Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Forfatterne takker Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, og Marie Claire Pflimlin fra Roche og Tifany Schaer og Deborah Paolucci fra HiQScreen for deres utmerket kundestøtte.

Xenopus laevis er plassert og håndteres i henhold til Genève Canton dyr retningslinjer.
1. Radioligand Binding
<ol><li>
Forberedelse av analysen plate
	<ol>
<li>Forberede 1.5 L analysebuffer med 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl og 15 mM Tris; justere pH med HCl 7,4.</li>
		<li>Forberede den forbindelser skal testes på 50.76 µM (f.eks, en 5 µL ved 10 mM til en 980 µL analysebuffer i et microcentrifuge rør). Bland dem godt med en vortex maskin med høy hastighet for 2-5 s.</li>
		<li>Forberede en pre fortynning av referanse sammensatte flumazenil av pipettering 1 µL av sammensatt (10 mM) å 1,970 µL av analysebuffer. Bland dem godt med en vortex maskin med høy hastighet for 2-5 s.</li>
		<li>Fortynne en [3H] flumazenil lager løsning med analysebuffer ved 4 ° C til 4 nM i et 50 mL polypropylen rør.</li>
		<li>Pipetter 50 µL/vel av analysebuffer i kolonne 1 og 3-11 av en 96-brønnen microplate som vist i plate oppsettet i figur 2.</li>
		<li>Pipetter 73.2 µL av forbindelser utvannet på 50.76 µM (se trinn 1.1.2) i kolonnen 12 av platen.</li>
		<li>Fortynn hver sammensatte, bruker en geometrisk progresjon over 9 trinn (1E-10 -1E-06 M), med en 23.12 µL overføringen volumet og fyll kolonner 3-11. Bland fortynning godt. Endre spissen etter hver fortynning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fortynne cellemembraner
	<ol>
<li>Tine cellemembraner tidligere isolert fra en HEK293 overexpressing menneskelige GABAA reseptor (0.025-0,15 mg/mL) skaffer 80 mL ved romtemperatur (RT) og overføre suspensjon til analysebuffer på 4 ° C.</li>
		<li>Resuspend membran løsningen på 4 ° C med en vev homogenizer for 30-40 s på 10.000-12 000 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fortynne diazepam for kontrollen uspesifisert binding (NSB)
	<ol>
<li>Fortynne en 4 mM diazepam lagerløsning med analysebuffer i en konsentrasjon av 40 µM i 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Starte reaksjonen
	<ol>
<li>Pipetter 50 µL av 4 nM [3H] flumazenil i hver brønn av 96-brønns plate og holde det i isen vann beholdere.</li>
		<li>Legg 100 µL av GABAA reseptor undertype membraner preparatet å ha en protein konsentrasjon på 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Pipetter 50 µL av 40 µM diazepam i kolonne 2.</li>
		<li>Inkuber platen 1t på is.</li>
		<li>Legge til 50 µL av analysebuffer i hver brønn av en 96-brønns filter plate for påfølgende membran separasjon og radioaktivitet måling og stoppe reaksjonen etterpå.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stoppe reaksjonen
	<ol>
<li>Forberede en vask buffer med 50 mM Tris-HCl, pH 7.4.</li>
		<li>Filtrere løsningen ved å benytte en 96-brønns celle innhøsting. Vaske platen 3 x med 300 µL iskald vaske bufferen per brønn.</li>
		<li>Forsegle bunnen av platen med en plastfolie og legge 40 µL av scintillation cocktailparty for flytende scintillation teller i hver vel og tørk med etanol 70%.</li>
		<li>Forsiktig risting platen i minst 1 h på RT. La den stå i minst en time ved RT.</li>
		<li>Måle radioaktiviteten (i CPM) ved å sette platen på en scintillation teller. Tillate en måle for 3 min per brønn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dataanalyse
	<ol>
<li>Bestemme gjennomsnittet for 8 gjentak av ikke-spesifikk (NSB) og den totale bindingen (TB) samt duplikater eller triplicates prøvene. Beregne % bestemt bindingen (SB) for gjennomsnittet av hver prøve etter denne formelen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> her totalt SB = den betyr TB minus mener NSB.</li>
		<li>Tegne inn i abscissa % SB versus i Ordinat hemmer konsentrasjoner. Tilpasse dataene med enkelt nettsted konkurranse analyse ligningen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> her y = % av SB, A = minimum av y, B = maksimalt antall y, C = KI50, X = Logg10 av konsentrasjonen av konkurrerende sammensatte, D = skråningen av kurven (en Hill koeffisient).</li>
		<li>Beregne forpliktende tilhørighet (Ki) bruke den halve maksimal inhibitoriske konsentrasjonen (IC50), dissosiasjon konstant (Kd) av [3H] flumazenil på respektive membraner9og konsentrasjonen av [3H] flumazenil i analysen i henhold til denne data-bruke formelen: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. reseptor uttrykk og opptak i Xenopus Oocytes
<ol><li>Eggstokkene høsting og oocyte forberedelse
	<ol>
<li>Forberede den sterile Barth løsningen med 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (ingen3)2.4H2O og 0.41 mM CaCl2.6H2O, ved pH 7.4 , supplert med 100 enhet/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 0,25 µg/mL av amfotericin B.</li>
		<li>Klargjør 1 x OR2 mediet (ingen CaCl2) med 88,5 mM NaCl, 2,5 KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, ved pH 7.4.</li>
		<li>Offer en Xenopus Laevis kvinnelige av dyp anestesi for 20 min i Tricaine methanesulfonate (i en konsentrasjon av 150 mg/L, justert ved pH 7.4) og natriumbikarbonat (300 mg/L) etterfulgt av halshogging.</li>
		<li>Høste eggstokkene raskt med ren saks og tang og plassere dem i 2 Petri-retter (10 cm) fylt med 40 mL 1 x Barth løsning og antibiotika/antimycotic.</li>
		<li>Lagre ikke-dissosiert eggstokkene 2 uker i Barth løsning på 4 ° C.</li>
		<li>Dissosiasjon, kuttet eggstokkene med et rent barberblad i små brøker (1-2 cm3) og ruge dem i 50 mL av OR2 medium uten CaCl2 (OR2-noCaCl2) med 0,2% collagenase (Type I) på 17-19 ° C i en 100 mL spinner flasken med en langsom agitasjon for 4-5 h. Kontroller at den magnetiske baren er plassert ca 3-5 cm over bunnen av spinner kolbe å unngå knuse oocytes.</li>
		<li>Etter 4-5 h, kontrollerer du at de fleste av oocytes er frigjort fra sine hårsekken (dvs.de svømme rundt individuelt). Vask dem 5 x med 200 mL OR2 med 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Overføre defolliculated oocytes Petri-retter (10 cm) fylt med Barth løsning og antibiotika/antimycotics og holde dem minst over natten ved 17 ° C før cDNA eller mRNA injeksjon.</li>
		<li>På den neste dagen, velger under en kikkert, en sunn oocyte presenterer en klar og tydelig dyr versus en vegetal stang (mørk brun til dyr pole versus lys gul for vegetal Polen). Bruk ren Pasteur Pipetter og kast oocytes en etter en i et sterilt konisk 96-injeksjon godt plate. Merk: Ingen spesiell behandling er nødvendig i plasseringen av oocytes for mRNA injeksjoner; mens cDNA injeksjoner, er det uunnværlig å orientere oocytes med dyr Polen vendt oppover.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA eller cDNA automatisk injeksjon
	<ol>
<li>Syntetisere mRNAs ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit følge anbefalte instruksjonene. Rengjør instrumenter og tabellen med RNase og bruk riktig beskytte hanskene. Merk: Kvaliteten på mRNA er Determinanten til en godt uttrykk, og det er nødvendig å hindre mRNA nedbrytning under innsetting prosedyren.</li>
		<li>Utarbeide cDNAs ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig utstyr og oppløse ønsket mengde i bidistilled vann i en konsentrasjon av 0,2 µg/µL.</li>
		<li>Injisere 10-50 nL mRNA løsning i en konsentrasjon av 0,2 µg/µL eller 10 nL cDNA løsning på en konsentrasjon varierer fra 0,02-0,2 µg/µL, fortrinnsvis i porsjoner med 95 oocytes.</li>
		<li>Membran proteiner som krever flere underenheter (dvs., heteromeric α1β2γ2 GABAA reseptorer) blande den tilsvarende mRNAs eller cDNAs i ønsket forholdet (dvs.1:1:1 eller 1:10:1).</li>
		<li>Holde oocyte på 17 ° C å hindre uttrykk for varme sjokk proteiner ved oocytes; Lagre i microplate i et thermo-kontrollerte lagringsområde.</li>
		<li>Oppløse test forbindelsene testet positivt i bindende analysen i OR2 på 0,1-1000 µM elektrofysiologiske opptak og kast dem av i en 96-brønns flat bunn polypropylen plate.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmider for uttrykk
	<ol>
<li>Følg brukerhåndboken til kommersielt tilgjengelig kits for mRNA syntese med bakteriell T7 eller T6 promoterere og gjøre 20 µL av en løsning på 0,2 µg/µL i RNase-fritt vann.</li>
		<li>Forbered minst 20 µL av en løsning som inneholder en eukaryoter uttrykk vektor cDNA uttrykket, vanligvis på 0,2 µg/µL oppløst i bidistilled vann.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection i Oocyte og visualisering av kvaliteten
	<ol>
<li>Injisere 10-50 nL løsningen inneholder plasmider (se trinn 2.3.1 eller 2.3.2) bruker en glass mikro-injeksjon nål tips diameter alt opptil 100 µm montert på en micromanipulator utstyrt med press utstøting systemet eller en automatisert innsprøytningssystem. Merk: I eksemplet diskutert her oocytes er injisert av grupper av 95 med et automatisert system egnet for bruk med cDNA eller mRNA.</li>
		<li>Fyll injeksjon nålen med 1 µL av et fargestoff som methylene blåfarge på 1% og injisere oocytes bruker standard prosedyre (enten i kjernen for cDNA eller i cytoplasma for mRNA).</li>
		<li>Kast de injiserte oocytes i ca 1 min i kokende vann. Halvert i oocytes med et barberblad under en kikkert. Merk: Fargestoff forblir lokaliserte som vist i Figur 3E, slik at en presis observasjon av injeksjon.</li>
	</ol></li>
	<li>To elektrode spenning klemme opptak
	<ol>
<li>Plass den godt platen inneholder oocytes på automatiserte system, som bruker prinsippet illustrert i Figur 4. Merk: I motsetning til oppdateringen klemme systemet illustrert i figur 5, sant membran potensialet i cellen blir lest av spenning elektroden.</li>
		<li>Programmet automatisert opptak systemet med ikon-basert grensesnitt, for eksempel ordningen illustrert i figur 6 for fastsettelse av konsentrasjon aktivitet forholdet.</li>
	</ol></li>
	<li>Montering kurve
	<ol>
<li>Analysere resultatene med riktig programvare, bruke illustrert konsentrasjon aktivisering kurven, plot gjeldende amplituden som en funksjon av logaritmen av Agonistiske konsentrasjonen.</li>
		<li>Observere sigmoidal kurven som senere kan utstyres med empirisk Hill ligningen i skjemaet: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> her Y= brøkdel av evoked gjeldende, EC 50 = konsentrasjonen for en 50% aktivisering, x = konsentrasjonen av sammensatt, nH = Hill koeffisient eller åpenbar cooperativity.</li>
		<li>Normalisere strøm til en enhet ved å dele amplituden til hvert svar kontra verdien registreres på den høyeste konsentrasjonen analysere dataene fra en rekke celler.</li>
		<li>Finne gjennomsnitt og standardfeil og innser montering kurve ved hjelp av elever med en standard tilgjengelig programvare.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elektrofysiologiske opptak i hjernen skiver
Merk: Hippocampus rotte skiver er utarbeidet i henhold til nasjonale og institu veiledning.
<ol><li>
Utarbeidelse av hippocampus skiver
	<ol>
<li>Forberede den disseksjon kunstig cerebro-spinalvæske (dACSF) med 124 mM NaCl 124, 2,5 KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 CaCl2 2t2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukose og 4 mM sukrose gasset i flasken med en blanding av 95% O2 og 5% CO2.</li>
		<li>Forberede den opptak kunstig cerebro-spinalvæske (rACSF) med 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 CaCl2 2t2O, 25 mM NaHCO3og 10 mM glukose gasset i flasken med en blanding av 95% O2 og 5% CO2.</li>
		<li>Bedøve rotter bruker en blanding av 2,5% isoflurane og ren oksygen og halshugge dem.</li>
		<li>Kutt i hodebunnen etter midtlinjen med en fin saks. Kuttet skallen langs midtlinjen uten å skade den underliggende vev. Fjerne skallen med pinsett og bruke en fin slikkepott til å øse ut hjernen.</li>
		<li>Plasser hjernen i gasset dACSF løsningen på RT og dissekere venstre hippocampus dannelse med en fin slikkepott.</li>
		<li>Skiver tverrgående (400 µm tykk) fra middels del av hippocampus med en vev helikopter og overføre dem til opptak kammeret med bruk av en maling pensel. Opprettholde skiver på RT i 45 minutter.</li>
		<li>Perfuse skivene med gasset rACSF på 35 ° C og med en sats på 1,5 mL/min. boble løsningen med en blanding av 95% O2 og 5% CO2. Merk: Etter dette trinnet sektorene er klar for elektrofysiologiske eksperimenter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enkelt befolkningen spike opptak
	<ol>
<li>Plass en hjerne skive i mikroskop-montert kammeret.</li>
		<li>Perfuse skive med en hastighet på 3 mL/min med rACSF.</li>
		<li>Dra Borosilikatglass brønnene med Pipetter puller har en motstand av ~ 2 MΩ. Merk: Denne brønnene som en innspilling elektrode og er elektrisk koblet til forsterkeren.</li>
		<li>Fyll i brønnene med en løsning som inneholder 2 M NaCl og plasser den i pipette innehaver av forsterkeren.</li>
		<li>Plasser opptak brønnene i stratum pyramidale i regionen CA1 på hippocampus sektoren med den høyre micromanipulator. Merk: Hvor er skjematisk representert i figur 7.</li>
		<li>Plasser en isolert bipolar platinum/iridium elektrode i holderen på den venstre micromanipulator. Merk: Denne elektrode brukes som stimulering elektroden og er elektrisk koblet til stimulans generatoren.</li>
		<li>Plasser elektroden stimulering i Schaffer collaterals i regionen CA1 på hippocampus sektoren med den høyre micromanipulator. Merk: Hvor er skjematisk representert i figur 7.</li>
		<li>Levere en aktuell puls til stimulering elektroden ved hjelp av stimulans generator hver 30 s (100 µs varigheter, start ved 10 µA) og gradvis øke stimulering styrken til en befolkning (PS) vises.</li>
		<li>Justere stimulans styrke til å fremkalle en PS tilsvarende 45% av maksimal amplituden som kan oppnås. PSs er filtrert på 2,4 KHz og digitalisert på 20 KHz bruker signalforsterkeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammen-puls hemming
	<ol>
<li>Forberede hjernen skiver (trinn 3.1) og fortsett som beskrevet tidligere (trinn 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Levere to nåværende pulser (100 µs varighet med 20 ms intervaller) til stimulering elektroden hver 30 s ved hjelp av stimulans generator. Angi stimulans styrke til å fremkalle en PS tilsvarende 45% av maksimal amplituden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammensatte testing
	<ol>
<li>Gjøre fortynninger av forbindelser skal testes i gasset ACSF slik at den endelige konsentrasjonen av DMSO ikke høyere enn 0,1%.</li>
		<li>Legge til DMSO kontrolløsning på samme konsentrasjonen enn i sammensatte løsningen.</li>
		<li>Registrere en enkelt (trinn 3.2) eller en sammenkoblet-puls (trinn 3.3) PS fremkalt av Schaffer sivile stimulations hver 30 s i minst 30 min. PS figuren skal være stabil i denne planlagte periode.</li>
		<li>Klargjør et beaker med gasset rACSF som inneholder en fast konsentrasjon av sammensatt skal testes.</li>
		<li>Perfuse hippocampus sektoren med denne løsningen mens de fortsatt registrering enkle eller sammenkoblet-puls PS.</li>
		<li>Vurdere utvinning sammensatte effekten av perfusing i sektoren med gasset rACSF uten sammensatte. Merk: For reversibel effekter, PS tilbakestilles til sin opprinnelige form observert i planlagte perioden før programmet sammensatte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dataanalyse
	<ol>
<li>Gjennomsnittlig PS sporene innspilt under eksperimentet i blokker med 4 med data analyseprogramvare.</li>
		<li>Måle PS amplituder av gjennomsnitt sporene.</li>
		<li>Normalisere amplituder i prosent av de opprinnelige verdiene registrert 10 min før perfusing en sammensatt.</li>
		<li>Uttrykke dataene som mener ± SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

Forfatterne Frédéric Knoflach og Maria-Clemencia Hernandez er ansatte i F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel i Sveits et farmasøytisk selskap. Forfatteren Daniel Bertrand er ansatt i HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Geneve, Sveits, gir screening fasiliteter til farmasøytiske selskaper.

Utviklingen av romanen forbindelser aktive på en ligand-gated ion kanal som GABAA receptors krever bruk av flere metoder. Vanligvis er første skritt ofte utført med bindende analyser; men er slike målinger utilstrekkelige for å karakterisere fysiologiske aktiviteten til sammensatt eller sin presise farmakologi. Spesielt en forbindelse som binder seg til en reseptor kan forbedre eller hemme funksjonen eller selv produsere ingen funksjonell effekt (være stille) (dvs., binder seg til reseptoren uten å endre dens funksjon). Dermed kreves en funksjonell test for full sammensatte karakteristikk.
Bindende analyser: Den største fordelen med bindende analysen er at det kan bli effektivt gjennomført på en rekke prøver opp til flere tusen, og at det gir bindende slektskap for den aktive molekyler. Som beskrevet her, består det første trinnet for å etablere en metode for vurdering av ønsket reseptor subtyper. Nemlig, mens binding kan gjennomføres på innfødt reseptorer brøker eller hele hjernen, slik metode vil hindre fastsettelse av slektskap på bestemte reseptor undertyper. Det er derfor nødvendig å bruke rekombinant systemer til skjermen molekyler på ønsket målet. I dag, tilbyr en forbigående eller stabil transfection av ønsket reseptor delenhet cDNAs i cellelinjer en effektiv og pålitelig metode for å uttrykke reseptor subtyper av interesse (f.eks, GABAA α5β3γ2). Tradisjonelle bindende analyser gjør bruk av radioligands, men i dag teknikker er tilgjengelig som unngå ulempen ved håndtering av radioaktivitet (f.eks, kvantitativ fluorescens-baserte ligand-bindende).
Funksjonelle uttrykk i et vertssystem: For å uttrykke genene i et vertssystem, må koding sekvensen rundt settes inn i en plasmider som inneholder de tilstrekkelig promoterere. Vanligvis for i vitro mRNA syntese brukes bakteriell T7 eller T6 promoterere. For en cDNA uttrykk, må transkripsjon av genet av interesse være regulert av en eukaryoter utbyggeren som CMV (cytomegalovirus) eller tilsvarende. I dag, er flere plasmider, inkludert de to promoterere (dvs., pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA) tilgjengelig slik at enten en i vitro syntese av mRNA eller et cDNA uttrykk som vist i Figur 15. Et uttrykk av GABAA reseptorer kan fås trofast i cellelinjer eller i Xenopus oocytes. De viktigste fordelene med sistnevnte er mangelen på en endogen reseptor uttrykk, enkelheten av manipulasjoner og tilgjengeligheten av et automatisert system for mikro-injeksjoner og opptak. Fremgangsmåtene i denne protokollen illustrerer effektiviteten av automatiserte system som kan injeksjon av 96 oocytes i ca 7 minutter og krever ingen micromanipulation ferdigheter. Husker at en enkelt eggstokk fra en Xenopus inneholder mellom 10000-30000 oocytes, er det klart at mange celle målinger kan gjennomføres på en enkelt forberedelse. Videre, som et uttrykk kan gjennomføres bruke cDNA injeksjoner, samme plasmider inneholder gener av interesse som er utviklet for bindingen eksperimenter kan brukes for funksjonell karakteristikk uten behov for ytterligere molekylærbiologi manipulasjoner.
Gitt sin store størrelse og høy overflate uttrykk, gir en enkelt oocyte en rekke reseptorer som omtrent tilsvarer confluent cellene i 35 mm Petriskål. Men representerer en oocytes forberedelse og injeksjon en brøkdel av kostnaden for en celle linje, som eksperimenter ikke krever en bestemt kultur medium og sterile manipulasjoner. Aktivering av én GABAA kanal gir noen picoamperes (10-12) og strømmer alt i titalls microampere (10-6) er lett registreres i en enkelt oocyte, som bekrefter samtidig aktiviteten til flere millioner av reseptorer i et enkelt svar.
Et første skritt i karakterisering av ligand-gated ionekanaler er ofte fastsettelse av tilsynelatende affinitet av reseptorer. Eksperimenter som må gjennomføres består av å bruke en rekke kort Agonistiske test pulser og plotte amplituden til den vakte gjeldende eller, i enkelte tilfeller området under kurven (AUC) som en funksjon av logaritmen av Agonistiske konsentrasjonen. Som det er lett mulig å microinject ulike plasmider konsentrasjoner og forhold i den samme gruppen av oocytes, er denne uttrykket spesielt egnet for slike karakteristikk. Videre avslørte en parti til parti sammenligning en høy grad av stabilitet for ulike EF50s. Påvirkning av delenhet sammensetningen på reseptorens tilsynelatende affinitet er lett visualisert bruker en edderkopp tomten, som eksemplifisert i Figur 10.
Resultatene av to elektrode spenning klemmen innhentet i Xenopus oocytes er ofte sammenlignet med opptak gjort med oppdateringen klemme elektroder. Mens det ville gå utenfor omfanget av dette arbeidet å gå inn i en detaljert sammenligning mellom disse to systemene, kan noen punkter undersøkes. Mens en patch klemme i celler tilbyr fordeler for Biofysiske karakteristikk med en rask medikament programmet, er dens krav mer komplekse enn to elektrode opptak i Xenopus oocytes. Et første og ikke-ubetydelig problemer er uttrykk for en gitt protein med nødvendigheten av en cellekultur, en forbigående eller stabil transfection og identifikasjon av celler som uttrykker den ønskede konstruere. I tillegg er det uunnværlig å undersøke mulige bidrag av endogene uttrykket i regnes cellen. Videre krever en patch klemme innspilling en dyktig person til å utføre micromanipulation under en høy forstørrelse mikroskop, mens vedkommende må også utføre en tilstrekkelig analyse under å vurdere, for eksempel kvaliteten på selen, tilgang motstanden etc. derimot en to-elektrode spenning klemme opptak, spesielt en ved hjelp av et automatisk elektrofysiologiske system, krever ikke noen spesielle ferdigheter og kan bli utført av laboratorium teknikere.
Da anskaffe en elektrofysiologiske oppsett, er pris vurdering sikkert en viktig faktor som må analyseres nøye. For eksempel, mens kostnaden for et automatisert system er relativt høy, avslører en nærmere sammenligning at installasjon av en fullstendig elektrofysiologiske rigg inkluderer kjøpe utstyr som god micromanipulators, en kikkert linse, en forsterker, en system, og en anti-vibrasjon tabell samtidig henter og utfører en analyse. En pris sammenligning mellom en to elektrode spenning klemme satt opp mot en patch klemme oppsett avslører ytterligere avvik. Videre er det automatiserte systemet tilbyr fordelen av fullt automatisert utstyr og kjører uovervåket dag og natt.
Farmakologiske egenskaper av et sammensatt bestemmes av modus for action på reseptoren. For eksempel er konkurrerende hemmere molekyler som kan angi samme binding lomme eller orthosteric området, som agonist selv forårsaker en konkurranse. Ikke-konkurrerende hemmere er forbindelser som hemmer receptors ved å kommunisere på et annet område og, i tilfellet en ligand-gated ion kanal, kan angi og blokkere ioniske pore, for eksempel. Det ville gå utenfor omfanget av dette arbeidet å undersøke ulike mekanismer for samhandling, men ytterligere informasjon kan fås fra en farmakologisk lærebok og/eller fra annet arbeid som Bertrand og Bertrand's22.
Ved allosteric modulatorer endrer de sammensatte binder på et område som er forskjellig fra orthosteric området, men tilstedeværelsen av molekylet energien barrieren mellom aktive og andre statene. Positiv allosteric modulatorer (PAMs) er forbindelser som reduserer energien barrieren fra hvile til aktiv tilstand, og derfor forsterke effekten av Agonistiske. Betegner mulig PAM effekter, er det derfor nødvendig for å fastslå om en eksponering til sammensatt forbedrer svaret Agonistiske og hvis så, på hvilke konsentrasjon. Eksperimenter i Figur 11 og figur 14 illustrerer protokoller som kan brukes med hell for karakterisering av PAMs på GABAA receptors.
I noen tilfeller kan eksponering til PAM alene være nok å aktivere receptors. Slik aktivitet kan bestemmes av en liten endring av eksperimentelle protokollen presenteres her. Nemlig, i stedet for en co-anvendelse av modulator under eksponeringen av GABA, protokollen kan endres for anvendelse av første sammensatte alene og i nærvær av GABA. Karakteristikk av direkte Agonistiske aktiviteten vil bli gjort ved fastsettelse av amplituden til svaret fremkalt av sammensatt selv og i forhold til gjeldende GABA-fremkalt.
Eksperimenter utført i hjernen skiver, som illustrert i figur 7brukes til å bekrefte sammensatte aktiviteten på innfødt reseptorer i en bestemt hemmende krets før du går videre i dyremodeller og langs veien mot kliniske studier. Relativt enkle data innspillingen og analyse protokollen tillater at rangeringen av flere forbindelser ved å evaluere deres differensial modulatory effekt på PS amplitude. Non-spesifikke effekter av forbindelser som ikke er relatert til GABA systemet kan også være oppdaget (f.eksnår endringer i PS figuren er observert). Direkte, GABAergic neurotransmission kan vurderes i disse tilfellene ved å måle effekten av forbindelser på hemmende postsynaptic strøm (IPSCs) bruker hele-celle oppdateringen klemme teknikk8.

Her presenterer vi protokoller for oppdagelsen av forbindelser aktive på GABAA reseptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi. I søk for romanen molekyler gjelder GABAA reseptorer, er det avgjørende å definere, så nøyaktig som mulig, undertypen av interesse og vurdering av spesifisitet av nylig identifisert forbindelser (f.eksfor gjennomgang, se Rudolph og Knoflach1eller Sieghart2). En typisk bane i stoffet funnet og trinnene som må oppnås er illustrert i figur 1.
Bindende analyser har vært og er fortsatt i stor grad brukes som første trinn i stoffet funnet. Ved GABAA reseptorer, er de optimalisert for å identifisere forbindelser som binder til benzodiazepiner binding området av reseptoren der terapeutisk nyttig og pengeskap narkotika binde. Andre teknikker, bruk fluorometric tenkelig plate leseren (FLIPR) membran potensielle røde fargebasert analyser3, oppdage forbindelser som barbiturater som binder seg til andre områder som er mindre ønskelig på grunn av deres uønsket side-effekt-profil. I tillegg kan de utnyttet fargestoffer direkte aktivere GABAA -reseptorer problematiserer dermed nytten av disse analyser for drug discovery4. Bindende analyser kan bare gi bevis for at en gitt sammensatt kan binde til en bestemt klasse. In vitro analyser med cellemembraner brukes til å identifisere selektiv menneskelige GABAA α5β3γ2 reseptor ligander. Transiently transfekterte HEK293 celler uttrykke den menneskelige GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 og α3β3γ2 reseptorer brukes til å forberede membraner disse analyser. Effekten av ligander oppdages ved å måle scintillation av [3H] flumazenil bundet til membran reseptorer (en hemming av [3H] flumazenil binding). Den største fordelen med denne teknikken er at en rask og effektiv fastsettelse av den sammensatte-forpliktende tilhørighet på reseptoren rundt tilbys på reseptoren av interesse.
Funksjonell studier er viktig å vurdere den funksjonelle aktiviteten av forbindelser og å foreslå en fysiologiske og farmakologiske forklaring av mekanismer forårsaket av binding av forbindelsene til receptors. I dag er det anerkjente at funksjonelle GABAA reseptorer resultere fra monteringen av fem underenheter rundt en akse av pseudosymmetry dannet av ionisk pore og resultat fra samlingen av fem identiske underenheter. De fleste av GABAA reseptorer består av to eller flere forskjellige underenheter. Stor hjerne GABAA reseptoren, for eksempel består av α1, β2 og γ2 underenheter i en støkiometri av 2, 2 og 1 henholdsvis5,6. En rekonstituering i et vertssystem som Xenopus oocytes eller HEK293 celler tilbyr muligheten til raskt å utforske de farmakologiske egenskapene av reseptorer.
Farmakologiske egenskaper av forbindelser er deretter undersøkt med ekstracellulære innspillinger i hjernen skiver7. Denne metoden tillater en utforskning av effekten av forbindelser på neurotransmission og gir en effektiv måte å bekrefte funksjonelle virkningene av forbindelser i heterologous uttrykk systemer på nivået av innfødte reseptorer i samlet neuronal miljø. GABAergic neurotransmission kan også vurderes på molekylært nivå ved å måle effekten av forbindelser på hemmende postsynaptic strøm (IPSCs)8. Men protokollen brukes her og basert på hele celle oppdateringen klemme opptak i hjernen skiver er mer forseggjort og gir en lavere gjennomstrømning.
Til slutt, styrker og svakheter for vitro screening gjennomgripende brukes for identifikasjon av α5β3γ2-selektiv ligander diskuteres i perspektiv av ulike teknikker og deres iboende begrensninger. Dette arbeidet bør gi eksperter og ikke-eksperter innen GABAA reseptorer en nyttig gjennomgang av kombinasjonen av ulike i vitro tilnærminger brukt å takle oppdagelsen av nye modulatorer disse ligand-gated ion kanaler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Dette manuskriptet presenterer en trinnvis protokoll for screening forbindelser på gamma-aminobutyric acid skriver en (GABAA) reseptorer og bruk mot identifikasjon av romanen molekyler i preklinisk analyser fra en i vitro rekombinant reseptor å deres farmakologiske effekter på innfødt reseptorer i gnager hjernen skiver. For forbindelser bindende på benzodiazepiner stedet reseptoren, er det første trinnet å sette opp en primære skjerm som består av å utvikle radioligand binding analyser på cellemembraner uttrykke store GABAA subtyper. Deretter benytte seg av heterologous uttrykk for gnager og menneskelig GABAA reseptorer i Xenopus oocytes eller HEK 293 celler, er det mulig å utforske, i elektrofysiologiske analyser, fysiologiske egenskapene til ulike reseptoren subtyper og Farmakologiske egenskaper av de identifiserte forbindelsene. Xenopus oocyte systemet vil bli presentert her starter med isolering av oocytes og deres microinjection med forskjellige mRNAs, til farmakologisk karakterisering ved hjelp av to elektrode spenning klemmer. Til slutt, opptak i gnager hjernen skiver beskrives som brukes som en sekundær fysiologiske test for å vurdere aktiviteten til molekyler på deres opprinnelige reseptorer i en veldefinert neuronal krets. Ekstracellulære innspillinger med befolkningen svar flere neurons er vist med narkotika-program.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Metoder for oppdagelsen av romanen forbindelser modulerende en Gamma - Aminobutyric Acid reseptor skriver en Neurotransmission

Her presenterer vi for å oppdage forbindelser aktiv ved GABAA reseptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Sammenkoblede Nanoinjection og Elektrofysiologi Assay til skjerm for bioaktivitet av forbindelser ved hjelp av Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Metoder for Intravenøs Selv Administration i en mus modell

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høyoppløselige funksjonell magnetisk resonans imaging metoder for Human midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder for å studere virkningsmekanismer av antipsykotiske legemidler i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Optisk Kontroll av en neuronal Protein Ved hjelp av en genetisk kodet Unaturlig Amino Acid i nevroner

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Etablere en musemodell av en ren lite Fiber nevropati med den Ultrapotent Agonist forbigående reseptor potensielle Vanilloid type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Romanen passiv fjerne metoder for rask produksjon av optisk åpenhet i hele CNS vev

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...