Name: analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

Vi takke medlemmerne af Ninov lab for kommentarer på manuskriptet, som medlemmer af Center for Regenerative behandlinger Dresden (CRTD) fisk og mikroskopi facilitet for teknisk bistand. NN er støttet af midler fra DFG-CRTD, Cluster of Excellence på TU-Dresden, tysk Research Foundation (DFG) og den tyske Center for Diabetes forskning (DZD).

Alle de procedurer, herunder animalske emner er blevet godkendt af den animalsk velfærd opføre og med tilladelse fra Landesdirektion Sachsen, Tyskland (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016).
1. forberedelse
Bemærk: Denne protokol er for ex vivo billeddannelse af zebrafisk primære islet fra dobbelt transgene Tg (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafisk. I denne transgene linje, insulin-promotoren (ins) drev beta-celle specifikt udtryk for to transgener: nls-Renilla-mKO2, som markerer kernen af beta-celler med monomere Kusabira orange 2 (mKO2) Fluorescens; og GCaMP6s15, som udsender grønne fluorescens i svar til stigning i intracellulære calcium niveauer. Beta-celle-specifikke udtryk af GCaMP6s gør det muligt at studere glukose-lydhørhed af beta-celler uden indblanding fra calcium ændringer i omgivende celletyper.
<ol><li>Forberede frisk fibrinogen stock (10 mg/mL) ved opløsning 10 mg af kvæg fibrinogen i 1 mL af Ca2 +/Mg2 +-indeholdende Hanks' afbalanceret saltopløsning (HBSS) i et 1,5 mL centrifugeglas. Vortex kraftigt indtil fibrinogen pulveret opløses fuldstændigt. Holde løsningen ved stuetemperatur i mindst 15 min. mere. Bemærk: Bestanden kan opbevares ved stuetemperatur til 2 – 3 h. kassere materiel, hvis løsningen begynder at polymerisere og bliver tyktflydende.</li>
	<li>Forberede fibrinogen brugsopløsning (3,3 mg/mL) ved fortynding af fibrinogen bestanden tre gange i HBSS. For eksempel, bland 300 µL af fibrinogen bestand i 600 µL af HBSS at forberede 900 µL af fibrinogen brugsopløsning.</li>
	<li>Forberede thrombin løsning (10 U/mL) ved opløsning 10 enheder af thrombin i 1 mL af HBSS eller phosphat bufferet saltvand (PBS). Bemærk: Denne løsning kan forberedes i forvejen aliquoted i 50 µL dele, og frosset ved-20 ° C.</li>
	<li>Forberede 200 mM D-glucose løsning ved at opløse 1,8 g af D-Glucose i 50 mL vand. Holde i 4 ° C til langtidsopbevaring.</li>
	<li>Forberede 300 mM KCl løsning ved at opløse 1,1 g af KCl i 50 mL vand. Holde i 4 ° C til langtidsopbevaring.</li>
	<li>Skaffe 35 mm diameter glas-bund retter til montering i Holme.</li>
	<li>Dissektion og montering af holmen, bruge et stereo-mikroskop udstyret med fluorescens lampe og rødt filter cube (TRITC: excitation: 532-554 nm, emission: 570-613 nm; eller Texas-rød: excitation: 540 – 580 nm, emission: 592-667 nm).</li>
	<li>For imaging calcium tilstrømning i beta-celler, brug en inverteret Konfokal mikroskop (Zeiss LSM 780 eller lignende) med 20 X (0,8 NA) luft mål og udstyret med en plade holder til 35 mm diameter glas-bund retter.</li>
	<li>Forberede en 200 mg/L opløsning af tricaine metan sulfonat (MS222) for euthanizing zebrafisk.</li>
	<li>Skaffe 90 mm petriskåle til zebrafisk dissektion.</li>
</ol>2. zebrafisk primære Islet dissektion og montering
<ol><li>Aflive en fisk ved hjælp af længere tids inkubation i MS222. For dette, forsigtigt fjerne fisk fra fisk tank ved hjælp af et fiskenet og inkuberes i en petriskål, som indeholder MS222 løsning, indtil dyret viser ingen opercular (gæller) bevægelse; typisk, denne tager 5 min. overførsel af fisk til en petriskål, som indeholder HBSS løsningen med Ca2 +/Mg2 +.</li>
	<li>
Under et stereo mikroskop udstyret med fluorescens lampe og rødt filter terning, dissekere den hud, der dækker i højre side af maven af dyret til at isolere bugspytkirtlen.
	<ol>
<li>For dette, skære huden af zebrafisk fra munden til gatfinnen bruger skarpe pincet. Skræl væk skåret huden til at udsætte maven; denne snipping udsætter de indre organer. Ved hjælp af den røde fluorescens af mKO2 udtryk i beta-celler, skal du fastslå placeringen af holmene ved visuel undersøgelse under mikroskop. Du kan eventuelt fjerne lapper i leveren, som de kunne dække Holmen, hvilket gør det vanskeligt at finde. Bemærk: Den primære Holmen ligger i nærheden af den forreste regionen af maven, typisk på højre side.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ren den primære islet ved omhyggeligt at fjerne omkringliggende væv såsom leveren og adipocytter. Tag forholdsregler for ikke at såre eller stikke Holmen; efter clearing af det omgivende væv, blive de enkelte celler på Holmen overfladen mærkbare.</li>
	<li>Med pipette udtages en 30 µL dråbe HBSS på midten af en glas-bund fad. Overføre dissekeret Holmen til dette fald.</li>
	<li>Forsigtigt vaske islet engang med HBSS og en gang med 30 µL af fibrinogen brugsopløsning (3,3 mg/mL). Sørg for at undgå udtørring af holmen under vask trin, fordi modsat fald resulterer i celledød.</li>
	<li>Langsomt og forsigtigt tilføje 10 µL af opløsningen thrombin (10 U/mL). Forlade Holmen og fadet urørt i 15-20 min. observere at fibrinogen-thrombin drop vil blive tyktflydende og lidt uigennemsigtig på dette punkt.</li>
</ol>3. Ex Vivo Live-imaging af GCaMP fluorescens intensitet i zebrafisk primære Holme
<ol><li>Tilføje 200 µL af HBSS på toppen af mold og placere skålen omhyggeligt på tallerken indehaveren af en Konfokal mikroskop. Bruge en 20 X, 0,8 NA, air mål for Konfokal billeddannelse. Find Holmen ved hjælp af indstillingen brightfield.</li>
	<li>Ved hjælp af filteret til røde fluorescens at se nukleare mKO2 fluorescens i beta-celler, fokusere på Holmen. Enkelte kerner skal være klart synlige.</li>
	<li>Find et klart tænkelig plan ved manuelt at ændre brændplanet af Konfokal mikroskop for at flytte gennem tykkelsen af holmen langs dens z-aksen. Sikre at billeddannelse flyet indeholder et tilstrækkeligt antal (50-100) af beta-celler for billedbehandling, og lysstyrken på den nukleare mKO2 Fluorescens er ensartet, især i midten af Holmen.</li>
	<li>Oprette en sekventiel anskaffelsessum for GCaMP6s og mKO2 fluorescens ved hjælp af følgende indstillinger i "Smart Setup-menuen": GCaMP6s, excitation: 488 nm, emission: 500 – 555 nm, falsk-farve: grøn (Vælg "normal god landbrugspraksis"); mKO2, excitation: 561 nm (mCherry), emission: 570-630 nm, falsk-farve: rød (Vælg "mCherry"). Bemærk: Denne indstilling, den røde kanal vil registrere placeringen af beta-celle kerner, mens den grønne kanal vil optage GCaMP fluorescens intensitet.</li>
	<li>I tilstanden"tilegnelse" indstille billedopløsningen på 1.024 x 1.024 pixel, hastighed på 10 og gennemsnit på 1. Indlede en kontinuerlig optagelse ved at vælge indstillingen "Tidsserie" og indstille "Varighed" til 500 cykler, med ca. 2 s erhvervelse tid pr. ramme. Bemærk: De første 50 billeder af tidsserien svarer til aktiviteten af beta-celler i 5 mM glukose koncentration. Dette er den oprindelige svar. En besvarende beta-celle vil vise voksning og aftagende i grøn fluorescens-intensiteten med tiden. Vi har observeret, at et par (1-5%) af beta-celler svinger på 5 mM glukose.</li>
	<li>
Holde øje med den billeddiagnostiske cyklus. Efter først øger 50 frames, glukose koncentration af de omkringliggende løsning til 10 mM uden at stoppe optagelsen.
	<ol>
<li>Uden forstyrrende billede erhvervelse, forsigtigt afpipetteres 5 µL af 200 mM D-glucose løsning på toppen af gelen holder Holmen. Erhverve 150 billeder på 10 mM glukose. Bemærk: Stigning i glukose koncentration vil øge antallet af beta-celler gennemgår GCaMP fluorescerende svingninger i den grønne kanal.</li>
		<li>Sikre, at kerner af celler forbliver stabil i løbet af processen. Hvis Holmen ryster udførligt under erhvervelse og kerner bevæger sig ud af brændplanet, kassere prøven (hvis nødvendigt).</li>
		<li>Vente en tilstrækkelig lang periode til at aktivere polymerisering af fibrinogen-thrombin mug for at sikre stabiliteten i efterfølgende prøver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>På 200 rammer, yderligere øge koncentrationen af løsning til 20 mM ved forsigtigt pipettering 10 µL af 200 mM D-glucose løsning. Erhverve 150 rammer for 20 mM koncentration.</li>
	<li>Efter 350 rammer, depolarisere Holmen ved hjælp af 30 mM af KCl. For dette, tilføje 20 µL af 300 mM KCl stamopløsning. På nuværende tidspunkt konstatere at GCaMP6s fluorescens svingninger vil stoppe og lave på en høj intensitet; beta-celler, der ikke har reageret på glucose kan vise en stigning i grøn-fluorescens intensitet på KCL tilsætning.</li>
</ol>4. kvantificering af GCaMP fluorescens spor for individuelle Beta-celler
Bemærk: For at spore og kvantificere svar af individuelle beta-celler til varierende niveauer af glukose, kvantificere GCaMP fluorescens intensitet for hele billeddannelse. Kvantificering foretages ved cellulære opløsning. Til dette, skal du bruge FIJI20 at udtrække intensitetsværdierne af GCaMP fluorescens fra billeder (trin 4.1-4.6), og regnearket software eller R21 at udføre analyse (trin 4.8-4.9).
<ol><li>Åbne billedfilen i FIJI ved hjælp af "LSM værktøjskasse". For dette, skal du vælge "Plugin | LSM værktøjskasse | Vis LSM værktøjskasse". Klik på "Åbn LSM" i "LSM værktøjskasse", og vælg billedfilen. Bemærk: For formater understøttes ikke af den "LSM værktøjskasse", konvertere dem først for at tiff til analyse.</li>
	<li>Uddrag svar af celler ved hjælp af værktøjet region af interesse (ROI) i FIJI. Åbn "ROI Manager" i menuen "Analyze" under "Funktioner". Manuelt tegne Investeringsafkast ved hjælp af "polygon markeringsværktøjet" beliggende i værktøjslinjen.</li>
	<li>Tegne Investeringsafkastet i den røde kanal hvor beta-cellekerner er synlige. Vælg ROI, således at det dækker et område, der er større end en cellekerne for at medtage nogle af cellens cytoplasma. Sikre, at positionen ROI er overensstemmelse mellem rammer og eventuelt justere positionen.</li>
	<li>Tilføj de valgte ROIs "ROI Manager" ved at klikke på knappen "Tilføj [t]". Vælg og tilføje flere ROIs til ROI for at opnå data på flere celler.</li>
	<li>Fra menuen "Analyze", vælg derefter "Sæt målinger". Vælg "Integreret tæthed" til at angive udvinding af samlede fluorescens intensitet inden for området.</li>
	<li>Skift til den grønne kanal indeholdende GCaMP fluorescens og vælg "Multi foranstaltning" i "ROI Manager". Bemærk: Dette vil give intensitet målinger for cellerne hele tiden-serien.</li>
	<li>I tilfælde af ROI-position skal justeres som følge af flytning af holmen, manuelt kompilere intensitet målinger i forskellige rammer. Kopiere og indsætte værdier til et separat regneark.</li>
	<li>Få tidsstempler billede billeder fra "LSM værktøjskasse". Brug "Anvend frimærker | Anvende t frimærker | Filnavn | Dumpe til tekstfil"for at få tidsstempler. Gemme tidsstempler ved hjælp af indstillingen "Gem som", eller kopiere dem ind i regnearket.</li>
	<li>Ved kompilering intensitetsværdierne for alle celler, udføre den analyse én celle ad gangen eller automatisk (f.eks.ved hjælp af Excel-formler eller R).</li>
	<li>
Analysere individuelle celler i to trin.
	<ol>
<li>I det første trin, beregne fluorescens-intensiteten over grundlinjen. Med henblik herpå, skal du beregne baseline fluorescerende intensitet (F0) som gennemsnittet af fluorescens intensiteter for de første 50 frames (5 mM glukose). Fratræk derefter baseline (F0) fra den hele tid-serien (F – F0). Bemærk: et par celler kan vise klare GCaMP svingninger under basal glukose, som typisk fortsætte efter stimulation med højere koncentrationer. For sådanne celler er det kun muligt at anslå F0 ved at tage den gennemsnitlige intensitet af de oprindelige rammer, hvor cellerne viste et fald i fluorescens.</li>
		<li>I det andet trin af analysen, få den endelige GCaMP fluorescens intensitet ved normalisering fluorescens-intensiteten. Bemærk: Dette er udført for at fjerne forskellene mellem holmene fra forskellige dyr. Enkelte Holme vise varierende niveauer af fluorescens emission ved glucose stimulation.</li>
		<li>Normalisere fluorescens-intensiteten ved at dividere det med den højeste værdi i intensitet. For dette, beregne den maksimale intensitet (Fmax -F0) og dividere baseline trækkes værdier af peak intensitet til at give de endelige GCaMP fluorescens intensitet (F – F0) / (Fmax -F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kassér de celler, der ikke udviser en ændring i intensitet efter KCl stimulation, som de kunne være usundt eller er beskadiget.</li>
	<li>For at udføre analyse (trin 4,9-4.10) i R, bruge scriptet Rasmussen (plotcelltrace. R) forsynet med dette håndskrift.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contributions+of+insulin+resistance+and+beta-cell+dysfunction+to+the+pathophysiology+of+Type+2+diabetes.">The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).</li><li>Ogurtsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+for+the+prevalence+of+diabetes+for+2015+and+2040.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040.</a> Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).</li><li>Pipeleers, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pancreatic+beta-cell+population.">Heterogeneity in pancreatic beta-cell population.</a> Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).</li><li>MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+mechanisms+in+pancreatic+beta-cells.">Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).</li><li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+induces+oscillatory+Ca2++signalling+and+insulin+release+in+human+pancreatic+beta+cells.">Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 37, S11-S20 (1994).</li><li>Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+oscillations+of+cytoplasmic+Ca2++and+insulin+release+in+glucose-stimulated+pancreatic+islets.">Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).</li><li>Wollheim, C. B., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cytosolic+free+Ca2++and+insulin+release+in+an+insulin-secreting+cell+line.">Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line.</a> J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).</li><li>Pace, C. S., Price, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+responses+of+pancreatic+islet+cells+to+secretory+stimuli.">Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli.</a> Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).</li><li>Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+of+single+insulin+secretory+granules+with+evanescent+wave+microscopy:+distinct+behavior+of+granule+motion+in+biphasic+insulin+release.">Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release.</a> J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).</li><li>Soria, B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+oscillations+and+insulin+release+in+pancreatic+islets+of+Langerhans.">Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).</li><li>Kenty, J. H. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+pancreatic+islet+function+at+the+single+cell+level+by+calcium+influx+with+associated+marker+expression.">Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression.</a> PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+developmental+histories+of+beta-cells+generate+functional+and+proliferative+heterogeneity+during+islet+growth.">Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth.</a> Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Friedman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+autoimmune+microenvironment+regulates+the+quality+of+effector+T+cell+restimulation+and+function.">An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function.</a> Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+&#946;-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature &#946;-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nat Commun. 7, 11756 (2016).</li><li>Johnston, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+Cell+Hubs+Dictate+Pancreatic+Islet+Responses+to+Glucose.">Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose.</a> Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Her viser vi en teknik til kvantificering af beta-celle glukose reaktionsevne på én celle opløsning. Dette er gjort muligt ved at overvåge intracellulære calcium koncentrationen ved hjælp af en genetisk kodet calcium indikator, GCaMP6s. Beta-cellernes aktivitet er fanget ex vivo ved at montere Holmen i en fibrinogen-thrombin skimmel. Et kritisk trin i protokollen er stabiliteten i formen. Tilstrækkelig tid skal gives til fibrinogen opløses i HBSS-løsningen. Uden dette, formen ikke polymerisere tilstrækkeligt for at give stabilitet under imaging-session. En Holm monteret i fibrinogen-thrombin mug og nedsænket i celle kultur medier kan forblive levedygtige i mindst en uge (data ikke vist). Alternativer til formen fibrinogen-thrombin, såsom lav-Smelt agarosegelelektroforese, kan udnyttes til at montere Holmen22. En anden afgørende parameter er dissektion af Holmen. Under dette trin skal i vævet omkring Holmen fjernes uden sårede eller stikke Holmen. En dygtig dissektion kommer med praksis.
En begrænsning af imaging-protokollen er begrænsning en Konfokal flyet af Holmen. Dette er gjort for at fange dynamikken i calcium tilstrømning inden for enkelte beta-celler. En Z-stak gennem hele tykkelsen af holmen fører til lav billedbehandling hastigheder og tab af oscillerende signal fra individuelle celler. Denne begrænsning kan forbedres ved hjælp af hurtigere middel til fluorescens-imaging som spinning-disk mikroskopi, aktivere indfange calcium dynamikken i 3 dimensioner. En anden grænse ville være i vivo calcium imaging12. Den gennemsigtige karakter af zebrafisk embryo eller brug af pigment-mindre stammer af zebrafisk voksne23 kunne åbne mulighed for, i vivo billeddannelse i fremtiden.
Billeddannelse af beta-celle aktivitet ved høje rumlige og tidsmæssige opløsning giver mulighed for at undersøge den funktionelle heterogenitet blandt enkelte beta-celler. Denne fremgangsmåde kan hjælpe kaste lys over eksistensen af beta-celle delpopulationer. For nylig, har flere undersøgelser vist eksistensen af delpopulationer i nominelt homogen betaceller24,25,26. Ex vivo billeddannelse kan kombineres med genetiske journalister til at karakterisere sub-befolkningens reaktion til glukose. Desuden kan kombinere billedbehandling opsætningen med farmakologiske stimulation give for screening af forbindelser, der kunne forbedre beta-celle funktionalitet.
I Resumé tillader teknikken præsenteres her kvantificering og sammenligning af glucose lydhørhed for individuelle beta-celler. Det giver et direkte vindue ind i beta-celle funktionalitet, en vigtig parameter i udviklingen af diabetes.

Vores blodsukker er fastholdt i et snævert interval, i stor del på grund af funktionen af endokrine bugspytkirtlen. De endokrine rolle i bugspytkirtlen er udført af Holme af Langerhanske, som indeholder hormon-hemmelig celler. Insulin-secernerende beta-celler er ansvarlige for at reducere niveauet af blodsukker efter et kulhydrat-holdige måltid. Utilstrækkelig insulin udskillelsen fra beta-celle kan resultere i diabetes1, som er karakteriseret ved vedvarende høje blodsukker. Type 1 og Type 2 Diabetes, der i øjeblikket rammer mere end 400 millioner mennesker verden over, fører til sygelighed og dødelighed2. Ved at undersøge de molekylære og miljømæssige faktorer, der bidrager til beta-celle dysfunktion, vil vi forstå bedre hvordan type 2-diabetes begynder og skrider frem. Derudover kan evnen til at skelne menneskelige stamceller i funktionelle beta-celler in vitro- giver en kilde til nye beta-celler for celle-udskiftning behandlingsformer i Type 1 Diabetes. Med henblik herpå er det vigtigt at undersøge beta-celle funktion og modning i genetiske modelorganismer for at få den nødvendige viden til at lave funktionelle betaceller i et fad.
Beta-celle funktionalitet kan overvåges på det hele-Holm niveau af kvantificere den samlede mængde insulin udskilles som svar på glucose-stimulation. Denne kumulative tilgang studerer Holmen som en enkelt gruppe af celler uden differentiering individuelle egenskaber for en celle. Analyse af glukose svar af individuelle beta-celler viste imidlertid en mangfoldighed i de funktionelle egenskaber af beta-celler og tilstedeværelsen af heterogenitet3. For at vurdere funktionen af individuelle beta-celler, er det muligt at overvåge de intracellulære ændringer, der fører til insulin udskillelsen4. Insulinsekretion er forudgået af en post af glucose ind i beta-cellerne. Glukose, der kommer ind i beta-cellerne metaboliseres hurtigt til ATP. Højere intracellulære ATP koncentrationer formindske åben sandsynligheden for ATP-følsomme kalium Ionkanaler fører til beta-celle depolarisering. Depolarisering åbner Ionkanaler spænding-følsomme calcium og øger intracellulære calcium. Til gengæld udløser calcium exocytose af insulin, som er udgivet i omløb og sænker blodsukkerniveauet ved at fremme glukose-udnyttelse5,6,7.
Flere strategier er blevet anvendt til at undersøge funktionen af beta-celler, herunder kontrol af membranen potentiale8, direkte visualisering af insulin-vesikler exocytose9og kvantificering af intracellulære Ca2 + tilstrømning som en proxy for glucose-lydhørhed10. Blandt dem giver billeddannelse af intracellulære Ca2 + fordelen ved opskalering analyse til flere individuelle celler inden for samme ø11,12, giver mulighed for direkte sammenligning af glukose-lydhørhed mellem enkelte beta-celler. Intracellulære Ca2 + koncentration kan overvåges ved hjælp af calcium-følsomme fluorescerende farvestoffer13 eller genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs)14. Mens calcium-indikator farvestoffer manglende celletype specificitet, GECIs kan udtrykkes i en bestemt celletype af specifikke initiativtagere. Desuden, giver den nye generation af GECIs, såsom GCaMP6, bedre signal / støj-forhold sammen med hurtigere tidsmæssige dynamics15. Her beskriver vi nytte af den nye generation af GECIs, i særlige GCaMP6s, til at visualisere calcium i beta-celler i én celle opløsning. Vi anvender denne metode til zebrafisk primære Holmen som vores model af valg. Under fosterudviklingen, beta-celler i den primære islet stammer fra den dorsal og ventral pancreas knopper16. Den primære Holmen er placeret på en stereotyp anatomisk stilling i zebrafisk bugspytkirtlen, gør det muligt for dens nem identifikation og isolation. Beta-celler i den primære Holmen er nødvendige for glucose-regulering, som deres genetiske ablation fører til hyperglykæmi17,18. Desuden, disse beta-celler bliver glukose-responderende under tidlige zebrafisk udvikling19. Denne protokol kan også anvendes til imaging de sekundære Holme, som udgør under de post vorden. Protokollen giver mulighed for at billedet beta-celler ex vivo, i senere faser af udvikling og under definerede glucose koncentrationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:276px;">Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">By request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">495015-0001-000</td>
			<td style="width:291px;">SteREO Discovery.V8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">423013-9010-000</td>
			<td style="width:291px;">Illuminator HXP 120 V</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Red Filter Cube</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">000000-1114-462&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Filter set 45 HQ TexasRed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">LSM 780</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine fibrinogen</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt solution)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm diameter glass-bottom dishes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">E10521&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11445-12</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">R, version 3.2.4</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">RStudio</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">plotcelltrace.R</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">A custom script provided with the manuscript</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

Pancreas beta-celler reagerer på stigende blod glucose koncentrationer ved at udskille hormonet insulin. Dysfunktion af beta-celler fører til hyperglykæmi og alvorlig, livstruende konsekvenser. Forståelse af hvordan beta-celler fungerer under fysiologiske forhold og hvilke genetiske og miljømæssige faktorer kan forårsage deres dysfunktion kan føre til bedre behandlingsmuligheder for diabetisk patienter. Evnen til at måle calcium niveauer i beta-celler fungerer som en vigtig indikator for beta-celle funktion, som tilstrømningen af calcium ioner udløser insulin frigivelse. Her beskriver vi en protokol for overvågning af glucose-stimuleret calcium tilstrømningen i zebrafisk beta-celler ved hjælp af GCaMP6s, en genetisk kodet sensor af calcium. Metoden tillader overvågning intracellulære calcium dynamics med enkelt-celle opløsning i ex vivo monteret Holme. Glukose-lydhørhed af beta-celler i de samme islet kan hentes samtidigt under forskellige glucose koncentrationer, hvilket tyder på tilstedeværelsen af funktionelle heterogenitet blandt zebrafisk beta-celler. Desuden giver teknikken høj tidsmæssige og rumlige opløsning, der afslører den oscillerende karakter af calcium tilstrømning ved glucose stimulation. Vores tilgang åbner dørene for at bruge zebrafisk som en model til at undersøge bidrag af genetiske og miljømæssige faktorer til beta-celle funktion og dysfunktion.

Ved hjælp af protokollen, der er beskrevet ovenfor, blev glukose svar af beta-celler i en Holm fra en 45 dage efter befrugtning (dpf) zebrafisk analyseret. For dette, var den primære islet dissekeret fra en aflivede dyr og monteret i fibrinogen-thrombin skimmel i en glas-bund fad. Holmen var nedsænket i HBSS som indeholder 5 mM glukose. Glukose koncentration blev øget i en trinvis måde til 10 og 20 mM. Svar af beta-celler til de stigende glucose koncentrationer blev registreret. Endelig blev beta-celler depolariseret ved hjælp af 30 mM KCl (figur 1). Depolarisering ved hjælp af KCl inducerer calcium indrejse i sund beta-celler.
Ved hjælp af FIJI og en data analyse software, GCaMP6s fluorescens-intensiteten af individuelle beta-celler er udvundet og normaliserede (figur 2). Set fra spor af fluorescens intensitet, vise enkelte betaceller svingninger i GCaMP6s fluorescens ved glucose stimulation, som stopper ved KCl stimulation. Teknikken giver en cellulær opløsning af beta-celle glukose-lydhørhed og et vindue ind i deres funktionalitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figur 1: Ex vivo live-billeddannelse af calcium tilstrømning ved hjælp af GCaMP6s i zebrafisk betaceller. En primær Holm fra Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafisk (45 dpf) blev monteret i fibrinogen-thrombin mug og inkuberes med 5 mM (basal) glukose. Beta-celler blev mærket med en rød nukleare markør, mens GCaMP6s Fluorescens er til stede i den grønne kanal. Holmen blev stimuleret med en glucose-rampe består af sekventielle inkubering med 10 mM og 20 mM D-glucose og depolariseret via tilføjelsen af 30 mM KCl. pilespidser markere individuelle beta-celler hvis virksomhed blev analyseret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figur 2: normaliserede GCaMP6s fluorescens intensitet-spor for individuelle betaceller. Normaliserede GCaMP6s fluorescens intensitet-spor for beta-celler er markeret med pilespidser i figur 1. X-aksen angiver tiden i sekunder. Øverst skildrer barer koncentrationen af glukose og KCl i HBSS medium. Y-aksen betegner normaliseret fluorescens-intensiteten under tid-serien. For dette beregnes baseline intensitet (F0) som den gennemsnitlige intensitet under inkubation i 5 mM glukose. Dette trækkes fra de hele tid-serie data (F - F0). Intensitet-over grundlinjen er normaliseret af den maksimale intensitet vises i cellen (F - F0) / (Fmax- F0). Den normaliserede spor viser en oscillerende svar af beta-celler til glukose, som stabiliserer når cellerne er depolariseret med 30 mM KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Beta-celle funktionalitet er vigtig for blod-glukose homøostase, som er evalueret for en enkelt celle opløsning ved hjælp af en genetisk kodet reporter for calcium tilstrømning.

Analyse af Beta-celle funktion ved hjælp af encellede opløsning Calcium Imaging i zebrafisk Holme

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inden Zebrafisk embryoner at studere genekspression og funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analyse af Nephron opbygning og funktion i Voksen Zebrafisk Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC protokol Visualiserer Protein Expression på Single Cell Opløsning i Whole Mount Skin Forberedelser

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

En hurtig Automatiseret Protokol for muskelfiber Population Analysis i rottemuskel tværsnit Brug af myosin Heavy Chain Immunhistokemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Encellet opløsning tredimensionel billeddannelse af intakte organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

Fotodiode-baseret optisk billedbehandling til optagelse af netværksdynamik med enkelt-neuronopløsning i ikke-transgene hvirvelløse dyr

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...