.</li>
		<li>Forberede cDNAs ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit og opløse den ønskede mængde i bidistilled vand ved en koncentration på 0,2 µg/µL.</li>
		<li>Injicér 10 – 50 nL af mRNA løsning ved en koncentration på 0,2 µg/µL, eller 10 nL af cDNA løsning i en koncentration på lige fra 0,02-0,2 µg/µL, helst i partier af 95 oocyter.</li>
		<li>For membran proteiner der kræver flere underenheder (dvs., heteromeric α1β2γ2 GABA-A receptorer), bland tilsvarende mRNAs eller cDNAs i det ønskede forhold (dvs.1:1:1 eller 1:10:1).</li>
		<li>Holde oocyt på 17 ° C at forhindre udtryk for heat shock proteiner af oocytter; gemme mikrotiterplade i en thermo-kontrollerede lagerområde.</li>
		<li>Opløse prøven forbindelser, som blev testet positive i den bindende assay i OR2 på 0,1-1.000 µM for elektrofysiologiske optagelser og afhænde dem ud i en 96-godt flad bund polypropylen plade.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmids til udtryk
	<ol>
<li>Følg betjeningsvejledninger af kommercielt tilgængelige kits til mRNA-syntese med bakteriel T7 eller T6 evalueringsudvalget og gøre 20 µL af en løsning på 0,2 µg/µL i RNase-fri vand.</li>
		<li>Forbered mindst 20 µL af en oploesning indeholdende en eukaryote udtryk vektor for cDNA, typisk på 0,2 µg/µL opløst i bidistilled vand.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroinjektion i oocyt og visualisering af dets kvalitet
	<ol>
<li>Injicér 10 – 50 nL af den løsning, der indeholder plasmid (Se trin 2.3.1 eller 2.3.2) ved hjælp af et glas mikroinjektion nål med en spids diameter lige op til 100 µm monteret på en micromanipulator udstyret med et pres udslyngning system eller med en automatiseret indsprøjtningssystem. Bemærk: I eksemplet drøftede her oocyter injiceres af partier af 95 med et automatiseret system egner sig til brug med cDNA eller mRNA.</li>
		<li>Fyld injektion nålen med 1 µL af et farvestof som methylenblåt på 1% og injicere oocyter ved hjælp af standardproceduren, (enten i nucleus for cDNA eller i cytoplasma til mRNA).</li>
		<li>Bortskaf de injicerede oocyter i ca 1 minut i kogende vand. Skær oocyter i halvdelen med et barberblad under en kikkert. Bemærk: Farvestoffet forbliver lokaliseret som vist i figur 3E, tillader en præcis observation af injektion.</li>
	</ol></li>
	<li>To-elektrode spænding klemme optagelser
	<ol>
<li>Sted godt pladen som indeholder oocyter på den automatiseret system, der anvender princippet illustreret i figur 4. Bemærk: I modsætning til den patch klemme system illustreret i figur 5, ægte membran potentiale af cellen læses af spænding elektrode.</li>
		<li>Programmere den automatiske optagelse system ved hjælp af den ikon-baseret interface med, for eksempel ordningen illustreret i figur 6 til bestemmelse af koncentrationen aktivitets-relationer.</li>
	</ol></li>
	<li>Kurven montering
	<ol>
<li>Analysere resultaterne ved hjælp af passende software, ved hjælp af illustrerede koncentration aktivering kurve, afbilde den nuværende amplitude som en funktion af logaritmen af agonist koncentration.</li>
		<li>Observere sigmoide kurven, der efterfølgende kan monteres med empiriske Hill ligningen i formen: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Her Y= brøkdel af evoked nuværende, EF 50 = koncentration til 50% aktivering, x = er koncentrationen af sammensat, nH = Hill koefficient eller tilsyneladende cooperativity.</li>
		<li>Normalisere strømninger til en enhed ved at dividere amplitude af hvert svar versus værdien registreres med den højeste koncentration til at analysere oplysninger indhentet fra en række celler.</li>
		<li>Bestemme gennemsnit og standardafvigelser og indse kurve montering ved hjælp af standardly tilgængelig software.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elektrofysiologiske optagelser i hjernen skiver
Bemærk: Hippocampus rotte skiver er udarbejdet i overensstemmelse med de nationale og institutionelle retningslinjer.
<ol><li>
Forberedelse af hippocampus skiver
	<ol>
<li>Forberede dissektion kunstige cerebro-spinale væske (dACSF) med 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukose og 4 mM sakkarose gasset i flaske med en blanding af 95% O2 og 5% CO2.</li>
		<li>Forberede optagelse kunstige cerebro-spinale væske (rACSF) med 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3og 10 mM glukose gasset i flaske med en blanding af 95% O2 og 5% CO2.</li>
		<li>Bedøver rotter ved hjælp af en blanding af 2,5% isofluran og ren ilt og Hug hovedet af dem.</li>
		<li>Skære hovedbunden efter midterlinjen med et fin saks. Skære kraniet langs midterlinjen uden at beskadige det underliggende væv. Fjerne kraniet med pincet og bruge en fine spatel til at øse ud af hjernen.</li>
		<li>Læg hjernen i gasset dACSF løsning på RT og dissekere den venstre hippocampus dannelse med et fint spatel.</li>
		<li>Skær tværgående skiver (400 µm tykt) fra den mellemstore del af hippocampus med et væv chopper og overføre dem til optagelse kammer med brug af en maling børste. Vedligeholde skiver på RT for 45 min.</li>
		<li>Perfuse skiver med den gasset rACSF ved 35 ° C og med en hastighed på 1,5 mL/min. boble løsning med en blanding af 95% O2 og 5% CO2. Bemærk: Efter dette trin, skiver er klar til de elektrofysiologiske eksperimenter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enkelt befolkning spike optagelse
	<ol>
<li>Placer en hjerne skive ind i mikroskop-monteret kammeret.</li>
		<li>Perfuse skive med en hastighed på 3 mL/min med rACSF.</li>
		<li>Trække en borsilikatglas mikropipette med pipette puller har en modstand af ~ 2 MΩ. Bemærk: Denne mikropipette bruges som en optagelse elektrode og er elektrisk tilsluttet forstærkeren.</li>
		<li>Fylde mikropipette med en oploesning indeholdende 2 M NaCl og læg det i pipette indehaveren af forstærkeren.</li>
		<li>Placer optagelse mikropipette i stratum pyramidale i regionen CA1 hippocampus udsnittets ved hjælp af den rigtige micromanipulator. Bemærk: Placeringen repræsenteret skematisk i figur 7.</li>
		<li>Placer en isoleret bipolar platinum/iridium elektrode i holderen på den venstre micromanipulator. Bemærk: Denne elektrode bruges som stimulation elektrode og er elektrisk tilsluttet stimulus generator.</li>
		<li>Placer stimulation elektrode i Schaffer soeskende i regionen CA1 hippocampus udsnittets ved hjælp af den rigtige micromanipulator. Bemærk: Placeringen repræsenteret skematisk i figur 7.</li>
		<li>Levere en nuværende puls til stimulation elektroden ved hjælp af stimulus generator hver 30 s (100 µs varigheder, startende fra 10 µA) og gradvist øge stimulation styrke indtil en befolkning spike (PS) vises.</li>
		<li>Justere stimulus styrke for at fremkalde en PS svarende til 45% af den maksimale amplitude, der kan opnås. PSs er filtreret på 2,4 KHz og digitaliseret på 20 KHz ved hjælp af signalforstærkeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Parret-puls hæmning
	<ol>
<li>Forberede hjernen skiver (trin 3.1) og Fortsæt som tidligere beskrevet (trin 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Levere to aktuelle pulser (100 µs varigheder et interval på 20 ms) til stimulation elektrode hver 30 s ved hjælp af stimulus generator. Indstille stimulus styrken til at fremmane en PS svarende til 45% af den maksimale amplitude.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammensatte test
	<ol>
<li>Fortyndinger af forbindelser, der skal testes i gasset ACSF så den endelige koncentration af DMSO ikke højere end 0,1%.</li>
		<li>Tilføje DMSO til styringsløsning i den samme koncentration end i den sammensatte løsning.</li>
		<li>Optage en enkelt (trin 3.2) eller et parret-pulse (trin 3.3) PS fremkaldt af Schaffer sikkerhedsstillelse stimulering hver 30 s i mindst 30 min. Figuren PS skal være stabil i denne oprindelige periode.</li>
		<li>Forberede et bægerglas med gasset rACSF der indeholder en fast koncentration af stoffet testes.</li>
		<li>Perfuse hippocampus skive med denne løsning, mens du stadig optager den enkelte eller parret puls PS.</li>
		<li>Evaluere opsving fra den sammensatte effekt af perfusing skive med gasset rACSF uden sammensat. Bemærk: For reversible effekter, PS vender tilbage til sin oprindelige form observeret i baseline perioden før det sammensatte program.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dataanalyse
	<ol>
<li>Gennemsnitlige PS spor registreret under eksperimentet i blokke af 4 bruger data analyse software.</li>
		<li>Måle PS amplituder af gennemsnit spor.</li>
		<li>Normalisere amplituder som en procentdel af baseline værdierne registreres 10 min før perfusing en sammensat.</li>
		<li>Udtrykke data, som betyder ± SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

Forfatterne Frédéric Knoflach og Maria Clemencia Hernandez er medarbejdere i F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel i Schweiz, en lægemiddelvirksomhed. Forfatteren Daniel Bertrand er ansat af HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genève, Schweiz, giver screening faciliteter til farmaceutiske virksomheder.

Udviklingen af nye forbindelser aktive på en ligand-gated ion-kanal som GABA-A receptorer kræver brug af flere metoder. Typisk, det første skridt er ofte udført ved hjælp af bindende assays; men sådanne målinger er utilstrækkelig til at karakterisere den fysiologiske aktivitet af stoffet eller dets præcise farmakologi. Især et stof, der binder sig til en receptor kan forbedre eller hæmme dets funktion eller selv producere ingen funktionel indflydelse (tie) (dvs., binder sig til receptoren uden at ændre dets funktion). Således er en funktionel test nødvendige for en fuld sammensatte karakterisering.
Bindende assays: Den største fordel ved bindende assay er at det effektivt kan gennemføres på et stort antal prøver lige op til flere tusinde og at det giver bindende tilhørsforhold til de aktive molekyler. Som beskrevet heri, består det første skridt for at etablere en metode til vurdering af de ønskede receptor subtype. Nemlig, mens bindende kan udføres på native receptorer fra fraktioner eller hele hjerner, en sådan metode vil forhindre bestemmelse af tilhørsforhold på specifikke receptor subtype. Det er derfor nødvendigt at anvende rekombinante systemer til raster molekylerne på det ønskede mål. I dag er tilbyder en forbigående eller stabil Transfektion af ønskede receptor subunit cDNAs i cellelinjer en effektiv og pålidelig metode til at udtrykke receptor undertyper af interesse (f.eks., GABAA α5β3γ2). Traditionelle bindende assays gøre brug af radioligands, men i dag teknikker er tilgængelige at undgå besværet med håndtering af radioaktivitet (fx, kvantitative fluorescens-baserede ligand-bindende).
Funktionelle udtryk i en værtssystem: For at udtrykke gener på et værtssystem, sættes den kodende sekvens af interesse i et plasmid, der indeholder de tilstrækkelige evalueringsudvalget. Typisk for in vitro- mRNA syntese, er de bakterielle T7 eller T6 evalueringsudvalget brugt. For en cDNA udtryk, skal transskription af gen af interesse reguleres af en eukaryote promotor f.eks CMV (cytomegalovirus) eller tilsvarende. Flere plasmider, herunder de to evalueringsudvalget (dvs., pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), er i dag tilgængelig så enten en in vitro- syntesen af mRNA eller en cDNA udtryk som vist i Figur 15. Et udtryk af GABA-A receptorer kan opnås trofast, enten i cellelinjer eller Xenopus oocyter. De vigtigste fordele ved sidstnævnte er manglen endogene receptor udtryk, enkelhed af manipulationer og tilgængeligheden af et automatisk system til mikro-injektioner og optagelser. Procedurerne i denne protokol illustrere effektiviteten af den automatiserede system, som tillader injektion af 96 oocyter i ca 7 min og kræver ingen micromanipulation færdigheder. At huske på, at en enkelt æggestokken fra en Xenopus indeholder mellem 10.000-30.000 oocytter, er det klart, at et stort antal celle målinger kan foretages på et enkelt præparat. Desuden, som et udtryk kan gennemføres ved hjælp af cDNA injektioner, de samme plasmider, der indeholder gener af interesse, der er udviklet til bindende eksperimenter kan bruges til en funktionel karakterisering uden behov for yderligere Molekylærbiologi manipulationer.
I betragtning af dens store størrelse og høj overflade udtryk, udbytter en enkelt oocyt en række receptorer, der omtrent svarer til de sammenflydende celler i en 35 mm petriskål. Dog repræsenterer en oocyter forberedelse og injektion en brøkdel af omkostningerne ved en cellelinje, som eksperimenterne, der ikke kræver en specifik næringssubstratet og sterile manipulationer. Aktivering af en enkelt GABAA kanal giver et par picoamperes (10-12) og strømninger spænder op til snesevis af microampere (10-6) optages let i en enkelt oocyt, som bekræfter samtidig aktiviteten af flere millioner af receptorer under en enkelt svar.
Et første skridt i karakterisering af ligand-gated Ionkanaler er ofte bestemmelse af det tilsyneladende affinitet af receptorer. De forsøg, der skal foretages består af anvender en række korte agonist testimpulser og plotte amplitude af den evoked aktuelle eller i visse tilfælde arealet under kurven (AUC) som en funktion af logaritmen af agonist koncentration. Så er det nemt muligt at microinject forskellige plasmid koncentrationer og forhold i den samme batch af oocytter, er dette system af udtryk yderst velegnede til sådan en karakteristik. Desuden viste en batch til batch sammenligning en høj grad af stabilitet for forskellige EF50s. Indflydelse af subunit sammensætning på den receptor tilsyneladende affinitet er let visualiseres ved hjælp af en edderkop plot, som eksemplificeret i figur 10.
Resultaterne af den to-elektrode spænding klemme er fremstillet i Xenopus oocyter sammenlignes ofte med optagelser foretaget ved hjælp af patch klemme elektroder. Der henviser til, at det ville gå ud over anvendelsesområdet for dette arbejde til at gå ind i en detaljeret sammenligning mellem disse to systemer, kan et par punkter undersøges. Mens en patch klemme i celler giver fordele for en Biofysisk karakteristik med en hurtig drug application, er dens krav mere komplekse end de to-elektrode optagelser i Xenopus oocyter. Et første og ikke ubetydelige problem er udtryk for en given protein med nødvendigheden af en cellekultur, en forbigående eller stabil Transfektion og identifikation af de celler, der udtrykker den ønskede konstruktion. Derudover er det nødvendigt at undersøge den endogene udtryk i cellen betragtes som mulige bidrag. Desuden kræver en patch klemme optagelse en kvalificeret person til at foretage micromanipulation under en høj forstørrelse microscope, mens denne person skal også udføre en passende analyse under eksperimentet at vurdere, for eksempel, kvaliteten af sæl, adgang modstand etc. i kontrast, en to-elektrode spænding klemme optagelse, især en ved hjælp af en automatiseret elektrofysiologiske system, kræver ikke nogen særlige færdigheder og kan foretages af laboranter.
Ved erhvervelse af en elektrofysiologiske set-up, er omkostninger betragtning helt sikkert en vigtig faktor, der skal analyseres grundigt. For eksempel, mens omkostningerne ved en automatiseret system er relativt høj, afslører en nærmere sammenligning at installationen af et komplet elektrofysiologiske rig omfatter køber udstyr som god micromanipulators, en kikkert linse, en forstærker, en perfusion system, og et Vibrationsdæmpende bord, mens også erhverve data og udføre en analyse. En pris sammenligning mellem en to-elektrode spænding klemme set-up versus en patch klemme set-up afslører endnu længere uoverensstemmelser. Desuden, den automatiseret system tilbyder fordel af fuldt automatiseret udstyr og kører uden opsyn dag og nat.
De farmakologiske egenskaber af et stof, der bestemmes af dets virkemåde på receptoren. For eksempel, er kompetitive inhibitorer molekyler, der kan angive den samme bindende lomme eller orthosteric websted, som agonist, selv forårsager en konkurrence. Ikke-kompetitive inhibitorer er stoffer, som hæmmer receptorer ved at interagere på et andet websted, og i tilfælde af en ligand-gated ion-kanal, som kan angive og blokere den ioniske pore, f.eks. Det ville gå ud over anvendelsesområdet for dette arbejde at undersøge de forskellige ordninger for interaktion, men yderligere oplysninger kan fås fra et farmakologisk lærebog og/eller fra andre arbejde som Bertrand og Bertrands22.
I tilfælde af allosteriske modulatorer ændrer de sammensatte bindes på et websted, der er adskilt fra orthosteric site, men tilstedeværelsen af molekylet energi barriere mellem de aktive og andre stater. Positive allosteriske modulatorer (PAMs) er forbindelser, reducerer energi barrieren fra hvile til den aktive tilstand, og derfor øge effekten af agonist. For at karakterisere mulige PAM virkninger, er det derfor nødvendigt at afgøre, om en udsættelse til sammensat forbedrer reaktion på agonist og bekræftende fald i hvilken koncentration. Eksperimenterne præsenteret i Figur 11 og Figur 14 illustrere protokoller, der med held kan anvendes til karakterisering af PAMs på GABA-A receptorer.
I nogle tilfælde, kan udsættelse for PAM alene være tilstrækkeligt til at aktivere receptorer. Sådan aktivitet kan bestemmes ved en mindre ændring af forsøgsplan præsenteres her. Nemlig, stedet for at bruge en fælles anvendelse af modulatoren under eksponering til GABA, protokollen kan ændres ved anvendelsen af første sammensatte alene og derefter i nærværelse af GABA. En Karakteristik af den direkte agonist aktivitet vil blive foretaget ved bestemmelse af amplituden af reaktion fremkaldt af sammensat sig selv og i forhold til den GABA-fremkaldte aktuelle.
Eksperimenter udført i hjernen skiver, som illustreret i figur 7, der anvendes til at bekræfte den sammensatte aktivitet på native receptorer i et konkret hæmmende kredsløb før de går videre i dyremodeller og langs vejen mod kliniske forsøg. Forholdsvis enkle data optagelse og analyse protokollen tillader placering af flere forbindelser ved at evaluere deres differential modulerende effekt på PS amplitude. Ikke-specifikke effekter af forbindelser, som ikke er relateret til GABA-system kan også være registrerede (f.eks., når der observeres ændringer i figuren PS). Direkte, GABAergic neurotransmission kan vurderes i disse tilfælde ved at måle virkningerne af stofferne på hæmmende postsynaptiske strømme (IPSCs) ved hjælp af hele-celle patch klemme teknik8.

Vi præsenterer her, protokoller for opdagelsen af forbindelser aktive på GABA-A receptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi. I søgen efter nye molekyler specifikke for GABA-A receptorer, er det afgørende at definere, så præcist som muligt, undertype af interesse og vurdering af den særlige karakter af de nyligt identificerede stoffer (f.eks.for en gennemgang Se Rudolph og Knoflach1eller Sieghart2). En typisk sti i drug discovery og de skridt, der skal opnås er illustreret i figur 1.
Bindende assays har været og er stadig i vid udstrækning bruges som det første skridt i drug discovery. I tilfælde af GABA-A receptorer, er de optimeret til at identificere stoffer, der binder til benzodiazepin bindingssted af receptor hvor terapeutisk nyttig og sikker narkotika binde. Andre teknikker, ved hjælp af fluorometriske imaging plade læser (FLIPR) membran potentielle røde farvestofbaseret assays3, registrere forbindelser som barbiturater, der bindes til flere websteder, der er mindre ønskeligt på grund af deres uønskede bivirkning profil. Derudover kan de udnyttede farvestoffer direkte aktivere GABA-A receptorer, således spørgsmålstegn ved nytten af disse assays for drug discovery4. Bindende assays kan kun give de beviser for, at et givet stof kan binde til en bestemt receptor klasse. In vitro assays med cellemembraner bruges til at identificere selektiv menneskelige GABAA α5β3γ2 receptor ligander. Forbigående transfekteret HEK293 celler udtrykker menneskelige GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 og α3β3γ2 receptorer der bruges til at forberede disse assays membraner. Effekten af ligander er fundet ved at måle scintillation af [3H] flumazenil bundet til membranreceptorer (en hæmning af [3H] flumazenil bindende). Den største fordel ved denne teknik er, at en hurtig og effektiv bestemmelse af sammensatte-bindende affinitet til receptoren af interesse er fastsat på receptor af interesse.
Funktionelle studier er væsentligt at evaluere de funktionelle aktivitet af forbindelser og foreslå en fysiologiske og farmakologiske forklaring af de mekanismer, der er forårsaget af bindingen af forbindelser til receptorer. I dag, er det velkendt, at funktionelle GABAA receptorer skyldes samling af fem underenheder omkring en akse af pseudosymmetry dannet af Ioniske pore og resultatet fra forsamlingen af fem identiske underenheder. De fleste af GABA-A receptorer er sammensat af to eller flere forskellige underenheder. Den store hjerne GABAA receptor, for eksempel, er sammensat af en1, β2 og γ2 underenheder i en støkiometrisk af 2, 2 og 1 henholdsvis5,6. En rekonstituering i et host system som Xenopus oocyter eller HEK293 celler giver mulighed for hurtigt at udforske de farmakologiske egenskaber af receptorer.
De farmakologiske egenskaber af forbindelser udforskes derefter med ekstracellulære optagelser i hjernen skiver7. Denne metode giver mulighed for en udforskning af virkningen af forbindelser på neurotransmission og giver en effektiv måde at bekræfte de funktionelle virkninger af forbindelser, der fastsat i Heterolog ekspression systemer på niveau med indfødte receptorer i samlet neuronal miljø. GABAergic neurotransmission kan også vurderes på det molekylære niveau ved at måle virkningerne af stofferne på hæmmende postsynaptiske strømme (IPSCs)8. Men protokollen bruges her og baseret på hele-celle patch klemme optagelser i hjernen skiver er mere omfattende og giver en lavere overførselshastighed.
Endelig er styrker og svagheder i vitro screening cascade bruges til identifikation af α5β3γ2-selektiv ligander drøftet i lyset af de forskellige teknikker og deres iboende begrænsninger. Dette arbejde bør give eksperter og ikke-eksperter inden for GABA-A receptorer en nyttig gennemgang af kombinationen af forskellige in vitro- metoder anvendes til at tackle opdagelsen af nye modulatorer af disse ligand-gated Ionkanaler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Dette manuskript præsenterer en trinvis protokol for screening forbindelser på gamma-aminobutyric syre skrive en (GABAA) receptorer og dens anvendelse til identifikation af nye molekyler aktive i prækliniske assays fra en i vitro rekombinante receptor deres farmakologiske virkninger på native receptorer i gnavere hjernen skiver. For forbindelser bindende på webstedet benzodiazepin af receptoren, er det første skridt at oprette en primær skærm, der består af udvikle radioligand bindende assays på cellemembraner at udtrykke de store GABAA -undertyper. Derefter, drage fordel af den Heterolog ekspression af gnavere og menneskelige GABA-A receptorer i Xenopus oocyter eller HEK 293 celler, det er muligt at udforske de fysiologiske egenskaber af forskellige receptor i elektrofysiologiske assays, undertyper og de farmakologiske egenskaber af de identificerede stoffer. Xenopus oocyt system vil blive præsenteret her, startende med isolering af oocyter og deres mikroinjektion med forskellige mRNAs, op til de farmakologiske karakterisering ved hjælp af to-elektrode spænding klemmer. Endelig vil optagelser foretaget i gnavere hjernen skiver blive beskrevet, der bruges som en sekundær fysiologiske test til at vurdere aktiviteten af molekyler i deres native receptorer i et veldefineret neuronal kredsløb. Ekstracellulære optagelser ved hjælp af befolkningen svar af flere neuroner er vist sammen med stof-ansøgning.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Metoder til opdagelsen af nye forbindelser modulerende en Gamma - aminosmørsyre Receptor Skriv en Neurotransmission

Vi præsenterer her, protokoller for at opdage forbindelser aktive på GABA-A receptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Parret Nanoinjection og Elektrofysiologi Assay til screening for bioaktivitet af forbindelser ved hjælp af Drosophila melanogaster Giant fibersystem

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Fremgangsmåder til intravenøs selvindgivelse i en musemodel

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høj opløsning funktionel magnetisk resonans Metoder til human midthjernen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder til undersøgelse af virkningsmekanismer for antipsykotika i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Optisk kontrol af en neuronal protein under anvendelse af en genetisk indkodede naturlig aminosyre i neuroner

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Oprettelse af en musemodel af en ren lille Fiber neuropati med Ultrapotent Agonist af forbigående Receptor potentielle Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Roman passiv Clearing metoder til hurtig fremstilling af optiske gennemsigtighed i hele CNS væv

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...