Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

De auteurs bedanken Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, en Marie Claire Pflimlin van Roche en Tifany Schaer en Deborah Paolucci van HiQScreen voor hun uitstekende technische bijstand.

Xenopus laevis zijn ondergebracht en behandeld volgens de richtlijnen van de dieren van het kanton van Genève.
1. Radioligand Binding
<ol><li>
Voorbereiding van de test-plaat
	<ol>
<li>Bereiden van 1,5 L voor assay buffer met 5 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 1.25 mM MgCl2, 120 mM NaCl en 15 mM Tris; Breng de pH met HCl op 7.4.</li>
		<li>Voorbereiden van de verbindingen te testen op 50.76 µM (bijvoorbeeld, een samengestelde op 10 mM in een 980 µL assay buffer in een microcentrifuge buis 5 µL). Meng ze goed met behulp van een vortex machine op hoge snelheid voor 2 – 5 s.</li>
		<li>Maak een pre verdunning van de verwijzing samengestelde flumazenil door pipetting 1 µL van de compound (10 mM) te 1,970 µL van assay buffer. Meng ze goed met behulp van een vortex machine op hoge snelheid voor 2 – 5 s.</li>
		<li>Verdun een [3H] flumazenil stamoplossing waarvan de assay buffer bij 4 ° C tot 4 nM in een polypropyleen tube van 50 mL.</li>
		<li>Pipeteer 50 µL per putje van assay buffer in de kolommen 1 en 3 / 11 van een 96-Wells-microplate zoals wordt weergegeven in de indeling van de plaat weergegeven in Figuur 2.</li>
		<li>Pipetteer 73.2 µL van de verbindingen verdund op 50.76 µM (zie stap 1.1.2) in kolom 12 van de plaat.</li>
		<li>Elke stof, met behulp van een geometrische progressie over 9 stappen verdund (1E-10 – 1E-06 M), met een 23.12 µL overdracht volume en vulling kolommen 3 tot en met 11. Meng de verdunning. Wijzig de tip na elke verdunning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verdun de celmembranen
	<ol>
<li>Ontdooi de membranen van de cel eerder geïsoleerd uit een HEK293 overexpressing mens GABAA receptor (0,025-0,15 mg/mL) ophalen van 80 mL bij kamertemperatuur (RT) en spoel de suspensie aan de assay buffer bij 4 ° C.</li>
		<li>Resuspendeer de membraan oplossing nog bij 4 ° C met een homogenizer weefsel voor 30 – 40 s bij 10.000-12.000 tpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verdunde diazepam voor de controle van de niet-specifieke binding (NSB)
	<ol>
<li>Verdun een 4 mM diazepam stamoplossing waarvan de buffer assay tot een concentratie van 40 µM in 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Start van de reactie
	<ol>
<li>Pipeteer 50 µL van 4 nM [3H] flumazenil in elk putje van de 96-wells-plaat en bewaar deze in een container ijswater.</li>
		<li>Voeg 100 µL van de GABAA receptor subtype membranen bereiding hebben een eiwitconcentratie van 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Pipeteer 50 µL van 40 µM diazepam in kolom 2.</li>
		<li>Incubeer de plaat gedurende 1 uur op het ijs.</li>
		<li>Voeg 50 µL van assay buffer in elk putje van de plaat van een 96-Wells-filter voor het latere membraan scheiding en meten van de radioactiviteit en stop de reactie daarna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zet de reactie stop
	<ol>
<li>Bereiden van een buffer wassen met 50 mM Tris-HCl, pH 7.4.</li>
		<li>Filtreer de oplossing met behulp van een 96-Wells cel maaimachine. Wassen van de plaat 3 x met 300 µL van ijskoude wassen buffer per putje.</li>
		<li>Zegel van de onderkant van de plaat met een plastic folie en voeg 40 µL van scintillatie cocktail voor vloeibare scintillatietelling tellen in elk goed en veeg het met ethanol 70%.</li>
		<li>Zachtjes schud de plaat gedurende ten minste 1 uur op RT. Laat het staan voor ten minste een uur op RT.</li>
		<li>Het meten van de radioactiviteit (in CPM) door het plaatsen van de plaat op een teller scintillatie. Laat een meting voor 3 min per putje.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Data-analyse
	<ol>
<li>Bepaal dat het gemiddelde voor de 8 repliceert van niet-specifieke binding (NSB) en de totale binding (TB) alsook wat betreft de dubbele of triplicates van de monsters. Bereken het % specifieke band (SB) voor het gemiddelde van elk monster volgens de volgende vergelijking: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Hier, totale SB = de gemiddelde TB minus de NSB betekenen.</li>
		<li>Uitzetten in de abscis de SB % versus in coördineren de Inhibitor van de omwenteling-concentraties. Grootte van de gegevens met behulp van de telpost concurrentie analyse vergelijking: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Hier, y = het % van SB, A = het minimum van y, B = de maximale waarde van y, C de IC50, = X = de log-10 van de concentratie van de concurrerende compound, D = de helling van de curve (een Hill coëfficiënt).</li>
		<li>Berekenen van de bindende affiniteit (Ki) met behulp van de halve maximale remmende concentratie (IC50), de dissociatieconstante (Kd) van [3H] flumazenil op de respectieve membranen9, en de concentratie van [3H] flumazenil in de bepaling van de volgende vergelijking van gegevens-gebruik: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. receptor expressie en opnamen in Xenopus eicellen
<ol><li>Eierstokken oogsten en oöcyt voorbereiding
	<ol>
<li>Bereid de steriele Barth-oplossing met 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.82 mM MgSO4.7H2O, 0.33 mM Ca (3)2.4H2O en 0,41 mM CaCl2.6H2O, met een pH van 7,4 , aangevuld met 100 eenheid/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 0,25 µg/mL amfotericine-B.</li>
		<li>Bereid het 1 x OR2 medium (geen CaCl2) met 88.5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, met een pH van 7,4.</li>
		<li>Offer een Xenopus Laevis vrouwelijke door diepe anesthesie voor 20 min in gekoelde tricaïne methanesulfonate (bij een concentratie van 150 mg/L, aangepast met een pH van 7,4) en natriumbicarbonaat (300 mg/L) gevolgd door onthoofding.</li>
		<li>Oogst de eierstokken snel met een schone schaar en pincet en plaats ze in 2 petrischalen (10 cm) gevuld met 40 mL 1 x Barth oplossing en antibiotica/antimycotic.</li>
		<li>Opslaan van de eierstokken niet-losgekoppeld voor maximaal 2 weken in Barth oplossing bij 4 ° C.</li>
		<li>Voor de dissociatie, snij de eierstokken met een schone scheermesje in kleine breuken (1-2 cm3) en broeden ze in 50 mL en2 medium zonder CaCl2 (en2-noCaCl2) met 0,2% collagenase (Type I) bij 17-19 ° C in een 100 mL-spinner kolf met een langzame agitatie voor 4-5 h. Controleer de magnetische bar is geplaatst ongeveer 3-5 cm boven de bodem van de spinner kolf om te voorkomen dat pletten van de eicellen.</li>
		<li>Na 4-5 h, controleren dat allermeest naar de eicellen zijn bevrijd van hun follikel (dat wil zeggen, ze zwemmen rond individueel). Ze wassen 5 x met 200 mL en2 aangevuld met 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Overdracht van de defolliculated eicellen te petrischalen (10 cm) gevuld met Barth-oplossing en antibiotica/Antimycotica en houd ze tenminste 's nachts bij 17 ° C vóór de cDNA of mRNA injectie.</li>
		<li>Op de volgende dag, selecteren, onder een verrekijker, een gezonde oöcyt presenteren een heldere en duidelijke dierlijke versus een vegetal pole (donkerbruin voor het dier pole versus licht geel voor de vegetal paal). Gebruik schone Pasteur pipetten en gooi de eicellen één voor één in een steriele conische 96-injectie goed plaat. Opmerking: Geen speciale zorg nodig is in de plaatsing van de eicellen voor de mRNA injecties; Overwegende dat voor de cDNA injecties, is het onontbeerlijk om te oriënteren van de eicellen met het dier pool naar boven gericht.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA of cDNA automatische injectie
	<ol>
<li>Het gebruik van een commercieel beschikbare kit de aanbevolen instucties mRNAs synthetiseren. Reinig de instrumenten en de tabel met RNase en de passende beschermende handschoenen dragen. Opmerking: De kwaliteit van de mRNA is determinant opleveren van een goede uitdrukking, en het is onontbeerlijk om te voorkomen dat mRNA afbraak tijdens de injectie-procedure.</li>
		<li>CDNAs met behulp van een commercieel beschikbare kit voor te bereiden en het gewenste bedrag in bidistilled water met een concentratie van 0,2 µg/µL los.</li>
		<li>Injecteren van 10 – 50 nL van mRNA-oplossing bij een concentratie van 0,2 µg/µL, of 10 nL van cDNA oplossing bij een concentratie variërend van 0.02 – 0,2 µg/µL, bij voorkeur in batches van 95 eicellen.</li>
		<li>Voor membraan eiwitten vereisen meerdere subeenheden (dat wil zeggen, heteromeric α1β2γ2A van de GABA-receptoren), meng de overeenkomstige mRNAs of cDNAs in de gewenste verhouding (dat wil zeggen, 1:1:1 of 1 / 10:1).</li>
		<li>Houden van de oöcyt bij 17 ° C om te voorkomen dat de expressie van hitteschokprotëinen door de eicellen; Bewaar de microplate in een thermo-gecontroleerde opslaggebied.</li>
		<li>Ontbinden van de test-verbindingen die werden getest positief in de bindende bepaling in en2 op 0.1 – 1000 µM voor elektrofysiologische opnamen en gooi ze uit in een platte 96-Wells polypropyleen bodemplaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmiden voor expressie
	<ol>
<li>Volg de gebruiksaanwijzing van commercieel beschikbare kits voor de mRNA-synthese met bacteriële T7 of T6 promotoren en maken 20 µL van een oplossing op 0,2 µg/µL in RNase-gratis water.</li>
		<li>Bereiden ten minste 20 µL van een oplossing met een eukaryote expressie vector voor de cDNA expressie, meestal op 0,2 µg/µL opgelost in bidistilled water.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection in de oöcyt en visualisatie van de kwaliteit
	<ol>
<li>Injecteren van 10 – 50 nL van de oplossing met plasmide (zie stap 2.3.1 of 2.3.2) met behulp van een naald van de micro-injectie glas met een tip diameter variërend van maximaal 100 µm gemonteerd op een micromanipulator voorzien van een druk uitwerpen systeem of met een geautomatiseerde injectiesysteem. Opmerking: De hier besproken voorbeeld eicellen worden geïnjecteerd door batches van 95 met een geautomatiseerd systeem geschikt voor gebruik met cDNA of mRNA.</li>
		<li>Vul de injectie naald met 1 µL van een kleurstof zoals methyleenblauw op 1% en injecteren de eicellen met behulp van de standaard procedure (of in de kern voor cDNA of in het cytoplasma voor mRNA).</li>
		<li>De geïnjecteerde eicellen gedurende ongeveer 1 min. in kokend water te vervreemden. Snij de eicellen doormidden met een scheermesje onder een verrekijker. Opmerking: De kleurstof blijft gelokaliseerde zoals weergegeven in Figuur 3E, waardoor een nauwkeurige observatie van de injectie.</li>
	</ol></li>
	<li>Twee-electrode spanning klem opnames
	<ol>
<li>Plaats de goed plaat met de eicellen op het geautomatiseerde systeem, dat werkt volgens het principe geïllustreerd in Figuur 4. Opmerking: In tegenstelling tot de patch klem systeem geïllustreerd in Figuur 5, de ware membraanpotentiaal van de cel wordt gelezen door de spanning elektrode.</li>
		<li>Het programma van de geautomatiseerde opnamesysteem met behulp van het pictogram gebaseerde interface met, bijvoorbeeld, de regeling geïllustreerd in Figuur 6 voor de bepaling van de concentratie/activiteit-relaties.</li>
	</ol></li>
	<li>Curve-fitting
	<ol>
<li>Analyseren van de resultaten met behulp van de juiste software, met behulp van de geïllustreerde concentratie activering curve, de huidige amplitude worden uitgezet als functie van de logaritme van de concentratie van de agonist.</li>
		<li>Houd rekening met de sigmoïdale curve die vervolgens kan worden uitgerust met de empirische vergelijking van de heuvel in de vorm: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Hier, Y= de Fractie van evoked stroom, EG 50 = de concentratie voor een 50%-activeren, x = de concentratie van de stof, nH = de Hill coëfficiënt of schijnbare Allosterie.</li>
		<li>Normaliseren de stromingen tot een eenheid door de amplitude van elke reactie versus de waarde met de hoogste concentratie van de teststof opgenomen te analyseren van de gegevens die zijn verkregen uit een groot aantal cellen verdelen.</li>
		<li>Bepalen van het gemiddelde en de standaardfouten en beseffen dat de curve-fitting met behulp van bij beschikbare software.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elektrofysiologische opnames in hersenen plakjes
Opmerking: Hippocampal rat segmenten zijn opgesteld in overeenstemming met de institutionele en nationale richtsnoeren.
<ol><li>
Voorbereiding van de hippocampus segmenten
	<ol>
<li>Voorbereiden van de dissectie kunstmatige cerebro-spinale vloeistof (dACSF) met 124 mM 124 NaCl, 2,5 mM KCl, 1.25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose en 4 mM Saccharose in de fles met een mengsel van 95% O2 en 5% CO2vergast.</li>
		<li>Voorbereiden van de opname kunstmatige cerebro-spinale vloeistof (rACSF) met 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3en 10 mM glucose vergast in de fles met een mengsel van 95% O2 en 5% CO2.</li>
		<li>Anesthetize van de ratten met behulp van een mengsel van 2,5% Isofluraan en zuivere zuurstof en onthoofden hen.</li>
		<li>De hoofdhuid na de middellijn met een goede schaar te knippen. Snijd de schedel langs de middellijn zonder beschadiging van het onderliggende weefsel. Verwijderen van de schedel met een pincet en gebruik een fijne spatel te schep uit de hersenen.</li>
		<li>Plaats van de hersenen in de getankte dACSF-oplossing bij RT en ontleden de linker hippocampal formatie met een spatel fijn.</li>
		<li>Transversale segmenten (400 µm dik) uit het medium deel van de hippocampus gesneden met een chopper weefsel en overbrengen naar de zaal van de opname met het gebruik van een schilderij borstel. Het handhaven van de segmenten op RT voor 45 min.</li>
		<li>Perfuse van de plakjes met de getankte rACSF bij 35 ° C en met een snelheid van 1,5 mL/min. Bubble de oplossing met een mengeling van 95% O2 en 5% CO2. Opmerking: Na deze stap, de segmenten zijn klaar voor het elektrofysiologische experimenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Één bevolking spike opname
	<ol>
<li>Plaats een plakje van de hersenen in de bedwelmingsruimte Microscoop gemonteerde.</li>
		<li>Perfuse van het segment met een snelheid van 3 mL/min met rACSF.</li>
		<li>Trek een micropipet van borosilicaatglas met de pipet-trekker met een weerstand van ~ 2 MΩ. Opmerking: Deze micropipet wordt gebruikt als een opname-elektrode en elektrisch is aangesloten op de versterker.</li>
		<li>Vul de micropipet met een oplossing die 2 M NaCl en plaats deze in de houder van de Pipet van de versterker.</li>
		<li>Plaats de micropipet van de opname in het stratum pyramidale CA1 regio van het hippocampal segment met behulp van de juiste micromanipulator. Opmerking: De locatie is schematisch weergegeven in Figuur 7.</li>
		<li>Plaats een geïsoleerde bipolaire platinum/iridium-elektrode in de houder op de linker micromanipulator. Opmerking: Deze elektrode wordt gebruikt als de stimulatie elektrode en elektrisch is aangesloten op de generator stimulans.</li>
		<li>Positie de stimulatie-elektrode in de collaterals Schaffer CA1 regio van het hippocampal segment met behulp van de juiste micromanipulator. Opmerking: De locatie is schematisch weergegeven in Figuur 7.</li>
		<li>Leveren van een huidige puls aan de elektrode van de stimulatie met behulp van de stimulus-generator elke 30 s (100 µs duur, vanaf 10 µA) en verhoog geleidelijk de kracht van de stimulatie tot een piek van de bevolking (PS) wordt weergegeven.</li>
		<li>Aanpassen van de sterkte van de prikkel om op te roepen een PS overeenkomt met 45% van de maximale amplitude die kan worden verkregen. PSs worden gefilterd op 2,4 KHz en gedigitaliseerd op 20 KHz met behulp van de signaalversterker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Remming van de gepaarde-pulse
	<ol>
<li>Voorbereiden van de hersenen segmenten (stap 3.1) en ga verder zoals eerder beschreven (stappen 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Twee huidige pulsen (100 µs duur met een interval van 20 ms) te leveren aan de stimulatie elektrode elke 30 s met behulp van de stimulus-generator. De sterkte van de prikkel om op te roepen een PS overeenkomt met 45% van de maximale amplitude instellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Samengestelde testen
	<ol>
<li>Verdunningen van de stoffen worden getest in vergast ACSF maken zodat de uiteindelijke concentratie van DMSO niet hoger dan 0,1%.</li>
		<li>DMSO aan de controle-oplossing bij dezelfde concentratie dan die in de samengestelde oplossing toevoegen.</li>
		<li>Opnemen van een honkslag (stap 3.2) of een gekoppeld-pulse (stap 3.3) PS opgeroepen door Schaffer collateral stimulaties elke 30 s voor ten minste 30 min. De PS-shape moet stabiel zijn gedurende deze periode van de basislijn.</li>
		<li>Bereiden een bekerglas met vergast rACSF met een vaste concentratie van de stof worden getest.</li>
		<li>Perfuse van de hippocampal segment met deze oplossing nog steeds terwijl de PS. één of gekoppeld-pulse</li>
		<li>Het herstel van het samengestelde effect door het segment met vergast rACSF zonder de compound zoogdierlevercellen evalueren. Opmerking: Voor omkeerbare effecten, de PS keert terug naar zijn oorspronkelijke vorm opgemerkt tijdens de periode van de basislijn voor de samengestelde toepassing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Data-analyse
	<ol>
<li>Gemiddelde de PS sporen opgenomen tijdens het experiment in blokken van 4 gebruik van de software van de analyse van de gegevens.</li>
		<li>Het meten van de PS amplitudes van de gemiddelde sporen.</li>
		<li>Normaliseren de amplitudes als een percentage van de basislijnwaarden 10 min voordat een samengestelde zoogdierlevercellen opgenomen.</li>
		<li>Express-de gegevens zoals bedoel ± SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

De auteurs Frédéric Knoflach en Maria-Clemencia Hernandez zijn werknemers van F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel (Zwitserland), een farmaceutisch bedrijf. De auteur-Daniel Bertrand is een medewerker van HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genève, Zwitserland, screening faciliteiten verlenen aan farmaceutische bedrijven.

De ontwikkeling van nieuwe verbindingen actief bij een ligand-gated ionkanaal zoals de GABAA -receptoren vereist het gebruik van meerdere benaderingen. Typisch, de eerste stap is vaak uitgevoerd met gebruikmaking van bindende analyses; deze metingen zijn echter onvoldoende om te karakteriseren de fysiologische activiteit van de stof of de precieze farmacologie. In het bijzonder, een verbinding die zich aan een receptor bindt kan verbeteren of remmen zijn functie of zelfs produceren geen functioneel effect (be silent) (d.w.z., binding aan de receptor zonder wijziging van zijn functie). Een functionele test is dus vereist voor een volledige samengestelde karakterisering.
Bindende testen: Het belangrijkste voordeel van de bindende bepaling is dat ze efficiënt kan worden uitgevoerd op een groot aantal monsters variërend tot duizenden en bevat het bindende affiniteiten voor de actieve moleculen. Zoals hierin beschreven, bestaat de eerste stap uit het opzetten van een methode voor de beoordeling van de gewenste receptor subtypes. Namelijk, terwijl bindende kan worden uitgevoerd op inheemse receptoren van breuken of hele hersenen, deze methode voorkomt u dat de bepaling van de affiniteiten op specifieke receptor subtypes. Daarom is het noodzakelijk gebruik van recombinante systemen om scherm moleculen op de gewenste doelgroep. Tegenwoordig, biedt een voorbijgaande of stabiele transfectie van de gewenste receptor subeenheid cDNAs in cellijnen een efficiënte en betrouwbare methode om uit te drukken de receptor subtypes van belang (b.v., GABAA α5β3γ2). Traditionele binding testen maken gebruik van radioligands, maar tegenwoordig technieken zijn beschikbaar die voorkomen dat het ongemak van het verwerken van radioactiviteit (bv, kwantitatieve fluorescentie gebaseerde ligand-bindende).
Functionele expressie in een hostsysteem: Om uit te drukken genen in een hostsysteem, moet de codering opeenvolging van belang worden ingevoegd in een plasmide waarin de voldoende promotoren. Meestal voor in vitro mRNA-synthese, worden de bacteriële T7 of T6 promotors gebruikt. Voor een cDNA expressie, moet de transcriptie van het gen van belang door de promotor van een eukaryote zoals CMV (cytomegalovirus) of gelijkwaardig worden geregeld. Verschillende plasmiden, met inbegrip van de twee promotoren (dat wil zeggen, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), zijn tegenwoordig beschikbaar waardoor een in vitro -synthese van mRNA of een cDNA expressie zoals weergegeven in Figuur 15. Een uitdrukking van de GABAA -receptoren kan getrouw worden verkregen cellijnen of in Xenopus eicellen. De belangrijkste voordelen van de laatste zijn het ontbreken van een endogene receptor expressie, de eenvoud van de manipulaties en de beschikbaarheid van een geautomatiseerd systeem voor micro-injecties en opnames. De in dit protocol beschreven procedures illustreren de efficiëntie van het geautomatiseerde systeem waardoor de injectie van 96 eicellen in ongeveer 7 minuten en vereist geen micromanipulation vaardigheden. Herinneren dat een één eierstok uit een Xenopus tussen de 10.000 tot 30.000 eicellen bevat, is het duidelijk dat een groot aantal metingen van de cel kan worden uitgevoerd op een enkele voorbereiding. Bovendien, als een expressie kan worden uitgevoerd met gebruikmaking van cDNA injecties, de dezelfde plasmiden met de genen van belang die zijn ontwikkeld voor de bindende experimenten kunnen worden gebruikt voor een functionele karakterisering zonder de behoefte aan verdere moleculaire biologie manipulaties.
Gezien de grote omvang en hoge oppervlakte expressie, levert een enkele oöcyt een aantal receptoren die ongeveer gelijk is aan de confluente cellen in een 35 mm petrischaal. Echter vertegenwoordigt een eicellen voorbereiding en injectie een fractie van de kosten van een cellijn, zoals de experimenten niet nodig een specifieke kweekmedium en steriele manipulaties. De activering van een enkellijns GABAA levert een paar picoamperes (10-12) en stromingen variërend tot tientallen microampere (10-6) zijn gemakkelijk opgenomen in een enkele oöcyt, die de gelijktijdige activiteit van miljoenen bevestigt receptoren tijdens één antwoord.
Een eerste stap in de karakterisering van ligand-gated ionenkanalen is vaak de bepaling van de schijnbare affiniteit voor de receptoren. De experimenten die behoeft te worden uitgevoerd bestaat uit het toepassen van een reeks van korte agonist test pulsen en uitzetten van de amplitude van de evoked huidige of, in bepaalde gevallen, het gebied onder de curve (AUC) als een functie van de logaritme van de concentratie van de agonist. Aangezien het gemakkelijk haalbaar is om te microinject verschillende plasmide concentratie en verhouding in dezelfde batch van eicellen, is dit systeem van meningsuiting met name geschikt voor een dergelijke karakterisering. Bovendien, een-charges-vergelijking toonde een hoge mate van stabiliteit voor verschillende EG50s. De invloed van de samenstelling van de subeenheid op de receptor van schijnbare affiniteit is gemakkelijk gevisualiseerd met behulp van een spin perceel, zoals in Figuur 10.
De resultaten van de klem van de twee-electrode spanning verkregen in Xenopus eicellen worden vaak vergeleken met opnames gemaakt met behulp van patch klem elektroden. Overwegende dat het zou gaan buiten het bestek van dit werk te gaan van een gedetailleerde vergelijking tussen deze twee systemen, kunnen een paar punten worden onderzocht. Terwijl een patch-clamp in cellen voordelen voor een biofysische karakterisering met een snelle drug toepassing biedt, zijn de eisen complexer dan die van de opnamen van de twee-elektrode in Xenopus eicellen. Een eerste en niet te verwaarlozen moeilijkheid is de uitdrukking van een bepaald eiwit met de noodzaak van een cultuur van de cel, een voorbijgaande of stabiele transfectie, en de identificatie van de cellen die de gewenste construct uiten. Daarnaast is het onmisbaar zijn voor het onderzoeken van de mogelijke bijdrage van de endogene expressie in de cel beschouwd. Bovendien vereist de opname van een patch klem een bekwaam persoon uit te voeren van de micromanipulation onder een Microscoop high-vergroting, terwijl die persoon ook een adequate analyse uitvoeren tijdens het experiment moet te beoordelen, bijvoorbeeld de kwaliteit van de zegel, de toegang weerstand etc. In contrast, een twee-electrode spanning klem opnemen, met name een met behulp van een geautomatiseerd elektrofysiologische systeem, vereist geen geen specifieke vaardigheden en kan worden uitgevoerd door laboranten.
Bij de aankoop van een elektrofysiologische set-up, is kosten overweging zeker een belangrijke factor die moet zorgvuldig worden geanalyseerd. Bijvoorbeeld, terwijl de kosten van een geautomatiseerd systeem relatief hoog is, blijkt een nauwere vergelijking dat de installatie van een volledige elektrofysiologische tuig omvat kopen apparatuur zoals goede micromanipulators, een verrekijker lens, een versterker, een perfusie systeem, en een anti-trillingen tafel, terwijl ook het verwerven van gegevens en het uitvoeren van een analyse. Een vergelijking van de kosten tussen een twee-electrode spanning klem set-up versus een patch klem set-up blijkt nog verschillen. Bovendien, het geautomatiseerde systeem biedt het voordeel van volledig geautomatiseerde apparatuur en dag en nacht zonder toezicht uitgevoerd.
De farmacologische eigenschappen van een stof worden bepaald door de wijze van optreden op de receptor. Bijvoorbeeld, zijn concurrerende remmers moleculen die kunnen worden ingevoerd de dezelfde bindende zak, of orthosteric de site, zoals de agonist zelf een competitie veroorzaakt. Niet-concurrerende remmers zijn stoffen die een remmende werking van de receptoren door interactie op een andere site en, in het geval van een ligand-gated ionkanaal, die kunnen worden ingevoerd en blokkeren de Ionische porie, bijvoorbeeld. Het zou gaan buiten het bestek van dit werk te onderzoeken van de verschillende mechanismen van interactie, maar verdere informatie kan worden verkregen uit een farmacologische leerboek en/of van ander werk zoals Bertrand en Bertrand van22.
In het geval van allosteric modulatoren wijzigt de samengestelde bindt op een site die verschilt van de orthosteric site, maar de aanwezigheid van het molecuul de energie barrière tussen de actieve en andere Staten. Positieve allosteric modulatoren (PAMs) zijn verbindingen die de energie barrière verminderen van de rust op de actieve status en daarom versterken het effect van de agonist. Mogelijke effecten van de PAM karakteriseren, daarom, nodig om te bepalen als een blootstelling aan de stof de reactie op de agonist vergroot en, zo ja, op welke concentratie. De experimenten die in Figuur 11 en Figuur 14 gepresenteerd illustreren protocollen die met succes kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van PAMs op de GABAA -receptoren.
In sommige gevallen mogelijk de blootstelling aan de PAM alleen voldoende om te activeren van de receptoren. Zo'n activiteit kan worden bepaald door een lichte wijziging van de experimentele protocol hier gepresenteerd. Namelijk, in plaats van een co-toepassing van de modulator tijdens de blootstelling aan de GABA, het protocol kan worden gewijzigd voor de toepassing van de eerste de compound alleen en vervolgens in aanwezigheid van de GABA. Een karakterisering van de directe agonist-activiteit zal worden gemaakt door de bepaling van de amplitude van de reactie opgeroepen door de stof zelf en ten opzichte van de huidige GABA-opgeroepen.
Experimenten in plakjes van de hersenen, zoals geïllustreerd in Figuur 7, worden gebruikt voor het bevestigen van de samengestelde activiteit op inheemse receptoren in een duidelijke remmende circuit alvorens verder te gaan in diermodellen en langs het traject naar klinische proeven. De relatief eenvoudige data opname en analyse-protocol kunnen de rangorde van meerdere verbindingen met een evaluatie van hun differentiële f effect op PS amplitude. Non-specifieke gevolgen van verbindingen die niet zijn gerelateerd aan het GABA-systeem kunnen ook worden gedetecteerd (bv, wanneer veranderingen in de PS-vorm worden waargenomen). Direct, GABAergic transmissie kan worden beoordeeld in deze gevallen door het meten van de effecten van de stoffen op de remmende postsynaptisch stromingen (IPSCs) met behulp van de geheel-cel patch-clamp techniek8.

Hier presenteren we protocollen voor de ontdekking van actieve verbindingen op GABAA -receptoren, van de binding aan de Fysiologie en farmacologie. In de zoektocht naar nieuwe moleculen specifiek voor GABAA -receptoren, is het cruciaal om te definiëren, zo nauwkeurig mogelijk, het subtype van het belang en de beoordeling van de specificiteit van de onlangs geïdentificeerde stoffen (bijvoorbeeld, voor een overzicht, zie Rudolph en Knoflach1of Sieghart2). Een typische pad drugontdekking en de stappen die moeten worden verwezenlijkt worden geïllustreerd in Figuur 1.
Bindende analyses geweest en zijn nog steeds grotendeels gebruikt als de eerste stap in de Geneesmiddelenontwikkeling. In het geval van GABAA -receptoren, zijn ze geoptimaliseerd voor het identificeren van stoffen die zich binden aan de benzodiazepine bindende site van de receptoren waar therapeutische nuttige en veilige drugs binden. Andere technieken, met behulp van fluorimetrische imaging plaat lezer (FLIPR) membraan potentiële rode kleurstof gebaseerde testen3, detecteert verbindingen zoals barbituraten die zich binden aan extra sites die minder wenselijk vanwege hun ongewenste neveneffect profiel zijn. Daarnaast kunnen de gebruikte kleurstoffen direct GABAA -receptoren, dus vraagtekens bij het nut van deze tests voor drug discovery4activeren. Bindende testen kan alleen bieden het bewijs dat een bepaalde stof aan een specifieke receptor klassebinden kunt. In vitro testen met celmembranen worden gebruikt als aanduiding van selectieve menselijke GABAA α5β3γ2 receptor liganden. Transient transfected HEK293 cellen, uiting geven aan de mens GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 en α3β3γ2-receptoren worden gebruikt voor het bereiden van membranen voor deze tests. Het effect van de liganden wordt gedetecteerd door het meten van de Scintillatie van [3H] flumazenil gebonden aan het membraan receptoren (een remming van [3H] flumazenil binding). Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een snelle en efficiënte bepaling van de affiniteit van de compound-binding aan de receptor van belang wordt verstrekt op de receptor van belang.
Functionele studies zijn essentieel om te evalueren van de functionele activiteit van de verbindingen en voor te stellen een fysiologische en farmacologische uitleg van de mechanismen die zijn veroorzaakt door de binding van de stoffen aan de receptoren. Vandaag, is het goed erkende dat functioneleA GABA receptoren uit de vergadering van vijf subeenheden rond een as van pseudosymmetry gevormd door de Ionische porie en het resultaat van de vergadering van vijf identieke subeenheden voortvloeien. Allermeest naar de GABAA -receptoren zijn samengesteld uit twee of meer verschillende subeenheden. De grote hersenen GABAA receptor, bijvoorbeeld, bestaat uit de subeenheden van het β2, alpha1 en γ2 in een stoichiometrie van 1, 2 en 2 respectievelijk5,6. Een reconstructie in een hostsysteem zoals de Xenopus eicellen of HEK293 cellen biedt de mogelijkheid om snel het verkennen van de farmacologische eigenschappen van de receptoren.
De farmacologische eigenschappen van de verbindingen worden vervolgens onderzocht met extracellulaire opnames in hersenen segmenten7. Deze methode maakt een verkenning van het effect van de verbindingen op transmissie en biedt een doeltreffende manier te bevestigen het functionele effecten van de stoffen bepaald in heterologe expressiesystemen op het niveau van inheemse receptoren in de totale neuronale milieu. GABAergic transmissie kan ook worden beoordeeld op het moleculaire niveau door het meten van de effecten van de stoffen op de remmende postsynaptisch stromingen (IPSCs)8. Maar het protocol hier gebruikt en gebaseerd op geheel-cel patch klem opnames in plakjes van de hersenen is uitgebreider en levert een lagere doorvoersnelheid.
Tot slot, de sterke en zwakke punten van de in vitro bevolkingsonderzoek cascade gebruikt voor de identificatie van α5β3γ2-selectieve liganden worden besproken in het perspectief van de verschillende technieken en hun intrinsieke beperkingen. Dit werk moet bieden en de niet-deskundigen op het gebied van GABAA -receptoren een nuttig overzicht van de combinatie van verschillende in vitro benaderingen gebruikt om aan te pakken van de ontdekking van nieuwe modulatoren van deze ligand-gated ionenkanalen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Dit manuscript presenteert een stapsgewijze protocol voor screening verbindingen op gamma-aminobutyric acid Typ een (GABAA)-receptoren en het gebruik ervan naar de identificatie van nieuwe moleculen actief in preklinische testen van een in vitro recombinant receptor de farmacologische effecten op inheemse receptoren in knaagdier hersenen plakjes. De eerste stap is voor verbindingen inbinden op de benzodiazepine-site van de receptor, een primaire scherm dat bestaat uit het ontwikkelen van radioligand binding testen op celmembranen uiting geven aan de belangrijkste subtypen van GABAA instellen. Dan profiteren van de heterologe uitdrukking van knaagdieren en menselijke GABAA -receptoren in Xenopus eicellen of HEK 293 cellen, is het mogelijk om te verkennen, in elektrofysiologische testen, de fysiologische eigenschappen van de verschillende receptoren subtypen en de farmacologische eigenschappen van de geïdentificeerde verbindingen. Het systeem van de oöcyt Xenopus krijgt hier, beginnend met het isolement van de eicellen en hun protocollen met verschillende mRNAs, tot de farmacologische karakterisering met behulp van twee-electrode spanning klemmen. Ten slotte worden opnamen uitgevoerd in knaagdier hersenen plakjes beschreven die worden gebruikt als een secundaire fysiologische test om de activiteiten beoordelen van moleculen op hun inheemse receptoren in een welomschreven neuronale circuit. Extracellulaire opnamen met behulp van bevolking reacties van meerdere neuronen worden gedemonstreerd samen met de toepassing van de drug.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Methoden voor de ontdekking van nieuwe verbindingen moduleren van een Receptor Gamma - aminoboterzuur Typ een transmissie

Hier presenteren we protocollen om te ontdekken van verbindingen actief bij GABAA -receptoren, van de binding aan de Fysiologie en farmacologie.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Nieuwe inrichting en werkwijze voor Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Toepassing van een NMDA-receptor Conductance in Rat middenhersenen dopaminerge neuronen Met behulp van de Dynamic clamp techniek

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Gekoppelde Nanoinjection en Elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Methoden voor intraveneuze toediening Zelf in een muismodel

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hoge resolutie functionele magnetische resonantie imaging methoden voor Human middenhersenen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methoden voor het bestuderen van de werkingsmechanismen van Antipsychotica in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Tot vaststelling van een muismodel van een zuivere kleine vezel neuropathie met de Ultrapotent Agonist van voorbijgaande Receptor potentiële Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...