Name: preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00
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インディアナ大学質量分光施設とこのプロトコルの最適化の支援のためのユタ大学のメタボロミクス中核施設のメンバーに感謝します。J.M.T. は、によって、国立医学研究所の一般的な受賞番号 R35GM119557 の下で健康の国民の協会のサポートします。

1. 卵のコレクション
<ol><li>成人男性と目的遺伝子の処女の女性を収集します。3-5 日間の年齢標準ブルーミントン メディアで食品瓶でこれらの動物を個別に。</li>
	<li>新しい食品バイアルに 50 の処女の女性と男性 25 名を転送することによって適切な交配を設定します。 注: 独立したわれわれの六つの最小値は、各遺伝子型を設定する必要があります。1 つだけのサンプルは、各交配 (すな?...

<ol>
	<li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila:+implications+for+aging+and+metabolic+diseases.">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).</li><li>Sieber, M. H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metabolic+states+in+development+and+disease.">The role of metabolic states in development and disease.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 45, 58-68 (2017).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larvae+synthesize+the+putative+oncometabolite+L-2-hydroxyglutarate+during+normal+developmental+growth.">Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).</li><li>Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Estrogen-Related+Receptor+Directs+a+Metabolic+Switch+that+Supports+Developmental+Growth.">The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth.</a> Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).</li><li>Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabonomics':+understanding+the+metabolic+responses+of+living+systems+to+pathophysiological+stimuli+via+multivariate+statistical+analysis+of+biological+NMR+spectroscopic+data.">Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.</a> Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).</li><li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+-+the+link+between+genotypes+and+phenotypes.">Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes.</a> Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).</li><li>Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+Studies+in+Drosophila.">Metabolomic Studies in Drosophila.</a> Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).</li><li>Lenz, E. M., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+strategies+in+metabonomics.">Analytical strategies in metabonomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).</li><li>Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatography/mass+spectrometry+in+metabolic+profiling+of+biological+fluids.">Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).</li><li>Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+exogenous+to+endogenous:+The+inevitable+imprint+of+mass+spectrometry+in+metabolomics.">From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).</li><li>Garcia, A., Barbas, C., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. , 191-204 (2011).</li><li>Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+urinary+metabolic+profiling+procedures+using+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , 171-178 (1989).</li><li>Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glue+secretion+in+the+Drosophila+salivary+gland:+a+model+for+steroid-regulated+exocytosis.">Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis.</a> Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).</li><li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetAlign:+Interface-driven,+versatile+metabolomics+tool+for+hyphenated+full-scan+mass+spectrometry+data+preprocessing.">MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing.</a> Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful.">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li><li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+(pre-)processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign.">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+inference+of+biological+patterns,+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst.">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li><li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development.">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li></ol>

メタボロミクスは、中間代謝を構成する代謝反応を調査するための比類のない機会を提供します。この技術の感度は、ただし、遺伝的背景、発達の指示、およびさまざまな環境ストレス、温度、湿度、人口密度、栄養アベイラビリティなどに影響を受けやすいデータを渡します。そのため、高品質で再現可能なメタボロミクス解析高度に制御条件下でサンプルを収集することが必要です。い?...

ミバエショウジョウバエは中間代謝を調節する分子機構を研究するための理想的なシステムとして浮上しています。ショウジョウバエやヒトの間保存ほとんどの代謝経路しかキー栄養センサーと成長レギュレータ、インスリン、Tor は、myc などが飛ぶ1,2で活躍も。その結果、糖尿病や肥満神経変性疾患やがんに至るまでの人間の病気の新陳代謝の基礎を探検するショウジョウバエを使用できます。この点で、ショウジョウバエ幼虫の発育は、好気性解糖作用または Warburg 効果として知られている代謝のプログラムを研究するための最適なフレームワークを提供します。同様に多くの腫瘍は、炭水化物からのバイオマスを生成する好気性解糖系を使用、だからショウジョウバエ幼虫をアクティブにして発達成長3,4,5を促進する好気性解糖系。幼虫の間これらの類似性と腫瘍代謝の理解方法有酸素の主要モデルとしてのショウジョウバエを確立規制生体内では、解糖系。
ハエが代謝を研究するための人気のあるモデルとして浮上しているにもかかわらず、ショウジョウバエ研究のほとんどは、個々 の代謝物3トレハロース、トリグリセリド、ATP などを測定するために設計されている方法に依存します。特定のプロトコルはそれぞれの代謝産物を測定する必要があるので試金ベースの研究、労働集約的な高価であり商業キットを使用して測定することができますこれらの化合物に向かってバイアスをかけた。これらの制限事項の解決策は、ショウジョウバエ代謝を勉強してより効率的かつ公平な手段を提供するメタボロミクスのフィールドから浮上しています。試金ベースの研究とは異なり単一のメタボローム解析は同時に数百の低分子代謝物を測定し、生物の代謝状態6、7の包括的な理解を提供できます。この手法は大幅ショウジョウバエ代謝の研究の範囲を拡大している、この新興分野8の未来を表します。
メタボローム研究は主に 3 つの技術を使用して実施した: (i) 核磁気共鳴 (NMR)、(ii) 液体クロマトグラフィー-質量分析 (LCMS)、および (iii) ガスクロマトグラフィー-質量分析法 (GC/MS)9。それぞれのアプローチ、明確な長所と短所、およびこれらの技術のすべては正常にショウジョウバエ代謝を研究に使用されています。以来、当研究室の研究は小さい、円形状の代謝に焦点を当てて、私たちは主に GC ・ MS ・ ベースの手法を採用しています。GC-MS 数再現性が高く、ピークの解像度、感度などの利点を持つユーザーを提供していますの迅速な同定では、標準的な電子衝撃 (EI) スペクトル ライブラリの可用性発見代謝機能10,11。GC-MS のサンプルの準備は多少複雑し、細部にまで細心の注意が必要です。収集、洗浄、および重量を量った、代謝反応を迅速に消光方法で凍結する必要がありますサンプル。さらに、ハエの死骸は標準的な均質化のプロトコルに耐性があるように最適な代謝物抽出ビーズミルを必要とします。最後に、ガスクロマトグラフィー質量分析したサンプルは検出12前に化学的誘導体化を受ける必要があります。以前に発行されたメソッドは、すべてのこれらの手順3,13,14記述、再現性をもって高品質データを生成する初心者ユーザーことができますビジュアル プロトコルがまだ必要です。ここで GC MS メタボロミクス分析ショウジョウバエ幼虫サンプルを準備する方法を示します。このプロトコルでは、再現性をもって中央炭素代謝を構成する小さな極性代謝物の多くを測定することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unsulfured blackstrap molasses</td>
			<td style="width:141px;">Good Food, INC</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyridine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX2012-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>155405</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>69478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fleischmann&#8217;s Active dry yeast</td>
			<td>AB Mauri Food Inc</td>
			<td>2192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6oz Drosophila stock bottle</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&#160;</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>SKU:19-627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vial insert, 250 &#181;L deactivated glass with polymer feet</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Succinic acid-2,2,3,3-d4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>293075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpeedVac</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>SC210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">o-Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A242-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propionic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bead Ruptor</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>SKU:19-040E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GC column</td>
			<td>Phenomex</td>
			<td>ZB-5MSi</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

メタボローム解析の分野の最近の進歩は、動物の代謝を研究するための強力な遺伝モデルとしてミバエショウジョウバエを確立しています。中間代謝の大 swaths を調査する能力を持つショウジョウバエ遺伝学的ツールの広大な配列を用いてメタボロミクス アプローチは、食事療法、遺伝子型、生活史のイベント、および環境手がかりとの間の複雑な相互作用を明らかにできます。さらに、メタボロミクス研究は酵素機構を発見し、一見異なる代謝経路間の未知の接続を明らかにできます。ショウジョウバエのコミュニティの間でこの技術のより広範な使用を促進するためにここで提供・ ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC/MS) のショウジョウバエ幼虫サンプルを準備する方法について説明します詳細なプロトコル-メタボローム解析を用いた。我々 のプロトコルでは、幼虫の標本、代謝物抽出、化学誘導体化ガスクロマトグラフィー質量分析について説明します。このプロトコルを正常に完了は、解糖系と TCA サイクルに関与する有機酸、糖、アミノ酸を含む小型の極性代謝産物の相対量を測定できます。

乳酸脱水素酵素dLDH 活動4、および遺伝的にマッチさせた対照群がない突然変異体 (dLDH) L2 半ば幼虫採集し、上記のプロトコルに従って処理されます。コントロールと比較すると、変異体幼虫は乳酸、ピルビン酸、L 2-ヒドロキシグルタル酸4で大幅な変更を表わします。スペクトルは、Agilent GC6890 5973i MS システムに買収されまし...

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

このプロトコルでは、GC-MS ベースのメタボローム解析のショウジョウバエ幼虫を準備する方法について説明します。

ガスクロマトグラフィー-質量分析法 (GC/MS) のためのショウジョウバエ幼虫サンプル準備-メタボロミクスをベース

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Research

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

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Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

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中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

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Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

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Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Dissection of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brain for Live-Cell Imaging

Dissection of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brain for Live-Cell Imaging (Video) | JoVE 

ショウ ジョウバエメラノガスター 第3齢幼虫脳の解剖による生細胞イメージング