Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Авторы поблагодарить Джудит Lengyel, Мария Карг, Grégoire Friz, Рэйчел Haab и Мари Клер Pflimlin от Рош и Tifany Schaer и Дебора Паолуччи от HiQScreen за их прекрасную техническую помощь.

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

Авторы Frédéric Knoflach и Мария-Клеменсия Эрнандес являются сотрудниками F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Базель, Швейцария, фармацевтической компании. Автор Даниэль Бертран является сотрудником HiQScreen Sàrl 6, rte де Compois, 1222 Vésenaz Женева, Швейцария, обеспечивая отбора объектов для фармацевтических компаний.

Разработка новых соединений в закрытом лигандом ионного канала как рецепторы ГАМКA требует использования нескольких подходов. Как правило первый шаг часто проводится с помощью привязки анализов; Однако такие измерения являются недостаточными для характеризовать физиологической активности соединения или его точного фармакологии. В частности, соединение, которое связывается с рецептором могут повысить или препятствовать его функции или даже производить без функциональных эффект (молчать) (т.е., связывания с рецептором без изменения его функции). Таким образом функциональный тест не требуется для полного комплекса характеристики.
Обязательные анализы: Основным преимуществом assay привязки является что она может эффективно проводиться большое количество образцов, вплоть до нескольких тысяч и что она обеспечивает сходство привязки для активных молекул. Как описано здесь, первый шаг состоит из создания метода для оценки желаемого рецептор подтипы. А именно Хотя привязка может проводиться на родной рецепторов от фракций или весь мозг, такой метод позволит предотвратить определение сходства на подтипы специфическим рецептором. Это, таким образом, необходимо использовать Рекомбинатные системы для экрана молекул в желаемой цели. В настоящее время преходящий или стабильной трансфекции cDNAs Субблок желаемого рецепторов в клеточных линиях предлагает эффективный и надежный способ выразить подтипы рецепторов интерес (например, ГАМКA α5β3γ2). Традиционной привязки, сделать анализы использования radioligands, но в настоящее время методы доступны, избежать неудобств обработки радиоактивности (например, количественные лигандом привязку на основе флуоресценции).
Функциональные выражения в хост-системе: Чтобы выразить генов в хост-системе, кодирующая последовательность интереса должен быть вставлен в плазмиду, содержащий достаточное промоторов. Как правило в пробирке синтеза мРНК, используются бактериальные T7 или T6 промоторов. Для выражения cDNA транскрипции гена интереса должны регулироваться эукариоты promotor ЦМВ (цитомегаловирус) или эквивалент. В настоящее время несколько плазмидов, включая два промоторов (то есть, pUNIV, pCMV-6AC, psf ЦМВ/T7, pCI-neo, pcDNA), являются доступны позволяя в vitro синтез mRNA или cDNA выражение, как показано на рисунке 15. Рецепторов ГАМКA добросовестно получить выражение в клеточных линиях или в Xenopus ооцитов. Основными преимуществами последних являются отсутствие экспрессии эндогенных рецепторов, простоты манипуляций и наличия автоматизированной системы для микро инъекции и записей. Процедуры, описанные в настоящем Протоколе проиллюстрировать эффективность автоматизированной системы, которая позволяет инъекции 96 ооциты около 7 минут и не требует микроманипуляции навыков. Вспомнив, что один яичник от Xenopus содержит между 10000-30000 ооцитов, становится ясно, что большое количество клеток измерения могут проводиться на одном подготовки. Кроме того как выражение может проводиться с помощью инъекции cDNA, же плазмид, содержащие гены интереса, которые разрабатываются для экспериментов привязки может использоваться для функциональных характеристик без необходимости дальнейшего молекулярной биологии манипуляции.
Учитывая ее большого размера и высокой поверхности выражение, одной яйцеклетки дает количество рецепторов, что примерно эквивалентно вырожденная клетки в 35 мм Петри. Однако подготовка ооцитов и инъекций представляет часть стоимости клеточной линии, как эксперименты не требуют конкретных питательной среды и стерильные манипуляции. Активация одного канала ГАМКA дает несколько picoamperes (10-12) и течений, начиная до десятков МКА (10-6) легко записываются в одной яйцеклетки, которая подтверждает сопутствующей деятельности нескольких миллионов рецепторы во время ни одного ответа.
Первым шагом в характеристике лиганд закрытый ионных каналов часто является определение явно сродства рецепторов. Эксперименты, которые должны быть проведены состоят из применения ряда краткий агонист испытательных импульсов и заговоре амплитуда вызвал текущий или, в некоторых случаях, площадь под кривой (AUC)) как функция логарифма агонист концентрации. Как это легко осуществимо для microinject различных плазмида концентрации и соотношение в том же пакете яйцеклеток, эта система выражения особенно подходит для такой квалификации. Кроме того партии партии сравнения показали высокую степень стабильности для различных ЕС50s. Влияние состава Субблок на рецептор явное сходство легко визуализируется с помощью паука сюжет, как например, на рисунке 10.
Результаты двух электрод мембраной, полученные в Xenopus ооциты часто сравнивают с записей, сделанных с помощью электродов зажим патч. В то время как он будет выходить за рамки этой работы вдаваться в детальное сравнение между этими двумя системами, можно рассмотреть несколько моментов. В то время как патч зажим в клетках предлагает преимущества для биофизические характеристики с применением быстрых наркотиков, ее требования более сложны, чем те из двух электрод записей в Xenopus ооцитов. Первый и не ничтожно малый трудность это выражение данного белка с необходимость культуры клеток, переходный или Трансфекция стабильная и идентификации клеток, которые выражают нужную конструкцию. Кроме того он незаменим для изучения возможного вклада эндогенного выражения в рассматриваемой клетки. Кроме того запись зажим патч требует квалифицированного лица для проведения микроманипуляции под микроскопом высокого увеличения, в то время как это лицо также необходимо выполнить адекватного анализа в ходе эксперимента оценить, например, качество печати, доступ сопротивления и т.д. В отличие от двух электрод мембраной, записи, особенно один с использованием автоматизированной системы электрофизиологических, не требуют каких-либо конкретных навыков и может проводиться лаборантов.
При приобретении электрофизиологических set-up, стоимость рассмотрения, безусловно, важным фактором, который необходимо тщательно проанализировать. Например в то время как стоимость автоматизированной системы является относительно высокой, ближе сравнение показывает, что установка полного электрофизиологических Рог включает Покупка оборудования, таких как хороший микроманипуляторы, объектив бинокля, усилитель, перфузии системы и таблицу анти-вибрации, а также получения данных и проведения анализа. Сравнение стоимости между двух электродом напряжения зажим set-up против set-up зажим патч показывает даже дальнейшие расхождения. Кроме того автоматизированная система предлагает преимущество полностью автоматизированное оборудование и работает без присмотра днем и ночью.
Фармакологические свойства соединения определяется его режим действий на рецептор. К примеру конкурентные ингибиторы являются молекулы, которые можно ввести же привязки кармане или orthosteric сайта, как агониста, сам вызывает конкуренцию. Non конкурентные ингибиторы являются соединениями, которые подавляют рецепторов, взаимодействуя в другом месте и, в случае закрытого лигандом ионного канала, которые можно ввести и блокировать ионных поры, например. Это будет выходить за рамки этой работы для изучения различных механизмов взаимодействия, но дополнительную информацию можно получить из фармакологических учебника и/или от других работ, таких как Бертран и Бертран22.
В случае аллостерический модуляторы соединение связывает на сайте, отличном от сайта orthosteric, но присутствие молекулы изменяет энергетического барьера между активной и другими государствами. Позитивные аллостерический модуляторы (ПАМС) являются соединениями, которые снижают энергетического барьера от отдыха в активное состояние и, таким образом, усилить эффект агониста. Охарактеризовать возможные эффекты PAM, он, таким образом, необходимо определить воздействия комплекса повышает ответ агонист и, если да, в которых концентрация. Эксперименты, представлены на рисунке 11 и рис свидетельствуют протоколы, которые могут успешно использоваться для характеристики ПАМС на рецепторы ГАМКA .
В некоторых случаях подверженности PAM только может быть достаточно для того активировать приемные устройства. Такая деятельность может определяться небольшая модификация экспериментальный протокол, представленные здесь. А именно вместо совместного применения модулятора во время экспозиции к ГАМК, протокол может быть изменен для применения первого соединения один и затем в присутствии ГАМК. Характеристика деятельности прямой агонист будут сделаны определения амплитуда ответа вызываемые сам объект и по сравнению с ГАМК вызвала тока.
Эксперименты, проведенные в срезы мозга, такие, как показано на рисунке 7, используются для подтверждения соединения деятельности на родной рецепторов в определенный тормозной цепи прежде чем идти дальше, в животных моделях и вдоль пути к клинических испытаний. Протокол записи и анализа данных относительно простой позволяет рейтинге несколько соединений, оценивая их дифференциального модулирующее влияние на PS амплитуды. Неспецифические эффекты соединений, которые не связаны с ГАМК системы также могут быть обнаружены (например, когда наблюдаются изменения в форме Л.С.). Прямые, ГАМК синапсах может оцениваться в этих случаях измерения воздействия соединений на тормозной постсинаптический токов (IPSCs) с помощью поклеточного патч зажим техника8.

Здесь мы представляем протоколы для открытия активных соединений в ГАМК-А рецепторов, от привязки к физиологии и фармакологии. В поисках Роман молекулами специфически для ГАМК-А рецепторов, это важно определить, как можно точнее, подтип интерес и оценки специфика вновь установленных соединений (например, для обзора, см. Рудольф и Knoflach1или2Sieghart). Типичный путь в лекарственных препаратах и шаги, которые должны быть достигнуты показанного на рисунке 1.
Связывание анализов были и по-прежнему используются в качестве первого шага в лекарственных препаратах. В случае ГАМК-А рецепторов они оптимизированы для выявления соединений, привязанные к сайт связывания бензодиазепинов рецептора, где привязать терапевтически полезные и безопасных препаратов. Другие методы, с помощью флуориметрический изображений пластины читателя (FLIPR) мембраны потенциальных красный краситель на основе анализов3, обнаружить соединений как барбитураты, привязанные к дополнительные сайты, которые являются менее желательным ввиду их нежелательных профиль побочного эффекта. Кроме того используются красители непосредственно могут активировать ГАМК-А рецепторов, таким образом под сомнение полезность этих анализов для наркотиков discovery4. Обязательные анализы только может предоставить доказательства того, что данного соединения можно привязать к специфическим рецептором класса. В пробирке анализов с клеточных мембран используются для идентификации селективного человека ГАМКA α5β3γ2 рецепторов лиганды. Временно transfected клеток HEK293, выражая человеческие ГАМКA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 и α3β3γ2 рецепторов используются для подготовки мембраны для этих анализов. Эффект лигандами обнаруживается путем измерения сцинтилляционные [3H] флумазенил привязан к мембранных рецепторов (торможение [3H] флумазенил привязки). Основным преимуществом этого метода является, что быстрое и эффективное определение комплекса-сродство на рецептор интерес предоставляется на рецептор интерес.
Функциональные исследования необходимы для оценки функциональной активности соединений и предложить физиологические и фармакологические объяснение механизмов, вызванные привязка соединений на рецепторы. В настоящее время широко признается, что функциональные рецепторы ГАМКA результатом Ассамблеи пять подразделений вокруг оси pseudosymmetry, образованный ионных поры и результат от Ассамблеи пять одинаковых субъединиц. Большая часть рецепторов ГАМКA состоят из двух или более различных подразделений. Основных мозга ГАМК-А рецепторов, например, состоит из α1, β2 и γ2 субблоки в стехиометрии 2, 2 и 1 соответственно5,6. Воссоздание в хост-системе как Xenopus Ооциты или HEK293 клетки дает возможность быстро изучение фармакологических свойств рецепторов.
Фармакологические свойства соединений затем изучаются с внеклеточного записей в мозг ломтики7. Этот метод позволяет исследовать влияние соединений на синапсах и обеспечивает эффективный способ подтверждения функционального воздействия соединений определяется в системах гетерологичных выражения на уровне родного рецепторов в общем нейрональных окружающей среды. ГАМК синапсах могут также быть оценены на молекулярном уровне измерения воздействия соединений на тормозной постсинаптический токов (IPSCs)8. Однако протокол используется здесь и на основе записи зажим поклеточного патч в срезах головного мозга является более подробно и дает меньше пропускной способности.
Наконец сильные и слабые стороны в пробирке скрининга Каскад, используется для идентификации α5β3γ2-селективные лигандов обсуждаются в перспективе различных методов и их внутренние ограничения. Эта работа должна предоставить экспертов и не экспертов в области рецепторов ГАМКA полезный обзор комбинации различных в vitro подходы используются для решения обнаружения новых модуляторы этих лиганд закрытый ионных каналов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Эта рукопись представляет пошаговые протокол для проверки соединений на гамма аминомасляной кислоты типа рецепторов (ГАМКA) и его использование на выявление новых молекул в доклинических анализов из рекомбинантных в пробирке рецептор к их фармакологических эффектов на родной рецепторов в ломтики грызунов мозга. Для соединений привязки на сайте бензодиазепиновых рецепторов первым шагом является настройка основной экран, который состоит из разработки лиганд привязки анализов на клеточные мембраны, выражая основных подтипов ГАМКA . Затем воспользовавшись экспрессии гетерологичных рецепторов ГАМКA грызунов и человека в Xenopus Ооциты или ГЭС 293 клетки, это возможно для изучения, электрофизиологическое анализов, физиологические свойства различных рецепторов подтипы и фармакологические свойства определенных соединений. Система ооцитов Xenopus будут представлены здесь, начиная с изоляцией ооцитов и их микроинъекции с различных мРНК, до фармакологическая характеристика с помощью двух электродом напряжения зажимы. Наконец в грызунов мозга фрагменты записи будут описаны которые используются в качестве вторичного физиологических тестов для оценки активности молекул в их родной рецепторов в четко определенных нейронов цепи. Внеклеточные записи с помощью реакции населения несколько нейронов продемонстрировал наряду с применением наркотиков.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Методы для обнаружения новых соединений, модулирует гамма - аминомасляная кислота рецепторов типа синапсах

Здесь мы представляем протоколы обнаружить соединений, активных на рецепторы ГАМКA , от привязки к физиологии и фармакологии.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Аппарат Роман и метод по борьбе с наркотиками Усиление

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Применение NMDA-рецепторов в проводимости мозга крысы дофаминергических нейронов с помощью динамического Техника Clamp

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Парные Nanoinjection и электрофизиологии Анализ для выявления биологической активности соединений с использованием DROSOPHILA MELANOGASTER Гигантские системы волоконно

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Методы для внутривенного введения самостоятельной в мышиной модели

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Высокое разрешение функциональной магнитно-резонансной томографии методы по правам мозга

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Методы изучения механизмов действия антипсихотических препаратов в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Создание мыши модель чистой небольшой волоконно невропатии с Ultrapotent агонист Переходный рецепторный потенциал Vanilloid типа 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Роман пассивной очистки методы для быстрого производства оптической прозрачности в целом тканях ЦНС

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...