Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00
Duration: 7 min 16 s
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Los autores agradecen a Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab y Marie Claire Pflimlin de Roche y Tifany Schaer y Deborah Paolucci de HiQScreen por su excelente asistencia técnica.

Xenopus laevis se encuentra y según las directrices de animales del cantón de Ginebra.
1. así vinculante
<ol><li>
Preparación de la placa de ensayo
	<ol>
<li>Preparar 1.5 L de tampón de ensayo con 5 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 1.25 mM MgCl2, 120 mM de NaCl y 15 mM Tris; ajustar el pH con HCl a 7.4.</li>
		<li>Preparar los compuestos para ser probado en 50.76 μm (p. ej., un compuesto de 10 mM en un 980 μl de tampón de ensayo en un tubo de microcentrífuga de 5 μl). Mezcle bien usando una máquina de vórtice de alta velocidad para 2 – 5 s.</li>
		<li>Preparar una dilución previa de la referencia del flumazenil compuesto por pipeteo 1 μl del compuesto (10 mM) a 1.970 μl de tampón de ensayo. Mezcle bien usando una máquina de vórtice de alta velocidad para 2 – 5 s.</li>
		<li>Diluir una solución stock de [3H] flumazenil con el tampón de ensayo a 4 ° C a 4 nM en un tubo de polipropileno de 50 mL.</li>
		<li>Pipetear 50 μL/pocillo del tampón de ensayo en columnas 1 y 3-11 de una microplaca de 96 pocillos como se muestra en el layout de la placa representado en la figura 2.</li>
		<li>Pipetee 73.2 μl de los compuestos diluidos en 50.76 μm (ver paso 1.1.2) en la columna 12 de la placa.</li>
		<li>Diluir cada compuesto, mediante una progresión geométrica en 9 pasos (1E-10 -1E–06 M), con un volumen de transferencia μl 23,12 y llenar columnas 3 – 11. Homogeneizar la dilución. Cambiar la punta después de cada dilución.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluir las membranas celulares
	<ol>
<li>Descongelación las membranas celulares aisladas previamente de un receptor de GABAA humano expresando HEK293 (0.025 – 0.15 mg/mL) para obtener 80 mL a temperatura ambiente (RT) y transferir la suspensión al buffer de ensayo a 4 ° C.</li>
		<li>Agite la solución de membrana todavía a 4 ° C con un homogeneizador de tejidos para 30 – 40 s a 10.000-12.000 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluir el diazepam para el control de la Unión no específica (NSB)
	<ol>
<li>Diluir una solución 4 mM diazepam con el tampón de ensayo a una concentración de 40 μm en 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Iniciar la reacción
	<ol>
<li>Pipetear 50 μl de 4 nM [3H] flumazenil en cada pocillo de la placa de 96 pocillos y guárdela en un recipiente de agua con hielo.</li>
		<li>Añada 100 μl de la preparación de membranas de subtipo de GABAA receptor para tener una concentración de 0,5 mg/mL de proteína.</li>
		<li>Pipetear 50 μl de diazepam μm 40 en columna 2.</li>
		<li>Incube la placa durante 1 hora en hielo.</li>
		<li>Añadir 50 μl de tampón de ensayo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos filtro para la separación de membrana posterior y la medición de radiactividad y detener la reacción después.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detener la reacción
	<ol>
<li>Preparar un buffer de lavado con 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.</li>
		<li>Filtrar la solución utilizando una cosechadora celular de 96 pozos. Lave la placa de 3 x con 300 μL de tampón de lavado helada por pozo.</li>
		<li>Sellar la parte inferior de la placa con una capa de plástico y agregar 40 μl del cóctel para el líquido de centelleo centelleo contando en cada bien y limpiar con etanol 70%.</li>
		<li>Agitar suavemente la placa durante al menos 1 h a TA. Dejar reposar al menos una hora a TA.</li>
		<li>Medir la radioactividad (en CPM) colocando la placa en un contador de centelleo. Permiten una medición de 3 min por pozo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de datos
	<ol>
<li>Determinar que la media de las 8 réplicas de fijación no específica (NSB) y el atascamiento total (TB), así como los duplicados o triplicados de las muestras. Calcular el % unión específica (SB) para la media de cada muestra según la siguiente ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Aquí, total SB = la media TB menos el decir NSB.</li>
		<li>Parcela en abscisa la SB % versus en coordinar las concentraciones de inhibidor. Ajustar los datos utilizando la ecuación de análisis de la competencia solo sitio: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Aquí, y = % de SB, A = mínimo de y, B = el máximo de y, C = IC50, X = log10 de la concentración del compuesto que compiten, D = la pendiente de la curva (un coeficiente de Hill).</li>
		<li>Calcular la afinidad (Ki) con la concentración inhibitoria máxima media (IC50), la constante de disociación (Kd) de [3H] flumazenil en las respectivas membranas9y la concentración de [3H] Flumazenil en el ensayo según la siguiente ecuación de datos mediante: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. expresión y grabaciones en ovocitos de Xenopus
<ol><li>Los ovarios recolección y preparación de ovocitos
	<ol>
<li>Preparar la solución estéril de Barth 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O y 0,41 mM CaCl2.6H2O, a pH 7.4 , complementado con 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL y 0,25 μg/mL de anfotericina B.</li>
		<li>Preparar el medio de x OR2 1 (no CaCl2) 88,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, a pH 7.4.</li>
		<li>Sacrificio una Xenopus Laevis hembra por anestesia profunda por 20 min en frío Tricaine methanesulfonate (a una concentración de 150 mg/L, ajustada a pH 7.4) y bicarbonato sódico (300 mg/L) seguido de la decapitación.</li>
		<li>Cosechar los ovarios rápidamente con tijeras limpias y pinzas y colocarlos en 2 platos de Petri (10 cm) con 40 mL de 1 x solución de Barth y antibióticos/antimicótico.</li>
		<li>Almacenar los ovarios no disociado hasta 2 semanas en solución de Barth a 4 ° C.</li>
		<li>Para la disociación, cortar de los ovarios con una cuchilla de afeitar limpia en pequeñas fracciones (1 – 2 cm3) e incubar ellos en 50 mL de medio de OR2 sin CaCl2 (OR2-noCaCl2) que contiene 0.2% de colagenasa (tipo I) en 17 – 19 ° C en un cono de 100 mL matraz con una agitación lenta para 4-5 h. Compruebe que la barra magnética esté colocado aproximadamente 3 – 5 cm por encima del fondo del matraz spinner para evitar aplastar los ovocitos.</li>
		<li>Después de 4 a 5 h, verificar que la mayoría de los ovocitos es liberada de su folículo (es decir, nadan alrededor de forma individual). Lavar 5 veces con 200 mL de OR2 complementado con 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Transferencia defolliculated ovocitos a cajas Petri (10 cm) llenan de solución de Barth y antibióticos/antimicóticos y mantienen al menos durante la noche a 17 ° C antes de la inyección de cDNA o mRNA.</li>
		<li>En el día siguiente, seleccione debajo de un binocular, un ovocito sano que presenta una clara y distinta animal versus un polo vegetal (marrón oscuro para el polo animal versus amarillo claro para el polo vegetal). Usar Pipetas Pasteur limpias y disponer los ovocitos uno por uno en una placa bien del 96-inyección cónica estéril. Nota: no es necesario ningún cuidado especial en la colocación de los ovocitos de las inyecciones de mRNA; mientras que para las inyecciones de cDNA, es imprescindible orientar los ovocitos con el polo animal hacia arriba.</li>
	</ol></li>
	<li>inyección automática de mRNA o cDNA
	<ol>
<li>Sintetizar los mRNAs usando un kit disponible en el mercado siguiendo las instrucciones recomendadas. Limpiar los instrumentos y la mesa con RNasa y guantes de la protección adecuada. Nota: La calidad del mRNA es determinante para una buena expresión, y es indispensable para evitar la degradación del mRNA durante el procedimiento de inyección.</li>
		<li>Preparar cDNAs usando un kit disponible comercialmente y disolver la cantidad deseada de agua bidestilada en una concentración de 0,2 μg/μl.</li>
		<li>Inyectar 10-50 nL de solución de mRNA en una concentración de 0,2 μg/μl o 10 nL de cDNA solución a una concentración de 0.02-0.2 μg/μl, preferiblemente en lotes de 95 ovocitos.</li>
		<li>De membrana proteínas que requieren múltiples subunidades (es decir, receptores de GABAA heterómera α1β2γ2), mezcla de los mRNAs correspondientes o cDNAs de la proporción deseada (es decir, 1:1:1 o 1:10:1).</li>
		<li>Mantener el ovocito a 17 ° C para evitar la expresión de proteínas de choque térmico de los ovocitos; Guarde la microplaca en un área de almacenamiento térmico controlado.</li>
		<li>Disolver los compuestos de prueba que se dieron positivo en el ensayo del enlace en OR2 en 0.1-1.000 μm para las grabaciones electrofisiológicas y les tire apagado en una placa de polipropileno fondo plano de 96 pozos.</li>
	</ol></li>
	<li>Plásmidos de expresión
	<ol>
<li>Siga los manuales de instrucciones disponibles en el mercado de kits de para la síntesis de mRNA con el promotor T7 o T6 bacteriana y 20 μl de una solución al 0.2 μg/μl de agua libre de ARNasa.</li>
		<li>Preparar al menos 20 μl de una solución que contiene un vector de expresión eucariotas para la expresión de cDNA, típicamente a 0,2 μg/μl disueltas en agua bidestilada.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinyección en el ovocito y la visualización de su calidad
	<ol>
<li>Inyectar 10-50 nL de la solución que contiene el plásmido (ver paso 2.3.1 o 2.3.2) utilizando una aguja de inyección micro de vidrio con un diámetro de punta que van hasta 100 μm montado en un instrumental quirúrgico equipado con un sistema de eyección de presión o con un sistema de inyección automatizado. Nota: En el ejemplo discutido aquí, los ovocitos se inyectan por lotes de 95 con un sistema automatizado adecuado para uso con cDNA o mRNA.</li>
		<li>Llenan la aguja de inyección de 1 μl de un colorante como el azul de metileno al 1% e inyectar los ovocitos utilizando el procedimiento estándar (o en el núcleo de cDNA en el citoplasma por el ARNm).</li>
		<li>Deseche los ovocitos inyectados por aproximadamente 1 minuto en agua hirviendo. Corte los ovocitos a la mitad con una cuchilla de afeitar debajo de un binocular. Nota: El tinte permanece localizado como se muestra en la figura 3E, lo que permite una observación precisa de la inyección.</li>
	</ol></li>
	<li>Grabaciones de la abrazadera del voltaje de dos electrodos
	<ol>
<li>Coloque la placa bien que contienen los ovocitos en el sistema automatizado, que utiliza el principio ilustrado en la figura 4. Nota: En contraste con el sistema de abrazadera de parche ilustrado en la figura 5, el potencial de membrana verdadera de la célula es leído por el electrodo de tensión.</li>
		<li>Programar el sistema de grabación automatizada con la interfaz basada en iconos, por ejemplo, el esquema ilustrado en la figura 6 para la determinación de la relación de la actividad de concentración.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste de curvas
	<ol>
<li>Analizar los resultados usando el software apropiado, usando la curva de activación concentración ilustrado, parcela la amplitud actual en función del logaritmo de la concentración del agonista.</li>
		<li>Observar la curva sigmoidal que puede ser equipada posteriormente con la ecuación empírica de la colina en la forma: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Aquí, Y= la fracción de corriente evocada, CE 50 = la concentración para la activación de un 50%, x = concentración del compuesto, nH = el coeficiente de Hill o cooperatividad aparente.</li>
		<li>Normalizar las corrientes para una unidad dividiendo la amplitud de cada respuesta versus el valor grabado en la concentración más alta para analizar los datos obtenidos de una serie de células.</li>
		<li>Determinar la media y error estándar y realizar el ajuste de curvas utilizando software disponible en forma estándar.</li>
	</ol></li>
</ol>3. electrofisiológicas grabaciones en rebanadas de cerebro
Nota: Rebanadas de hipocampo de rata son preparados de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales.
<ol><li>
Preparación de cortes de hipocampo
	<ol>
<li>Preparar el disección cerebroespinal líquido artificial (dACSF) con NaCl 124 de 124 mM, 2,5 mM KCl, 1.25 m m KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, glucosa 10 mM y 4 mM sacarosa gaseado en la botella con una mezcla de 95% O2 y 5% CO2.</li>
		<li>Preparar el grabación cerebroespinal líquido artificial (rACSF) con 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 m m KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3y 10 mM de glucosa gas en la botella con una mezcla de 95% O2 y 5% CO2.</li>
		<li>Anestesiar las ratas con una mezcla de 2.5% de isoflurano y oxígeno puro y decapita a los.</li>
		<li>Cortar el cuero cabelludo siguiendo la línea media con un buen par de tijeras. Cortar el cráneo a lo largo de la línea media sin dañar el tejido subyacente. Retire el cráneo con las pinzas y use una espátula fina para sacar el cerebro.</li>
		<li>El cerebro en la solución de dACSF gaseados en RT y diseccionar la formación hipocampal izquierda con una espátula fina.</li>
		<li>Cortar rodajas transversales (400 μm de espesor) de la parte media del hipocampo con un picador de tejido y traslado a la sala de grabación con el uso de un pincel de pintura. Mantener las rodajas a temperatura ambiente durante 45 minutos.</li>
		<li>Inundar las rebanadas con el rACSF gaseado a 35 ° C y a una velocidad de 1,5 mL/min la burbuja la solución con una mezcla de 95% O2 y 5% CO2. Nota: Después de este paso, los trozos están listos para los experimentos electrofisiológicos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Grabación de espiga única población
	<ol>
<li>Coloque un trozo de cerebro en la cámara de microscopio montado.</li>
		<li>Inundar el sector a un ritmo de 3 mL/min con rACSF.</li>
		<li>Tire de una micropipeta de vidrio borosilicato con el tirador de la pipeta tiene una resistencia de MΩ ~ 2. Nota: Esta micropipeta se utiliza como un electrodo de registro y se conecta eléctricamente al amplificador.</li>
		<li>La micropipeta se llenan de una solución 2 M de NaCl y colóquelo en el soporte de la pipeta del amplificador.</li>
		<li>Posición de la micropipeta de grabación en el pyramidale del estrato en la región CA1 de la rebanada hippocampal utilizando el instrumental quirúrgico adecuado. Nota: La ubicación se representa esquemáticamente en la figura 7.</li>
		<li>Colocar un electrodo de platino/iridio bipolar aislado en el soporte en el micromanipulador izquierdo. Nota: Este electrodo se utiliza como el electrodo de estimulación y está conectada eléctricamente al generador de estímulo.</li>
		<li>Coloque el electrodo de estimulación en los collaterals de Schaffer en la región de CA1 de la rebanada hippocampal utilizando el instrumental quirúrgico adecuado. Nota: La ubicación se representa esquemáticamente en la figura 7.</li>
		<li>Entrega un pulso de corriente al electrodo de estimulación mediante el generador de estímulos cada 30 s (100 μs de duración, a partir de las 10 μA) y poco a poco aumentar la fuerza de estímulo hasta que aparece un aumento de la población (PS).</li>
		<li>Ajustar la fuerza de estímulo para evocar un PS correspondiente al 45% de la amplitud máxima que puede obtenerse. PSs son filtrados a 2,4 KHz y digitalizados en 20 kilociclos usando el amplificador de señal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inhibición de junto-pulso
	<ol>
<li>Preparar las rebanadas de cerebro (paso 3.1) y proceder como se describe anteriormente (medidas 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Entregar dos pulsos corriente (100 μs de duración en un intervalo de 20 ms) al electrodo de estimulación cada 30 s usando el generador de estímulos. Establecer la fuerza de estímulo para evocar un PS correspondiente al 45% de la máxima amplitud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compuesto de prueba
	<ol>
<li>Hacer las diluciones de los compuestos en ACSF gaseado para que la concentración final de DMSO no superior al 0,1%.</li>
		<li>Agregue el DMSO a la solución de control en la misma concentración que la solución compuesta.</li>
		<li>Grabar un single (paso 3.2) o un PS de junto-pulso (paso 3.3) evocado por estímulos colaterales de Schaffer cada 30 s durante al menos 30 minutos. La forma de PS debe ser estable durante este período de referencia.</li>
		<li>Preparar un vaso de precipitados con gaseados rACSF que contiene una concentración fija del compuesto a ensayar.</li>
		<li>Inundar el hipocampo rebanada con esta solución durante la grabación todavía PS solo o emparejado de pulso.</li>
		<li>Evaluar la recuperación del efecto compuesto por perfundiendo la rebanada con rACSF gaseado sin el compuesto. Nota: Para efectos reversibles, el PS volverá a su forma inicial observado durante el período de base antes de la aplicación compuesto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de datos
	<ol>
<li>Promedio los rastros PS registran durante el experimento en bloques de 4 con el software de análisis de datos.</li>
		<li>Medir las amplitudes de PS de los rastros de promedio.</li>
		<li>Normalizar las amplitudes como un porcentaje de los valores de referencia registrados 10 min antes perfundiendo un compuesto.</li>
		<li>Expresar los datos como media ± SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

Los autores Frédéric Knoflach y Maria Clemencia Hernandez son empleados de F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, Suiza, una compañía farmacéutica. El autor Daniel Bertrand es un empleado de HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Ginebra, Suiza, proporcionando instalaciones de proyección a las compañías farmacéuticas.

El desarrollo de nuevos compuestos activos en un canal ligand-gated ion tales como los receptores de GABAA requiere el uso de múltiples enfoques. Por lo general, el primer paso se realiza a menudo usando análisis de enlace; sin embargo, tales medidas no son suficientes para caracterizar la actividad fisiológica de lo compuesto o su farmacología precisa. En particular, un compuesto que se une a un receptor puede potenciar o inhibir su función o incluso no producir ningún efecto funcional (callar) (es decir, atan a los receptores sin modificar su función). Por lo tanto, una prueba funcional es necesaria para una caracterización del compuesto completo.
Enlace ensayos: La principal ventaja de la prueba enlace es que pueden realizarse eficientemente en un gran número de muestras que se extienden hasta varios miles y que proporciona las afinidades de enlace para las moléculas activas. Como se describe en este documento, el primer paso consiste en establecer un método para la evaluación de los subtipos del receptor deseado. Es decir, mientras que Unión se puede conducir en receptores nativos de fracciones o el cerebro entero, dicho método evitará que la determinación de las afinidades en subtipos de receptor específico. Por lo tanto, es necesario utilizar sistemas recombinantes a las moléculas de la pantalla en el destino deseado. Hoy en día, una transfección transitoria o estable de los cDNAs de la subunidad del receptor deseado en líneas celulares ofrece un método eficaz y fiable para expresar los subtipos de receptores de interés (p. ej., GABAA α5β3γ2). Encuadernación tradicional ensayos hacen uso de radioligands, pero hoy en día las técnicas son disponibles que evita los inconvenientes de manejo de radiactividad (por ejemplo, cuantitativo basados en fluorescencia-ligando).
Expresión funcional de un sistema de host: Para expresar genes en un sistema de host, la secuencia de codificación de interés debe insertarse en un plásmido que contiene el promotor adecuado. Por lo general, para en vitro la síntesis de ARNm, se utiliza el promotor T7 o T6 bacteriana. Para una expresión de cDNA, la transcripción del gen de interés debe ser regulada por un promotor de eucariontes como CMV (citomegalovirus) o su equivalente. Hoy en día, varios plásmidos, entre ellos los dos promotores (es decir, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), están disponibles permitiendo una en vitro la síntesis de mRNA o una expresión de cDNA como se muestra en la figura 15. Una expresión de los receptores GABAA puede obtenerse fielmente en líneas celulares o en oocytes del Xenopus . Las principales ventajas de este último son la falta de expresión del receptor endógeno, la simplicidad de las manipulaciones y la disponibilidad de un sistema automatizado para micro-inyecciones y grabaciones. Los procedimientos descritos en este protocolo ilustran la eficacia del sistema automatizado que permite la inyección de 96 ovocitos en unos 7 min y requiere ningunas habilidades de micromanipulación. Recordar que un solo ovario de un Xenopus contiene entre 10.000-30.000 oocitos, es evidente que un gran número de mediciones de la célula puede realizarse en una sola preparación. Por otra parte, como una expresión puede realizarse utilizando inyecciones de cDNA, el mismo plásmidos que contienen los genes de interés que se desarrollan para los experimentos de Unión puede ser utilizada para una caracterización funcional sin necesidad de más biología molecular manipulaciones.
Por su gran tamaño y alta expresión superficial, un ovocito solo produce una serie de receptores que es aproximadamente equivalente a las células confluentes en una placa de Petri de 35 mm. Sin embargo, una preparación de ovocitos e inyección representa una fracción del costo de una línea celular, como los experimentos no requieren de un medio de cultivo específico y manipulaciones estériles. La activación de un solo canal de GABAA rinde algunos picoamperes (10-12) y las corrientes que van hasta decenas de microamperios (10-6) se registran fácilmente en un solo ovocito, que confirma la actividad concomitante de varios millones de receptores en una sola respuesta.
Un primer paso en la caracterización de canales ligand-bloqueados del ion es a menudo la determinación de la afinidad aparente de los receptores. Los experimentos que deben llevarse a cabo consisten en aplicar una serie de pulsos de prueba breve agonista y trazar la amplitud de los evocados actual o, en algunos casos, el área bajo la curva (AUC) como una función del logaritmo de la concentración del agonista. Como es fácilmente factible microinject plásmido diferentes concentraciones y relación en el mismo lote de ovocitos, este sistema de expresión es particularmente apropiado para dicha caracterización. Por otra parte, una comparación de lote a lote reveló un alto grado de estabilidad para diferentes s de50CE. La influencia de la composición de la subunidad de afinidad aparente del receptor se visualiza fácilmente usando un diagrama de araña, como en la figura 10.
Los resultados de la abrazadera del voltaje de dos electrodos en oocytes del Xenopus se comparan a menudo con grabaciones hechas usando electrodos de pinza de parche. Considerando que iría más allá del alcance de este trabajo entrar en una detallada comparación entre estos dos sistemas, se pueden examinar algunos puntos. Mientras que una abrazadera del remiendo en las células ofrece ventajas para una caracterización biofísica con una solicitud de fármaco rápido, sus necesidades son más complejas que las de las grabaciones de dos electrodos en oocytes del Xenopus . Una dificultad primera y no despreciable es la expresión de una proteína dada la necesidad de un cultivo celular, un transitorio o transfección estable, y la identificación de las células que expresan la construcción deseada. Además, es indispensable examinar la contribución posible de la expresión endógena en la celda considerada. Por otra parte, una grabación de abrazadera de parche requiere un experto para llevar a cabo la micromanipulación bajo un microscopio de alta magnificación, mientras que esa persona también tiene que realizar un análisis adecuado durante el experimento para evaluar, por ejemplo, la calidad del sello, la resistencia de acceso etc. , en contraste, una pinza de voltaje de dos electrodos de grabación, especialmente uno usando un sistema electrofisiológico automatizado, no requiere de ninguna habilidad específica y puede llevarse a cabo por técnicos de laboratorio.
Al adquirir una instalación electrofisiológico, consideración de costo es un factor importante que debe ser cuidadosamente analizado. Por ejemplo, mientras que el costo de un sistema automatizado es relativamente alto, una comparación más cercana revela que la instalación de una plataforma electrofisiológica completa incluye compra de equipo como buen micromanipuladores, una lente de binocular, un amplificador, una perfusión sistema y una mesa antivibraciones, adquisición de datos y realizar un análisis. Una comparación de costes entre un voltaje de dos electrodos abrazadera instalación frente a un montaje de abrazadera de parche revela discrepancias aún más. Además, el sistema automatizado ofrece la ventaja de equipo totalmente automatizado y funciona sin vigilancia día y noche.
Las propiedades farmacológicas de un compuesto están determinadas por su modo de acción en el receptor. Por ejemplo, los inhibidores competitivos son moléculas que pueden entrar en el mismo bolsillo de Unión, o en sitio de orthosteric, como el agonista produce una competencia. Inhibidores no competitivos son compuestos que inhiben los receptores interactuando en otro sitio y, en el caso de un canal ligand-bloqueado del ion, que pueden entrar y bloquear el poro iónico, por ejemplo. Iría más allá del alcance de este trabajo examinar los diferentes mecanismos de interacción, pero más información se puede obtener de un libro farmacológico o de otros trabajos como Bertrand y de Bertrand22.
En el caso de moduladores alostéricos, el compuesto se une en un sitio distinto del sitio de orthosteric, pero la presencia de la molécula modifica la barrera de energía entre los Estados activos y otros. Moduladores alostéricos positivos (PAMs) son compuestos que reducen la barrera de la energía de la reclinación al estado activo y, por lo tanto, aumentar el efecto de los agonistas. Para caracterizar efectos de PAM, es, por lo tanto, necesario determinar si la exposición al compuesto mejora la respuesta al agonista y, si es así, en el que la concentración. Los experimentos presentados en la figura 11 y figura 14 ilustran los protocolos que pueden utilizarse con éxito para la caracterización de PAMs en los receptores GABAA .
En algunos casos, la exposición a la PAM solo puede ser suficiente para activar los receptores. Esta actividad puede determinarse por una ligera modificación del protocolo experimental presentado aquí. Es decir, en lugar de utilizar una aplicación conjunta del modulador durante la exposición a la GABA, el protocolo puede modificarse para la aplicación del primer compuesto solo y luego en presencia del GABA. Una caracterización de la actividad agonista directa se realizará mediante la determinación de la amplitud de la respuesta evocada por el compuesto sí mismo y en comparación con la corriente evocada por el GABA.
Experimentos llevados a cabo en rebanadas de cerebro, tal como se ilustra en la figura 7, se utilizan para confirmar la actividad compuesta en receptores nativos en un circuito inhibitorio definido antes de ir más lejos en modelos animales y en el camino hacia ensayos clínicos. El protocolo de registro y el análisis de datos relativamente simple permite la clasificación de compuestos múltiples evaluando su diferencial efecto modulador en amplitud de PS. Efectos no específicos de los compuestos que no están relacionados con el sistema de GABA también pueden ser detectado (por ejemplo, cuando se observan cambios en la forma de PS). Directa, la neurotransmisión GABAérgica puede ser evaluada en estos casos mediante la medición de los efectos de los compuestos inhibitorios postsinápticos corrientes marinas (IPSCs) usando células completas parche abrazadera técnica8.

Aquí, presentamos protocolos para el descubrimiento de compuestos activos en los receptores GABAA , de la Unión a la fisiología y la farmacología. En la búsqueda de nuevas moléculas específicas para los receptores GABAA , es crucial definir, tan precisamente como sea posible, el subtipo de interés y la evaluación de la especificidad de los compuestos recién identificados (por ejemplo, para una revisión, ver Rudolph y Knoflach1o Sieghart2). Una trayectoria típica en el descubrimiento de medicamentos y los pasos que deben realizarse se ilustran en la figura 1.
Ensayos de Unión han sido y son utilizados en gran parte como el primer paso en el descubrimiento de medicamentos. En el caso de los receptores GABAA , que están optimizadas para identificar compuestos que se unen al sitio de unión de benzodiazepinas de los receptores donde se unen las drogas terapéuticamente útiles y seguras. Otras técnicas, utilizando fluorométrico imagen placa lector (FLIPR) membrana potenciales ensayos de tinte rojo3, detectan compuestos como barbitúricos que se unen a otros sitios que son menos deseables debido a su perfil de efectos secundarios no deseado. Además, los tintes utilizados pueden activar directamente los receptores GABAA , cuestionando así la utilidad de estos análisis para drogas discovery4. Enlace ensayos sólo puede proporcionar la evidencia de que un determinado compuesto puede enlazar a una clase de receptor específico. In vitro ensayos con las membranas celulares se utilizan para identificar selectivo GABAA de ligandos de receptor humanos α5β3γ2. Células HEK293 transitorio transfected expresando el humano GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 y α3β3γ2 receptores se utilizan para preparar las membranas para estos ensayos. El efecto de los ligandos se detecta midiendo el centelleo de [3H] flumazenil a los receptores de membrana (una inhibición de la Unión de [3H] flumazenil). La principal ventaja de esta técnica es que se facilite una rápida y eficaz determinación de la afinidad de compuestos en el receptor de interés en el receptor de interés.
Los estudios funcionales son esenciales para evaluar la actividad funcional de los compuestos y proponer una explicación fisiológica y farmacológica de los mecanismos causado por el atascamiento de los compuestos a los receptores. Hoy en día, es conocido que los receptores GABAA funcional resultan de la Asamblea de cinco subunidades alrededor de un eje de pseudosymmetry formado por el poro iónico y resultado de la Asamblea de cinco subunidades idénticas. La mayoría de los receptores GABAA se compone de dos o más subunidades diferentes. El receptor principal cerebro GABAA , por ejemplo, se compone de las subunidades α1, β2 y γ2 en una estequiometría de 1, 2 y 2 respectivamente5,6. Una reconstitución en un sistema host como la Xenopus ovocitos o células HEK293 ofrece la posibilidad de explorar rápidamente las propiedades farmacológicas de los receptores.
Luego se exploran las propiedades farmacológicas de los compuestos con registros extracelulares en rebanadas de cerebro7. Este método permite una exploración del efecto de los compuestos en la neurotransmisión y proporciona una manera eficaz para confirmar los efectos funcionales de los compuestos que se determinan en los sistemas de expresión heteróloga en el nivel de los receptores nativos en general medio ambiente neuronal. Neurotransmisión GABAérgica puede ser evaluada a nivel molecular por la medición de los efectos de los compuestos corrientes postsinápticas inhibitorios (IPSCs)8. Pero el protocolo aquí utilizado y basado en grabaciones de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro es más elaborado y produce un rendimiento inferior.
Finalmente, se discuten las fortalezas y debilidades de la en vitro cascada utilizado para la identificación de ligandos selectivos α5β3γ2 en la perspectiva de las diferentes técnicas y sus limitaciones intrínsecas. Este trabajo debe proporcionar expertos y no expertos en el campo de los receptores GABAA una útil revisión de la combinación de enfoques diferentes en vitro que se utiliza para abordar el descubrimiento de nuevos moduladores de estos canales ligand-bloqueados del ion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Presenta manuscrito un protocolo paso a paso para la detección de compuestos en gamma-aminobutírico ácido tipo un receptores (GABAA) y su uso hacia la identificación de nuevas moléculas en ensayos preclínicos de un recombinante en vitro receptor para sus efectos farmacológicos en receptores nativos en rebanadas de cerebro de roedor. Para compuestos de enlace en el sitio de benzodiazepinas de los receptores, el primer paso es configurar una pantalla principal que consiste en desarrollar ensayos de atascamiento radioligand sobre las membranas celulares que expresan los subtipos principales de GABAA . Entonces, aprovechando la expresión heteróloga de los receptores GABAA roedores y humanos en oocytes del Xenopus o células de HEK 293, es posible explorar en estudios electrofisiológicos, las propiedades fisiológicas diferentes del receptor de la subtipos y las propiedades farmacológicas de los compuestos identificados. El sistema del oocyte del Xenopus , se presentará a partir del aislamiento de los ovocitos y la microinyección con mRNAs diferentes, hasta la caracterización farmacológica con pinzas de voltaje de dos electrodos. Finalmente, se describirán grabaciones realizadas en rebanadas de cerebro de roedor que se utilizan como una prueba fisiológica secundaria para evaluar la actividad de las moléculas de sus receptores nativos en un circuito neuronal bien definido. Grabaciones extracelulares utilizando las respuestas de la población de neuronas múltiples se demuestran junto con la aplicación de la droga.

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Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Métodos para el descubrimiento de nuevos compuestos modular un Receptor del ácido Gamma - Aminobutírico tipo una neurotransmisión

Aquí, presentamos protocolos para descubrir compuestos activos en los receptores GABAA , de la Unión a la fisiología y la farmacología.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Novela Aparato y método para el fortalecimiento de Drogas

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Investigación

Neurociencias

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Aplicación de una conductancia del receptor NMDA en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

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