Name: preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics at JoVE.com

Graças aos membros do centro de espectroscopia de massa Indiana universidade e a Universidade de Utah Metabolomics facilidade do núcleo de assistência em otimizando este protocolo. JMT é suportado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R35GM119557.

1. ovo coleção
<ol><li>Colete os adultos machos e fêmeas virgens de genótipos desejados. Idade individualmente esses animais em um frasco de alimento com mídia de Bloomington padrão para 3-5 dias.</li>
	<li>Configurar os acasalamentos adequados ao transferir 50 fêmeas virgens e 25 machos para um novo frasco de comida. Nota: Um mínimo de seis acasalamentos independentes deve ser configurado para cada genótipo. Será coletada apenas uma amostra de cada acasalamento (ou seja, seis amostras colhidas seis acasal...

<ol>
	<li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila:+implications+for+aging+and+metabolic+diseases.">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).</li><li>Sieber, M. H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metabolic+states+in+development+and+disease.">The role of metabolic states in development and disease.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 45, 58-68 (2017).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larvae+synthesize+the+putative+oncometabolite+L-2-hydroxyglutarate+during+normal+developmental+growth.">Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).</li><li>Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Estrogen-Related+Receptor+Directs+a+Metabolic+Switch+that+Supports+Developmental+Growth.">The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth.</a> Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).</li><li>Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabonomics':+understanding+the+metabolic+responses+of+living+systems+to+pathophysiological+stimuli+via+multivariate+statistical+analysis+of+biological+NMR+spectroscopic+data.">Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.</a> Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).</li><li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+-+the+link+between+genotypes+and+phenotypes.">Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes.</a> Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).</li><li>Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+Studies+in+Drosophila.">Metabolomic Studies in Drosophila.</a> Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).</li><li>Lenz, E. M., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+strategies+in+metabonomics.">Analytical strategies in metabonomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).</li><li>Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatography/mass+spectrometry+in+metabolic+profiling+of+biological+fluids.">Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).</li><li>Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+exogenous+to+endogenous:+The+inevitable+imprint+of+mass+spectrometry+in+metabolomics.">From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).</li><li>Garcia, A., Barbas, C., Metz, T. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , 171-178 (1989).</li><li>Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glue+secretion+in+the+Drosophila+salivary+gland:+a+model+for+steroid-regulated+exocytosis.">Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis.</a> Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).</li><li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetAlign:+Interface-driven,+versatile+metabolomics+tool+for+hyphenated+full-scan+mass+spectrometry+data+preprocessing.">MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing.</a> Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful.">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li><li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+(pre-)processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign.">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+inference+of+biological+patterns,+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst.">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li><li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development.">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li></ol>

Metabolomics oferece uma oportunidade sem precedentes para analisar as reações metabólicas que compõem o metabolismo intermediário. A sensibilidade desta tecnologia, no entanto, processa dados suscetíveis a base genética, pistas do desenvolvimento e uma variedade de estresses ambientais, incluindo temperatura, umidade, densidade populacional e disponibilidade de nutrientes. Portanto, uma alta qualidade e reprodutíveis metabolomics análise exige que as amostras sejam cobrados em condições altamente controladas....

Mosca da fruta Drosophila melanogaster emergiu como um sistema ideal para estudar o mecanismo molecular que regulam o metabolismo intermediário. Não só são a maioria das vias metabólicas conservadas entre Drosophila e seres humanos, mas chaves sensores de nutrientes e reguladores de crescimento, tais como a insulina, Tor e myc, também são ativos na mosca1,2. Como resultado, a Drosophila pode ser usado para explorar a base metabólica de doenças humanas que variam de diabetes e obesidade a neurodegeneração e câncer. A este respeito, desenvolvimento larval de Drosophila fornece o quadro ideal para se estudar um programa metabólico conhecido como glicólise aeróbica, ou o efeito de Warburg. Assim como muitos tumores glicólise aeróbica para gerar biomassa de hidratos de carbono, então, para fazer a drosófila larvas ativam glicólise aeróbica para promover o crescimento do desenvolvimento3,4,5. Essas semelhanças entre larval e metabolismo de tumor estabelecer drosófila como um modelo de chave para compreensão como aeróbio glicólise é regulamentado na vivo.
Apesar do fato que a mosca tem emergido como um modelo popular para estudar o metabolismo, a maioria dos estudos de Drosophila dependem de métodos que são projetados para medir metabólitos individual3, tais como a trealose, triglicérides ou ATP. Como um protocolo específico é necessária para medir cada metabólito, estudos baseados no ensaio são tendenciosas para aqueles compostos que podem ser medidos usando jogos comerciais, caro e trabalhoso. Uma solução para estas limitações emergiu do campo da metabolómica, que fornece um meio mais eficiente e imparcial de estudar o metabolismo de Drosophila . Ao contrário de um estudo baseado em ensaio, uma análise única metabolómica simultaneamente pode medir centenas de metabólitos de pequenas moléculas e fornecem uma compreensão abrangente de estado metabólico6,7 de um organismo. Esta técnica expandiu-se significativamente o âmbito da drosófila estudos metabólicos e representa o futuro deste emergente campo8.
Metabolómica estudos são realizados principalmente utilizando três tecnologias: (i) ressonância magnética nuclear (NMR), (ii) líquida cromatografia / espectrometria de massa (LC-MS) e (iii) cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)9. Cada abordagem apresenta desvantagens e vantagens distintas, e todas essas tecnologias têm sido usadas para estudar com sucesso o metabolismo de Drosophila . Desde que a pesquisa conduzida em nosso laboratório está focada em metabolitos pequenos, polares, empregamos principalmente um método baseados em GC-MS. GC-MS fornece o usuário com um número de vantagens, incluindo a grande reprodutibilidade, pico resolução, sensibilidade, e a disponibilidade de uma espectral biblioteca de impacto (EI) de elétrons padrão, que permite a identificação rápida de descoberto metabólica características de10,11. A preparação de amostras para GC-MS, no entanto, é um pouco complexa e exige uma cuidadosa atenção aos detalhes. Amostras devem ser coletadas, lavadas, pesava e congeladas em uma maneira que sacia rapidamente reações metabólicas. Além disso, a carcaça da mosca é resistente para protocolos padrão de homogeneização e requer um moinho do grânulo para garantir a extração de metabólito ideal. Finalmente, amostras analisadas por GC-MS devem se submeter a derivatização química antes da deteção12. Enquanto os métodos publicados anteriormente descrevem todas estas etapas3,13,14, um protocolo visual que permita que o usuário iniciante reproducibly gerar dados de alta qualidade ainda é necessária. Aqui vamos demonstrar como preparar amostras de larvas de Drosophila para análise metabolomics baseados em GC-MS. Este protocolo permite que o usuário reproducibly medir muitos dos pequenos metabólitos polares que compõem o metabolismo de carbono central.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unsulfured blackstrap molasses</td>
			<td style="width:141px;">Good Food, INC</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyridine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX2012-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>155405</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>69478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fleischmann&#8217;s Active dry yeast</td>
			<td>AB Mauri Food Inc</td>
			<td>2192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6oz Drosophila stock bottle</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&#160;</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>SKU:19-627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vial insert, 250 &#181;L deactivated glass with polymer feet</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Succinic acid-2,2,3,3-d4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>293075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpeedVac</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>SC210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">o-Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A242-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propionic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bead Ruptor</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>SKU:19-040E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GC column</td>
			<td>Phenomex</td>
			<td>ZB-5MSi</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

Recentes avanços no campo da metabolómica estabeleceram a mosca de fruta Drosophila melanogaster como um poderoso modelo genético para estudar o metabolismo animal. Combinando a vasta gama de ferramentas genéticas drosófila com a capacidade de levantamento de grandes áreas de metabolismo intermediário, uma abordagem metabolomics pode revelar interações complexas entre dieta, genótipo, eventos de vida-história e Dicas ambientais. Além disso, estudos metabolomics podem descobrir novos mecanismos enzimáticos e descobrir conexões anteriormente desconhecidas entre vias metabólicas aparentemente díspares. Para facilitar o uso mais difundido dessa tecnologia entre a comunidade de Drosophila , aqui nós fornecemos um protocolo detalhado que descreve como preparar amostras de larvas de Drosophila para cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)- com base em análise da metabolómica. Nosso protocolo inclui descrições de coleta de amostra larval, extração do metabólito, derivatização química e análise por CG-em. Conclusão bem-sucedida do presente protocolo permitirá que os usuários medir a abundância relativa dos metabólitos polares pequenas, incluindo aminoácidos, açúcares e ácidos orgânicos envolvidos na glicólise e os ciclos TCA.

Lactato desidrogenase (dLDH) mutantes, desprovidas de atividade dLDH4e geneticamente-controles foram coletados como larvas de meados-L2 e processada de acordo com o protocolo descrito acima. Quando comparados com controles, larvas mutantes exibem alterações significativas no lactato, piruvato e L-2-Hidroxiglutarato4. Espectros foram adquiridos com um sistema de Agilent GC6890-5973i MS. Um exemplo dos espectros de GC-MS gerar com n...

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Este protocolo descreve como preparar larvas de Drosophila para análise da metabolómica baseados em GC-MS.

Preparação de amostras de larvas de Drosophila por cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)-com base em metabolómica

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

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