Name: methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Författarna tackar Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, och Marie Claire Pflimlin från Roche och Tifany Schaer och Deborah Paolucci från HiQScreen för deras utmärkta tekniskt bistånd.

Xenopus laevis är inrymt och hanteras enligt de riktlinjer som Genève Canton djur.
1. Radioligand bindande
<ol><li>
Beredning av assay plattan
	<ol>
<li>Förbereda 1,5 L analysbuffert med 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl och 15 mM Tris; Justera pH med HCl till 7,4.</li>
		<li>Förbereda föreningarna som skall provas vid 50.76 µM (t.ex., en 5 µL sammansatta på 10 mM i en 980 µL analysbuffert i en mikrocentrifug rör). Blanda dem väl med en vortex maskin i hög hastighet för 2 – 5 s.</li>
		<li>Förbereda en utspädning av den referens sammansatta flumazenil genom pipettering 1 µL av föreningen (10 mM) till 1,970 µL analysbuffert. Blanda dem väl med en vortex maskin i hög hastighet för 2 – 5 s.</li>
		<li>Späd en [3H] flumazenil stamlösning med Analysbuffert vid 4 ° C till 4 nM i en 50 mL polypropylen tub.</li>
		<li>Pipettera 50 µL per brunn av analysbuffert i kolumnerna 1 och 3 – 11 i en 96 brunnar mikroplattan som visas i layouten plattan representerade i figur 2.</li>
		<li>Pipettera 73,2 µL av de föreningar som utspätt till 50.76 µM (se steg 1.1.2) i kolumn 12 av plattan.</li>
		<li>Späd varje förening, använda en geometrisk progression över 9 steg (1E-10 – 1E–06 M), med en 23.12 µL överföring volym och fyll kolumner 3 – 11. Blanda utspädning. Byt spets efter varje utspädning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Späd cellmembranen
	<ol>
<li>Tina de cellmembran som tidigare isolerade från en HEK293 overexpressing humana GABAA -receptorn (0,025 – 0,15 mg/mL) att erhålla 80 mL vid rumstemperatur (RT) och överföra suspensionen till analysbuffert vid 4 ° C.</li>
		<li>Återsuspendera membran lösningen fortfarande vid 4 ° C med en vävnad Homogenisatorer för 30 – 40 s vid 10.000 – 12.000 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Späd diazepam för icke-specifik bindning (NSB) kontroll
	<ol>
<li>Späd en 4 mM diazepam stamlösning med Analysbuffert till en koncentration av 40 µM i 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Starta reaktionen
	<ol>
<li>Överför med pipett 50 μl av 4 nM [3H] flumazenil till varje brunn plattan med 96 brunnar och hålla den i en isvatten behållare.</li>
		<li>Tillsätt 100 µL av GABAA receptor subtyp membran preparatet har en proteinkoncentration av 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Överför med pipett 50 μl av 40 µM diazepam till kolumn 2.</li>
		<li>Inkubera plattan för 1 h på is.</li>
		<li>Tillsätt 50 µL analysbuffert i varje brunn 96 brunnar filter platta för efterföljande membran separation och radioaktivitet mätning och stoppa reaktionen efteråt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stoppa reaktionen
	<ol>
<li>Förbereda en tvätt buffert med 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.</li>
		<li>Filtrera lösningen med en 96 brunnar cell skördare. Tvätta plattan 3 x med 300 µL av iskall tvätt buffert per brunn.</li>
		<li>Försegla botten av plattan med en plastfilm och tillsätt 40 µL av scintillation cocktail för liquid scintillation räknar i varje brunn och torka av den med etanol 70%.</li>
		<li>Skaka försiktigt plattan för minst 1 h på RT. Låt den stå i minst en timme vid RT.</li>
		<li>Mäta radioaktiviteten (i CPM) genom att placera plattan på ett scintillationsräknare. Kan en mäta för 3 min per brunn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analys av data
	<ol>
<li>Bestämma medelvärdet för 8 replikerar av icke-specifik (NSB) och den totala bindningen (TB) samt när det gäller de dubbletter eller exemplar av proverna. Beräkna den % specifika bindningen (SB) för medelvärdet av varje prov enligt följande ekvation: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Här totala SB = den genomsnittliga TB minus det menar NSB.</li>
		<li>Rita i abskissan % SB kontra i ordinate hämmare koncentrationerna. Passa data med hjälp av enda plats konkurrens analys ekvation: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Här y = % av SB, A = minsta möjliga y, B = maximum av y, C = IC50, X = log10 av koncentrationen av konkurrerande föreningen, D = lutningen på kurvan (en Hill koefficient).</li>
		<li>Beräkna det affinitet (Ki) använder den halv maximal hämmande koncentrationen (IC50), dissociationskonstant (Kd) av [3H] flumazenil på respektive membran9och koncentrationen av [3H] Flumazenil i analysen enligt följande data-med ekvation: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2.-receptoruttryck och inspelningar i Xenopus oocyter
<ol><li>Äggstockarna skörd och äggcell förberedelse
	<ol>
<li>Förbereda den sterila Barth lösningen med 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (nr3)2.4h2O och 0,41 mM CaCl2.6H2O, vid pH 7,4 , kompletterat med 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 0,25 µg/mL amfotericin B.</li>
		<li>Förbereda det 1 x OR2 mediet (ingen CaCl2) med 88,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, vid pH 7,4.</li>
		<li>Offra en Xenopus Laevis kvinnliga av djup anestesi i 20 min i kylda Tricaine methanesulfonate (med en koncentration av 150 mg/L, justeras vid pH 7,4) och natriumbikarbonat (300 mg/L) följt av halshuggning.</li>
		<li>Skörda äggstockarna snabbt med ren sax och pincett och placera dem i 2 Petri-rätter (10 cm) fylld med 40 mL 1 x Barth lösning och antibiotika/antimycotic.</li>
		<li>Lagra icke-differentierade äggstockarna för upp till 2 veckor i Barth lösning vid 4 ° C.</li>
		<li>För dissociationen, skär äggstockarna med en ren rakblad i små fraktioner (1 – 2 cm3) och inkubera dem i 50 mL OR2 medium utan CaCl2 (OR2-noCaCl2) som innehåller 0,2% kollagenas (typ I) vid 17 – 19 ° C i en 100 mL-spinnare kolv med en långsam agitation för 4 – 5 h. Kontrollera att magnetiska baren är placerad cirka 3 – 5 cm ovanför botten av spinner kolven att undvika krossning oocyterna.</li>
		<li>Efter 4 – 5 h, verifierar att de flesta av oocyterna är befriad från sin follikeln (dvs, de simmar runt individuellt). Tvätta dem 5 x med 200 mL OR2 kompletteras med 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Överföra den defolliculated oocyter till Petri-rätter (10 cm) fylld med Barth lösning och antibiotika/antimykotika och hålla dem minst över natten vid 17 ° C före cDNA eller mRNA injektion.</li>
		<li>På den nästa dagen, Välj, under en kikare, en hälsosam äggcellen presentera en tydlig och distinkt djur kontra polack vegetal (mörkbrun för djur pole kontra ljusgul för vegetal stången). Använd rena Pasteur-pipetter och släng oocyterna en efter en i en steril koniska 96-injektion väl platta. Obs: Ingen speciell vård behövs i placeringen av oocyterna för mRNA injektioner; för cDNA injektionerna är det oumbärligt att orientera oocyterna med djur stången uppåt.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA eller cDNA automatisk injektion
	<ol>
<li>Syntetisera de mRNA som använder en kommersiellt tillgänglig kit efter tillverkarens anvisningar. Rengör instrument och tabellen med RNase och bära lämpliga skyddande handskar. Obs: Kvaliteten på mRNA är avgörande att ge ett bra uttryck, och det är nödvändigt att förhindra mRNA nedbrytning under förfarandet för injektion.</li>
		<li>Förbereda cDNAs använder en kommersiellt tillgänglig kit och lös upp önskad mängd i bidistilled vatten vid en koncentration av 0.2 µg/µL.</li>
		<li>Injicera 10 – 50 nL mRNA lösning vid en koncentration av 0.2 µg/µL eller 10 nL cDNA lösning vid en koncentration som sträcker sig från 0,02 – 0,2 µg/µL, helst i partier av 95 oocyter.</li>
		<li>För membranet proteiner som kräver flera subenheter (dvs., heteromeric α1β2γ2 GABAA -receptorer), blanda den motsvarande mRNA eller cDNAs i önskad förhållandet (dvs.1:1:1 eller 1:10:1).</li>
		<li>Hålla äggcellen vid 17 ° C att förhindra uttrycket av värma chockar proteiner av oocyterna; lagra mikroplattan i en thermo-kontrollerade området.</li>
		<li>Lös de test föreningar som testades positivt i den bindande OR2-analysen på 0,1-1000 µM för elektrofysiologiska inspelningar och avyttra dem. i en 96 brunnar flat bottenplatta av polypropen.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmider för uttryck
	<ol>
<li>Följ bruksanvisningarna av kommersiellt tillgängliga kit för mRNA syntes med bakteriell T7 eller T6 promotorer och gör 20 µL av en lösning på 0,2 µg/µL i RNase-gratis vatten.</li>
		<li>Bered minst 20 µL av en lösning innehållande en Eukaryoter uttryck vektor av cDNA uttryck, vanligtvis på 0.2 µg/µL upplöst i bidistilled vatten.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroskop i äggcellen och visualisering av dess kvalitet
	<ol>
<li>Injicera 10 – 50 nL av lösningen innehållande plasmid (se steg 2.3.1 eller 2.3.2) med en glas mikro-injektionsnål med en spets diameter sträcker sig upp till 100 µm monterad på en micromanipulator utrustad med ett system för utmatning av tryck eller med en automatiserad insprutningssystem. Obs: I exempel diskuteras här injiceras oocyter partier på 95 med ett automatiserat system som är lämplig för användning med cDNA eller mRNA.</li>
		<li>Fyll injektionsnålen med 1 µL av ett färgämne såsom metylenblått på 1% och injicera oocyterna använda standardförfarandet (antingen i kärnan för cDNA eller i cytoplasman för mRNA).</li>
		<li>Släng de injicerade oocyterna i ca 1 min i kokande vatten. Halvera oocyterna med ett rakblad under en kikare. Obs: Färgen förblir lokaliserade som visas i figur 3E, möjliggör en noggrann observation av injektionen.</li>
	</ol></li>
	<li>Två-elektrod spänningen klämman recordings
	<ol>
<li>Placera väl plattan som innehåller oocyterna den automatiserat system, som använder principen illustreras i figur 4. Obs: I motsats till patch clamp systemet illustreras i figur 5, sanna membranet potential av cellen läses av spänning elektroden.</li>
		<li>Programmera automatisk inspelning systemet med ikon-baserade gränssnittet med, exempelvis systemet illustreras i diagram 6 för bestämning av koncentration aktivitet förhållandet.</li>
	</ol></li>
	<li>Kurva montering
	<ol>
<li>Analysera resultaten med lämplig programvara, använda kurvan illustrerade koncentration aktivering, rita aktuella amplituden som en funktion av logaritmen av agonist koncentrationen.</li>
		<li>Iaktta den sigmoidal kurva som därefter kan utrustas med empiriska Hill ekvationen i formuläret: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Här Y= fraktionen av evoked ström, EG 50 = koncentrationen för en 50%-aktivering, x = koncentration av substansen, nH = den Hill koefficient eller uppenbara kooperativitet.</li>
		<li>Normalisera strömmarna till en enhet genom att dividera amplituden av varje svar jämfört med värdet som registrerades på den högsta koncentrationen att analysera data från en serie celler.</li>
		<li>Fastställa den genomsnittliga och standardfel och inser den kurva montering använder standardmässigt tillgänglig programvara.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elektrofysiologiska inspelningar i hjärnan skivor
Obs: Hippocampus råtta skivor är beredda enligt nationella och institutionella riktlinjer.
<ol><li>
Beredning av hippocampus skivor
	<ol>
<li>Förbereda den dissektion konstgjorda cerebrospinalvätska (dACSF) med 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukos och 4 mM saccharose gasade i flaskan med en blandning av 95% O2 och 5% CO2.</li>
		<li>Förbereda den inspelning konstgjorda cerebrospinalvätska (rACSF) med 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3och 10 mM glukos gasade i flaskan med en blandning av 95% O2 och 5% CO2.</li>
		<li>Söva råttorna med en blandning av 2,5% isofluran och rent syre och halshugga dem.</li>
		<li>Skär i hårbotten efter mittlinjen med en bra sax. Skär skallen längs mittlinjen utan att skada underliggande vävnad. Ta bort skallen med pincett och Använd en bra spatel för att ösa ut hjärnan.</li>
		<li>Placera hjärnan i gasade dACSF lösningen vid RT och dissekera vänster Hippocampus bildandet med fina spatel.</li>
		<li>Skär tvärgående skivor (400 µm tjock) från medelstora delen av hippocampus med en vävnad chopper och överföra dem till inspelning kammaren med användning av en målning borste. Upprätthålla skivor på RT för 45 min.</li>
		<li>BEGJUTA skivor med de gasade rACSF vid 35 ° C och med en hastighet av 1,5 mL/min. bubbla lösningen med en blandning av 95% O2 och 5% CO2. Obs: Efter detta steg, skivor är redo för elektrofysiologiska experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enda befolkningen spike inspelning
	<ol>
<li>Placera en hjärna skiva in i mikroskopet monterade kammaren.</li>
		<li>BEGJUTA segmentet med en hastighet av 3 mL/min med rACSF.</li>
		<li>Dra en borosilikatglas mikropipett med en pipett avdragare med ett motstånd på ~ 2 MΩ. Obs: Denna mikropipett används som en inspelning elektrod och är elektriskt ansluten till förstärkaren.</li>
		<li>Fyll mikropipett med en lösning innehållande 2 M NaCl och placera den i pipett hållaren av förstärkaren.</li>
		<li>Placera den inspelning mikropipett i de stratum pyramidale i regionen CA1 i hippocampus segmentet med hjälp av rätt micromanipulator. Obs: Platsen representeras schematiskt i figur 7.</li>
		<li>Placera en isolerade bipolära platinum/iridium elektrod i hållaren på den vänstra micromanipulator. Obs: Denna elektrod används som stimulering elektroden och är elektriskt ansluten till stimulans generator.</li>
		<li>Ställning stimulering elektroden i de Schaffer säkerheter i regionen CA1 Hippocampus segmentet med hjälp av rätt micromanipulator. Obs: Platsen representeras schematiskt i figur 7.</li>
		<li>Leverera en puls till stimulering elektroden med hjälp av stimulans generator varje 30 s (100 µs varaktigheter, börjar vid 10 μA) och gradvis öka stimulering styrka tills en befolkning spike (PS) visas.</li>
		<li>Justera styrkan stimulans för att framkalla en PS motsvarar 45% av den maximal amplitud som kan erhållas. PSs filtreras på 2,4 KHz och digitaliseras vid 20 KHz med signalförstärkare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Parat-pulse hämning
	<ol>
<li>Förbereda hjärnan skivor (steg 3.1) och fortsätt enligt beskrivningen tidigare (här 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Leverera två strömpulser (100 µs varaktigheter 20 ms intervall) till stimulering elektroden varje 30 s med hjälp av stimulans generator. Ange stimulans styrkan att framkalla en PS motsvarar 45% av den maximal amplituden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammansatta testning
	<ol>
<li>Göra spädningar av föreningarna som ska testas i gasade ACSF så att den slutliga koncentrationen av DMSO inte högre än 0,1%.</li>
		<li>Lägga till DMSO kontrollösningen vid samma koncentration än i sammansatta lösningen.</li>
		<li>Spela in en singel (steg 3,2) eller en parad-pulse (steg 3.3) PS frammanade av Schaffer säkerheter stimuli varje 30 s för minst 30 min. PS formen bör vara stabil under denna baseline-period.</li>
		<li>Förbereda en bägare med gasade rACSF som innehåller en fast koncentration av substansen testas.</li>
		<li>BEGJUTA på Hippocampus segmentet med denna lösning medan du spelar fortfarande in enstaka eller Parade-pulse PS.</li>
		<li>Utvärdera återhämtningen från den sammansatta effekten av startas på segmentet med gasade rACSF utan föreningen. Obs: För reversibla effekter, PS återgår till sin ursprungliga form som observerats under baslinjen innan förening.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analys av data
	<ol>
<li>Genomsnittliga PS spår inspelade under experimentet i block av 4 med hjälp av programvara för analys av data.</li>
		<li>Mäta de PS amplituderna för i genomsnitt spår.</li>
		<li>Normalisera amplituderna som en procentandel av baslinjen värdena registreras 10 min innan startas en förening.</li>
		<li>Uttrycka data som menar ± SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

Författarna Frédéric Knoflach och Maria-Clemencia Hernandez är anställda av F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, Schweiz, ett läkemedelsföretag. Författaren Daniel Bertrand är anställd av HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genève, Schweiz, som tillhandahåller screening faciliteter till läkemedelsföretag.

Utvecklingen av nya föreningar aktiva på en ligandreglerade jonkanal såsom GABAA receptorerna kräver användning av flera metoder. Vanligtvis utförs det första steget ofta med bindande analyser; sådana mätningar är dock otillräckliga för att karakterisera den fysiologiska aktiviteten av föreningen eller dess exakta farmakologi. I synnerhet en förening som binder till en receptor kan förbättra eller hämma dess funktion eller ens ge ingen funktionell effekt (tiga) (dvsbinda till receptorn utan att ändra dess funktion). Således krävs ett funktionellt test för en fullständig förening karakterisering.
Bindande analyser: Den största fördelen med bindande analysen är att det kan genomföras effektivt på ett stort antal prover som sträcker sig upp till flera tusen och att det ger bindande tillhörigheter för de aktiva molekylerna. Som beskrivs häri, består det första steget av att fastställa en metod för bedömning av önskad receptor undertyper. Nämligen, medan bindning kan utföras på infödda receptorer från bråk eller hela hjärnor, sådan metod kommer att hindra fastställandet av tillhörighet på specifik receptor undertyper. Det är därför nödvändigt att använda rekombinant system till skärmen molekyler på det önskade målet. Nuförtiden, erbjuder en övergående eller stabil transfection av den önskade receptor subenhet cDNAs i cellinjer en effektiv och tillförlitlig metod för att uttrycka de receptor undertyperna av intresse (t.ex., GABAA α5β3γ2). Traditionella bindande analyser göra använda av radioligands, men nuförtiden tekniker är tillgängliga att undvika olägenhet för hantering av radioaktivitet (t.ex., kvantitativa fluorescens-baserade ligand-bindning).
Funktionella uttryck i ett värdsystem: För att uttrycka gener i ett värdsystem, måste kodande sekvens av intresse införas i en plasmid som innehåller de adekvat promotorer. För in vitro- mRNA-syntesen används vanligtvis, de bakteriella T7 eller T6 promotorer. För ett cDNA uttryck måste transkriptionen av genen av intresse regleras av en Eukaryoter promotor såsom CMV (cytomegalovirus) eller motsvarande. Numera är flera plasmider, inklusive de två promotorer (dvs, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), tillgänglig så att antingen en in vitro- syntes av mRNA eller ett cDNA-uttryck som visas i figur 15. Ett uttryck för GABAA receptorerna kan erhållas troget i cellinjer eller i Xenopus oocyter. De främsta fördelarna med det senare är avsaknaden av endogena receptoruttryck, enkelheten i manipulationer och tillgängligheten av ett automatiserat system för mikro-injektioner och inspelningar. Procedurerna som beskrivs i detta protokoll illustrera effektiviteten i den automatiserade system som tillåter injektion av 96 oocyter i ca 7 min och kräver ingen mikromanipulation färdigheter. Att komma ihåg att en enda äggstock från en Xenopus innehåller mellan 10 000 – 30 000 oocyter, är det uppenbart att ett stort antal cell mätningar kan utföras på ett enda preparat. Dessutom som ett uttryck kan utföras med cDNA injektioner, kan de samma plasmider som innehåller generna av intresse som är utvecklade för de bindande experiment användas för en funktionell karakterisering utan behov av ytterligare molekylärbiologi manipulationer.
En enda äggcell med tanke på dess storlek och hög yta uttryck, och ger ett antal receptorer som motsvarar ungefär konfluenta cellerna i en 35 mm petriskål. Dock representerar en oocyter beredning och injektion en bråkdel av kostnaden för en cell fodrar, som experiment inte kräver en särskild odlingssubstrat och sterila manipulationer. Aktivering av en enda GABAA -kanal ger några picoamperes (10-12) och strömmar som sträcker sig upp till tiotals microampere (10-6) registreras enkelt i en enda äggcell, som bekräftar samtidig aktiviteten av flera miljoner receptorer under ett enda svar.
Ett första steg i karakterisering av ligandreglerade jonkanaler är ofta bestämning av uppenbara affinitet receptorer. De experiment som behöver genomföras består av tillämpa en rad korta agonist test pulser och plottning amplituden av den evoked nuvarande eller, i vissa fall arean under kurvan (AUC) som en funktion av logaritmen av agonist koncentrationen. Som det är lätt genomförbart att microinject olika plasmid koncentrationer och baserat i samma parti av oocyter, är detta system av uttryck särskilt lämpliga för sådan en karakterisering. Dessutom visade en sats till sats jämförelsen en hög grad av stabilitet för olika EC50s. Påverkan av subenhet sammansättningen på den receptorn uppenbar affinitet är lätt visualiseras med en spindel tomt, som exemplifieras i figur 10.
Resultaten av två-elektrod spänningen klämman erhållits i Xenopus oocyter jämförs ofta med inspelningar gjorda med patch clamp elektroder. Medan det skulle gå utanför ramen för detta arbete att gå in i en detaljerad jämförelse mellan dessa två system, kan ett par punkter undersökas. Medan en patch clamp i celler erbjuder fördelar för en biofysiska karakterisering med en snabb drog programmet, är dess krav mer komplexa än de av den två-elektrod inspelningar i Xenopus oocyter. En första och icke försumbar svårighet är ett uttryck för ett visst protein med nödvändigheten av en cellkultur, en övergående eller stabil transfection och identifiering av de celler som uttrycker den önskvärda bygga. Det är dessutom nödvändigt att undersöka det möjliga bidraget av endogena uttrycket i betraktas cellen. Dessutom kräver en patch clamp inspelning en kunnig person att genomföra mikromanipulation i hög förstoring Mikroskop, medan personen behöver också utföra en adekvat analys under experimentet att bedöma, exempelvis kvaliteten av tätningen, tillgång motstånd etc. i kontrast, en två-elektrod spänning klämma inspelning, speciellt en med hjälp av ett automatiserat elektrofysiologiska system, kräver inte någon särskild kompetens och kan bedrivas av laboratorietekniker.
När förvärva en Elektrofysiologisk set-up, är kostnad faktor säkerligen en viktig faktor som behöver analyseras noggrant. Till exempel, medan kostnaden för ett automatiserat system är relativt hög, visar en närmare jämförelse att installation av en komplett elektrofysiologiska rigg ingår att köpa utrustning såsom bra micromanipulators, en binocular lins, en förstärkare, en perfusion systemet, och en vibrationsdämpande tabell, samtidigt förvärva data och utföra en analys. En kostnadsjämförelse mellan en två-elektrod spänningen klämman set-up kontra en patch clamp set-up avslöjar ytterligare avvikelser. Dessutom det automatiska systemet erbjuder fördelen av fullt automatiserad utrustning och körs obevakad dag och natt.
De farmakologiska egenskaperna hos en förening bestäms av dess verkningssätt på receptorn. Till exempel är konkurrenskraftiga hämmare molekyler som kan ange samma bindande ficka eller orthosteric plats, eftersom agonist själv orsakar en tävling. Icke-kompetitiva hämmare är föreningar som hämmar receptorer genom att interagera på en annan plats och i fråga om en ligandreglerade jonkanal, som kan ange och blockera Joniska pore, till exempel. Det skulle gå utanför ramen för detta arbete att undersöka olika mekanismer för interaktion, men ytterligare information kan erhållas från en farmakologisk lärobok eller från annat arbete såsom Bertrand och Bertrands22.
När det gäller Allosteriska modulatorer ändrar de sammansatta binder på en plats som är skild från webbplatsen för orthosteric, men förekomsten av molekylen energibarriären mellan de aktiva och andra staterna. Positiv Allosteriska modulatorer (PAMs) är föreningar som minskar energibarriären från vila till det aktiva tillståndet och, därför, förstärka effekten av agonist. För att karaktärisera möjligt PAM, är det därför nödvändigt att fastställa om en exponering mot föreningen förbättrar att bemöta agonist och, i så fall vid vilken koncentration. De experiment som presenteras i figur 11 och figur 14 illustrera protokoll som kan användas framgångsrikt för karakterisering av PAMs på GABAA receptorerna.
I vissa fall kan exponering för PAM ensam räcka att aktivera receptorerna. Sådan verksamhet kan bestämmas genom en smärre ändring av protokollet experimentella presenteras här. Nämligen, i stället för en samtidig tillämpning av modulatorn under exponering för GABA, protokollet kan ändras för tillämpningen av första förening ensam och sedan i närvaro av GABA. En karakterisering av den direkta agonistaktivitet kommer att göras av bestämning av amplituden av svaret frammanade av föreningen själv och jämfört den GABA-framkallat nuvarande.
Experiment som utförs i hjärnan skivor, som illustreras i figur 7, används för att bekräfta aktiviteten sammansatta på infödda receptorer i en bestämd hämmande krets innan du går vidare i djurmodeller och längs vägen mot kliniska studier. Relativt enkla data inspelning och analys protokollet tillåter rangordningen av flera föreningar genom att utvärdera deras differentiell immunmodulerande effekt på PS amplitud. Icke-specifika effekter av föreningar som inte är relaterade till GABA-systemet kan också vara upptäckta (t.ex., när förändringar i formen PS observeras). Direkt, GABAergic neurotransmission kan bedömas i dessa fall genom att mäta effekterna av föreningarna på hämmande postsynaptiska strömmar (IPSCs) använder den hela-cell patch clamp teknik8.

Här presenterar vi protokoll för upptäckten av föreningar som är aktiva på GABAA -receptorer, från bindningen till fysiologi och farmakologi. I sökandet efter nya molekyler specifika för GABAA -receptorer, är det avgörande att definiera, så exakt som möjligt, subtyp av intresse och bedömningen av den särskilda karaktären hos de nyligen identifierade föreningarna (t.ex., för en genomgång, se Rudolph och Knoflach1eller Sieghart2). En typisk sökväg i läkemedelsutveckling och de steg som behöver uppnås illustreras i figur 1.
Bindande analyser har varit och är fortfarande till stor del används som ett första steg i läkemedelsutveckling. När det gäller GABAA -receptorer, är de optimerade för att identifiera substanser som binder till bindningsstället bensodiazepin av receptorn där terapeutiskt användbar och säkra läkemedel binder. Andra tekniker, använda fluorometric imaging plate reader (FLIPR) membran potentiella röda färgämnet-baserade analyser3, identifiera föreningar som barbiturater som binder till ytterligare platser som är mindre önskvärt på grund av deras oönskade bieffekt profil. De utnyttja färgämnena kan dessutom direkt aktivera GABAA -receptorer, således ifrågasätta nyttan av dessa analyser för drug discovery4. Bindande analyser kan endast ge bevis för att en viss förening kan binda till en specifik receptor klass. In vitro- analyser med cellmembran används för att identifiera selektiv mänsklig GABAA α5β3γ2-receptorligander. Övergående transfekterade HEK293 celler som uttrycker de mänskliga GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 och α3β3γ2 receptorer används för att förbereda membran för dessa analyser. Effekten av liganderna identifieras genom att mäta scintillation av [3H] flumazenil bunden till membranreceptorer (en hämning av [3H] flumazenil bindande). Den största fördelen med denna teknik är att en snabb och effektiv bestämning av det förening-affinitet på receptorn av intresse tillhandahålls på receptorn av intresse.
Funktionella studier är viktigt att utvärdera den funktionella aktiviteten av föreningar och föreslå en fysiologiska och farmakologiska förklaring av de mekanismer som orsakas av bindningen av föreningarna till receptorerna. Idag är det välkänt att funktionell GABAA -receptorer leder från montering av fem subenheter runt en axel av pseudosymmetry bildas av Joniska pore och resultatet från montering av fem identiska subenheter. De flesta av GABAA receptorerna består av två eller flera olika subenheter. Den stora hjärnan GABAA -receptorn, exempelvis består av α1, β2 och γ2 subunitsna i en stökiometri av 2, 2 och 1 respektive5,6. En beredning i ett värdsystem som Xenopus oocyter eller HEK293 celler erbjuder möjligheten att snabbt utforska de farmakologiska egenskaperna hos receptorerna.
De farmakologiska egenskaperna hos föreningarna utforskas sedan med extracellulära inspelningar i hjärnan skivor7. Denna metod tillåter en utforskning av effekten av föreningar på neurotransmission och ger ett effektivt sätt att bekräfta de funktionella effekterna av de föreningar som bestäms i heterologa uttryck system på nivå av infödda receptorer i totalt neuronala miljö. GABAergic neurotransmission kan också bedömas på molekylär nivå genom att mäta effekterna av föreningarna på hämmande postsynaptiska strömmar (IPSCs)8. Men protokollet används här och baserat på hela-cell patch clamp inspelningar i hjärnan skivor är mer genomarbetade och ger en lägre genomströmning.
Slutligen diskuteras styrkor och svagheter i vitro screening cascade används för identifiering av α5β3γ2-selektiv ligander i perspektivet av de olika teknikerna och deras inneboende begränsningar. Detta arbete bör ge och icke-experter på fältet av GABAA -receptorer som en trevlig recension av kombinationen av olika in vitro- metoder används för att ta itu med upptäckten av nya modulatorer av dessa ligandreglerade jonkanaler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Detta manuskript presenterar ett stegvisa protokoll för screening föreningar på gamma-aminobutyric syra typ en (GABAA) receptorer och dess användning mot identifiering av nya molekyler verksamma i prekliniska analyser från en in vitro- rekombinant Remote-receptorn till deras farmakologiska effekter på infödda receptorer i gnagare hjärnan skivor. För föreningar bindande på webbplatsens bensodiazepin i receptorn, är det första steget att inrätta en primär skärm som består av framkallning radioligand bindande analyser på cellmembran som uttrycker de stora GABAA -undertyperna. Sedan, dra nytta av ett heterologt uttryck för gnagare och mänskliga GABAA -receptorer i Xenopus oocyter eller HEK 293 celler, är det möjligt att utforska, elektrofysiologiska analyser, fysiologiska egenskaper av olika receptorn subtyper och de farmakologiska egenskaperna hos de identifiera föreningarna. I Xenopus äggcellen systemet kommer att presenteras här, börjar med isolering av oocyterna och deras Mikroskop med olika mRNA, upp till farmakologiska karakterisering med två-elektrod spänning klämmor. Slutligen, inspelningar genomfördes i gnagare hjärnan skivor kommer att beskrivas som används som ett sekundärt fysiologiska test för att bedöma aktiviteten av molekyler på deras infödda receptorer i en väldefinierad neuronala krets. Extracellulära inspelningar med befolkningen Svaren av flera nervceller demonstreras tillsammans med ansökan om drogen.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Metoder för upptäckten av nya föreningar modulera en Gamma - aminosmörsyra Receptor typ en Neurotransmission

Här presenterar vi protokoll för att upptäcka föreningar aktiva på GABAA -receptorer, från bindningen till fysiologi och farmakologi.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Nya Apparat och metod för narkotikakontroll Förstärkning

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Tillämpning av en NMDA-receptorn Konduktans av dopaminerg Rat mitthjärnan Nervceller med det dynamiska Clamp Teknik

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Kopplade Nanoinjection och elektrofysiologi analys för att undersöka Bioaktivitet hos föreningar med hjälp av Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Metoder för intravenös självadministrering i en musmodell

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Högupplösta functional magnetic resonance imaging metoder för Human mitthjärnan

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder för att studera verkningsmekanismerna för antipsykotiska läkemedel i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Optisk kontroll av en Neuronal Protein Med hjälp av en genetiskt kodad Unnatural Amino Acid i neuroner

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Om inrättande av en musmodell av en ren liten Fiber neuropati med den Ultrapotent Agonist av Transient Receptor Potential Vanilloid typ 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Romanen passiv Clearing metoder för snabb produktion av optisk transparens i hela CNS-vävnaden

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...