Name: analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

Vi tackar medlemmar Ninov labbet för synpunkter på manuskriptet, medlemmar av Center för regenerativ terapier Dresden (CRTD) fisk och mikroskopi anläggning för tekniskt bistånd. N.N. stöds av medel från de DFG-CRTD, Cluster of Excellence vid TU-Dresden, tyska Research Foundation (DFG) och den tyska Center för Diabetes forskning (DZD).

Alla förfaranden inklusive animaliska ämnen har godkänts av djurskyddslagen och med tillåtelse av Landesdirektion Sachsen, Tyskland (AZ 24 – 9168.11-1/2013-14, T12-2016).
1. beredning
Obs: Detta protokoll är för ex vivo imaging av zebrafisk primära holme från dubbel transgena Tg (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafiskar. I denna transgena linje, driver insulin arrangören (ins) beta-cell specifika uttryck för två transgener: nls-Renilla-mKO2, som markerar kärnan av beta-celler med monomer Kusabira orange 2 (mKO2) fluorescens; och GCaMP6s15, som avger grön fluorescens svar på ökning av intracellulära kalciumnivåer. Beta-cell-specifika uttryck för GCaMP6s kan studera glukos-lyhördheten för beta-celler utan inblandning från kalcium förändringar i omgivande celltyper.
<ol><li>Förbereda färska fibrinogen lager (10 mg/mL) genom upplösning 10 mg av nötkreatur fibrinogen i 1 mL Ca2 +/Mg2 +-innehållande Hanks balanserad saltlösning (HBSS) i ett 1,5 mL centrifugrör. Vortex kraftigt tills fibrinogen pulvret löser sig helt. Förvara lösningen i rumstemperatur under minst 15 minuter mer. Obs: Beståndet kan förvaras i rumstemperatur i 2 – 3 h. Kassera beståndet om lösningen börjar att polymerisera och blir trögflytande.</li>
	<li>Förbereda fibrinogen arbetslösning (3,3 mg/mL) genom att späda ut fibrinogen beståndet three-fold i HBSS. Till exempel blanda 300 µL av fibrinogen lager i 600 µL HBSS att förbereda 900 µL av fibrinogen fungerande lösning.</li>
	<li>Förbereda trombin lösning (10 U/mL) genom upplösning 10 enheter av trombin i 1 mL HBSS eller fosfat buffrad saltlösning (PBS). Obs: Denna lösning kan förberedas i förväg, aliquoted i 50 µL delar, och frysas vid-20 ° C.</li>
	<li>Förbereda 200 mM D-glukos lösning genom att lösa upp 1,8 g D-glukos i 50 mL vatten. Tänk på 4 ° C för långsiktig lagring.</li>
	<li>Förbereda 300 mM KCl lösning genom att lösa upp 1,1 g av KCl i 50 mL vatten. Tänk på 4 ° C för långsiktig lagring.</li>
	<li>Upphandla 35 mm diameter glasbotten rätter för montering kobbar och skär.</li>
	<li>För dissektion och montering av Holmen, Använd en stereo Mikroskop utrustat med fluorescens lampa och rött filter kub (TRITC: excitation: 532 – 554 nm, emission: 570 – 613 nm; eller Texas-röd: excitation: 540 – 580 nm, emission: 592 – 667 nm).</li>
	<li>För imaging kalcium inflödet i beta-celler, Använd en inverterad confocal Mikroskop (Zeiss LSM 780 eller liknande) med 20 X (0.8 NA) luft mål och utrustad med en tallrik hållare för 35 mm diameter glasbotten rätter.</li>
	<li>Bered en 200 mg/L av tricaine metan sulfonat (MS222) för euthanizing zebrafiskar.</li>
	<li>Upphandla 90 mm petriskålar för zebrafiskar dissektion.</li>
</ol>2. zebrafiskar primära Islet dissektion och montering
<ol><li>Avliva en fisk som använder långvarig inkubation i MS222. För detta försiktigt bort fisken från fisk tank med ett fiske som är netto och inkubera det i en petriskål som innehåller den MS222 lösningen tills djuret visar ingen opercular (gälar) rörelse; vanligtvis, detta tar 5 min. överföring fisken till en petriskål innehållande HBSS lösningen med Ca2 +/Mg2 +.</li>
	<li>
I stereo Mikroskop utrustat med fluorescens lampa och rött filter kub, dissekera huden som täcker höger sida av buken av djuret att isolera bukspottkörteln.
	<ol>
<li>För detta, skära huden på zebrafiskar från mun till analfenan med vassa pincetten. Skala bort skära huden för att exponera buken; Detta snipping exponerar de inre organen. Genom att använda den röd fluorescensen av mKO2 uttryck i beta-cellerna, fastställa platsen för holmarna genom visuell undersökning under mikroskop. Om det behövs, ta bort loberna i levern, som de kunde täcka Holmen, vilket gör det svårt att hitta. Obs: Den primära Holmen ligger nära den främre regionen av buken, oftast på höger sida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ren den primära Holmen genom att försiktigt ta bort omgivande vävnad såsom lever och adipocyter. Vidta försiktighetsåtgärder för att inte skada eller peta Holmen; efter röjning i den omgivande vävnaden, blir de enskilda cellerna på islet ytan märkbara.</li>
	<li>Pipettera en 30 µL droppe HBSS på mitten av en glasbotten maträtt. Överföra dissekerade Holmen till denna minskning.</li>
	<li>Noggrant tvätta den lilla ön en gång med HBSS och en gång med 30 µL fibrinogen arbetslösning (3,3 mg/mL). Se till att undvika uttorkning av Holmen under tvätt stegen eftersom underlåtenhet att göra detta resulterar i celldöd.</li>
	<li>Långsamt och försiktigt tillsätt 10 µL av trombin lösningen (10 U/mL). Lämna Holmen och skålen orörd för 15 – 20 min. Observera att fibrinogen-trombin drop blir trögflytande och svagt ogenomskinlig på denna punkt.</li>
</ol>3. Ex Vivo Live-avbildning av GCaMP fluorescensintensiteten i zebrafiskar primära holmar
<ol><li>Tillsätt 200 µL HBSS ovanpå formen och placera skålen försiktigt på plattan innehavaren av mikroskopet confocal. Använd ett 20 X, 0.8 NA, luft mål för confocal imaging. Leta reda på den lilla ön med alternativet brightfield.</li>
	<li>Använda filtret för röd fluorescens att visa den nukleära mKO2 fluorescensen i beta-celler, fokusera på Holmen. Enskilda kärnor bör synas tydligt.</li>
	<li>Leta upp en tydlig bildplanen genom att manuellt ändra fokalplanet av confocal mikroskopet för att flytta genom tjockleken på den lilla ön längs z-axeln. Se till att bildplanen innehåller tillräckligt många (50 – 100) av beta-celler för avbildning, och ljusstyrkan på den nukleära mKO2 fluorescensen är enhetlig, särskilt i mitten av Holmen.</li>
	<li>Ställa in en sekventiell förvärv för GCaMP6s och mKO2 fluorescens med följande inställningar i ”Smart inställningsmenyn”: GCaMP6s, excitation: 488 nm, emission: 500 – 555 nm, falskt-färg: grön (Välj ”GFP”); mKO2, excitation: 561 nm (mCherry), utsläpp: 570 – 630 nm, falskt-färg: röd (Välj ”mCherry”). Obs: Med denna inställning den röda kanalen registrerar positionen för beta-cell kärnor, medan den gröna kanalen kommer att registrera GCaMP fluorescensintensiteten.</li>
	<li>I läget ”förvärv” ange bildupplösning på 1 024 x 1 024 bildpunkter, hastighet på 10 och genomsnitt 1. Initiera en kontinuerlig inspelning genom att välja alternativet ”tidsserier” och ange ”varaktighet” för 500 cykler, med cirka 2 s förvärv tid per bildruta. Obs: De första 50 ramarna av tid-serien motsvarar aktiviteten av betacellerna vid koncentration av 5 mM glukos. Detta är baslinjen svar. En svarande beta-cell visar vaxning och avtagande i grön fluorescensintensitet med tiden. Vi har observerat att några (1 – 5%) av beta-cellerna oscillerar på 5 mM glukos.</li>
	<li>
Hålla ett öga på imaging cykeln. Efter de första 50 bildrutorna, öka glukos koncentrationen av den omgivande lösningen till 10 mM utan att stoppa inspelningen.
	<ol>
<li>Utan störande bild förvärv, försiktigt Pipettera 5 µL av 200 mM D-glukos lösning ovanpå gelen håller Holmen. Förvärva 150 ramar på 10 mM glukos. Obs: Ökningen av glukos koncentration kommer att öka antalet beta-celler genomgår GCaMP fluorescerande svängningar i den gröna kanalen.</li>
		<li>Säkerställa att atomkärnor av cellerna förblir stabila under processen. Om Holmen skakar flitigt under förvärv och atomkärnor flyttar ur fokalplanet, kassera provet (vid behov).</li>
		<li>Vänta en tillräcklig tidsperiod aktivera polymerisation av fibrinogen-trombin mögel för att säkerställa stabiliteten i efterföljande prover.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Med 200 bildrutor, ytterligare öka koncentrationen av lösningen till 20 mM av försiktigt pipettering 10 µL av 200 mM D-glukos lösning. Förvärva 150 ramar för koncentrationen i 20 mM.</li>
	<li>Efter 350 ramar, depolariseras Holmen med 30 mM av KCl. För detta, tillsätt 20 µL av 300 mM KCl stamlösning. I detta skede Observera att GCaMP6s fluorescens svängningarna stannar och fixa med en hög intensitet; beta-celler som inte svarade på glukos kan också visas en ökning i green-fluorescensintensiteten vid KCL tillägg.</li>
</ol>4. kvantifiering av GCaMP fluorescens Trace för enskilda Beta-celler
Obs: För att spåra och kvantifiera Svaren av enskilda beta-celler på olika nivåer av glukos, kvantifiera GCaMP fluorescensintensiteten under hela imaging. Kvantifiering utförs på cellulära upplösning. Till detta använder du FIJI20 att extrahera intensitetsvärdena av GCaMP fluorescens från bilder (steg 4.1 – 4.6), och kalkylprogram eller R21 att utföra analys (steg 4,8 – 4,9).
<ol><li>Öppna bildfilen i FIJI använder verktygslådan ”LSM”. För detta, Välj ”Plugin | LSM Toolbox | Visa LSM verktygslåda ”. Klicka på ”öppna LSM” i ”LSM verktygslådan” och välj bildfilen. Obs: För format som inte stöds av ”LSM verktygslådan”, konvertera dem först för att tiff för analys.</li>
	<li>Extrahera svaren från celler med hjälp av verktyget region-of-intresse (ROI) i FIJI. Öppna ”ROI Manager” i menyn ”analysera” under ”verktyg”. Manuellt rita ROI med ”polygon markeringsverktyget” ligger i verktygsfältet.</li>
	<li>Rita ROI i den röda kanalen där beta-cell kärnorna är synliga. Välj ROI sådana att de täcker ett område som är större än cellens kärna för att inkludera några av cellens cytoplasma. Garantera en överensstämmelse mellan ramar ROI position och justera positionen vid behov.</li>
	<li>Lägg de valda ROIs ”ROI manager” genom att klicka på knappen ”Lägg till [t]”. Välj och Lägg till flera ROIs ROI för att erhålla data på flera celler.</li>
	<li>Välj sedan menyn ”analysera”, ”ange mått”. Välj ”integrerad täthet” för att ange utvinning av totala fluorescensintensiteten inom området.</li>
	<li>Till den gröna kanalen som innehåller GCaMP fluorescensen och väljer ”Multi mått” i ”ROI Manager”. Obs: Detta ger intensitet mätningarna för cellerna hela tiden-serien.</li>
	<li>Om ROI ställning måste justeras på grund av rörligheten för Holmen, manuellt sammanställa mätningar av intensiteten i olika ramar. Kopiera och klistra in värden till ett separat kalkylblad.</li>
	<li>Erhålla tidsstämplar bild bildrutor från ”LSM Toolbox”. Använd ”tillämpa frimärken | Tillämpa t stämplar | Filnamn | ”Dumpa till textfil” för att få tidsstämplar. Spara tidsstämplar med alternativet ”Spara som” eller kopiera dem till kalkylbladet.</li>
	<li>Vid sammanställningen intensitetsvärdena för alla celler, utföra analys en cell i taget eller automatiskt (t.ex., Excel formler eller R).</li>
	<li>
Analysera enskilda celler i två steg.
	<ol>
<li>I det första steget, beräkna fluorescensintensiteten ovanför baslinjen. I detta syfte att beräkna baslinjen fluorescerande intensiteten (F0) som genomsnittet av fluorescens stödnivåer för de första 50 bildrutorna (5 mM glukos). Subtrahera sedan baslinjen (F0) från hela tiden-serien (F – F0). Obs: några celler kan visa tydliga GCaMP svängningar under basala glukos, som vanligtvis fortsätter efter stimulering med högre koncentrationer. För sådana celler är det endast möjligt att uppskatta F0 genom att ta medelvärdet intensiteten i de inledande bildrutorna där cellerna visade en nedgång i fluorescens.</li>
		<li>I det andra steget i analysen, få slutliga GCaMP fluorescensintensiteten genom att normalisera fluorescensintensiteten. Obs: Detta görs för att ta bort skillnaderna mellan kobbar från olika djur. Enskilda holmar uppvisar varierande nivåer av fluorescens utsläpp vid glukos stimulering.</li>
		<li>Normalisera fluorescensintensiteten genom att dividera det med högsta intensitetsvärdet. För detta, beräkna maximal intensitet (Fmax – F0) och dividera subtraheras originalplansvärden med maximal intensitet att ge slutliga GCaMP fluorescensintensiteten (F – F0) / (Fmax – F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kassera de celler som inte uppvisar en förändring i intensitet KCl stimulering, som de kan vara ohälsosam eller skadade.</li>
	<li>För att utföra analysen (steg 4,9 – 4.10) i R, använda skriptet R (plotcelltrace. R) som medföljer detta manuskript.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contributions+of+insulin+resistance+and+beta-cell+dysfunction+to+the+pathophysiology+of+Type+2+diabetes.">The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).</li><li>Ogurtsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+for+the+prevalence+of+diabetes+for+2015+and+2040.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040.</a> Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).</li><li>Pipeleers, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pancreatic+beta-cell+population.">Heterogeneity in pancreatic beta-cell population.</a> Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).</li><li>MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+mechanisms+in+pancreatic+beta-cells.">Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).</li><li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+induces+oscillatory+Ca2++signalling+and+insulin+release+in+human+pancreatic+beta+cells.">Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 37, S11-S20 (1994).</li><li>Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+oscillations+of+cytoplasmic+Ca2++and+insulin+release+in+glucose-stimulated+pancreatic+islets.">Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).</li><li>Wollheim, C. B., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cytosolic+free+Ca2++and+insulin+release+in+an+insulin-secreting+cell+line.">Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line.</a> J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).</li><li>Pace, C. S., Price, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+responses+of+pancreatic+islet+cells+to+secretory+stimuli.">Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli.</a> Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).</li><li>Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+of+single+insulin+secretory+granules+with+evanescent+wave+microscopy:+distinct+behavior+of+granule+motion+in+biphasic+insulin+release.">Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release.</a> J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).</li><li>Soria, B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+oscillations+and+insulin+release+in+pancreatic+islets+of+Langerhans.">Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).</li><li>Kenty, J. H. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+pancreatic+islet+function+at+the+single+cell+level+by+calcium+influx+with+associated+marker+expression.">Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression.</a> PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+developmental+histories+of+beta-cells+generate+functional+and+proliferative+heterogeneity+during+islet+growth.">Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth.</a> Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Friedman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+autoimmune+microenvironment+regulates+the+quality+of+effector+T+cell+restimulation+and+function.">An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function.</a> Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+&#946;-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature &#946;-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nat Commun. 7, 11756 (2016).</li><li>Johnston, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+Cell+Hubs+Dictate+Pancreatic+Islet+Responses+to+Glucose.">Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose.</a> Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).</li></ol>

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Här visar vi en teknik för kvantifiering av beta-cellen glukos lyhördhet encelliga upplösning. Detta möjliggörs genom att övervaka intracellulära kalciumkoncentration med hjälp av en indikator för genetiskt-kodade kalcium, GCaMP6s. Beta-cell aktivitet är tagna ex vivo genom att montera lilla i en fibrinogen-trombin mögel. Ett avgörande steg i protokollet är stabiliteten av mögel. Tillräcklig tid måste ges för fibrinogen att upplösa i HBSS lösningen. Utan detta, mögel inte polymerisera tillräckligt för att ge stabilitet under bildsession. En holme monterad i fibrinogen-trombin mögel och nedsänkt i cell kultur media kan förbli lönsamt för minst en vecka (inga data anges). Alternativ till fibrinogen-trombin mögel, såsom låg-melt agaros, kan utnyttjas för att montera den holme22. En annan viktig parameter är dissektion av Holmen. Under detta steg behöver vävnaden som omger lilla tas bort utan att skada eller peta Holmen. En skicklig dissektion kommer med praktiken.
En begränsning av protokollet imaging är begränsningen till en confocal plan av Holmen. Detta görs för att fånga dynamiken i kalcium tillströmningen inom enskilda beta-celler. En Z-stacken genom hela tjockleken på Holmen leder till låg imaging hastigheter och oscillerande signalförlust från enskilda celler. Denna begränsning kan förbättras med hjälp av snabbare transportmedel confocal-imaging såsom spinning-disk mikroskopi, aktivera fånga kalcium dynamiken i 3 dimensioner. En annan gräns skulle vara i vivo kalcium imaging12. Transparent beskaffenhet zebrafiskar embryo eller användning av pigment-mindre stammar av zebrafisk vuxna23 kunde öppna möjligheten i vivo imaging i framtiden.
Bildtagning av beta-cells aktivitet med hög rumsliga och temporal upplösning kan undersöka funktionella heterogenitet bland enskilda beta-celler. Denna strategi kan hjälpa till att belysa förekomsten av beta-cell delpopulationer. Nyligen har visat flera studier förekomsten av undergruppen av befolkningen i den nominellt homogen beta-celler24,25,26. Ex vivo imaging kan kombineras med genetiska reportrar att karakterisera sub-befolkningens svar till glukos. Dessutom kan kombinerar den imaging setup med farmakologisk stimulering tillåta för screening av föreningar som skulle kunna förbättra beta-cell funktionalitet.
Sammanfattningsvis tillåter den teknik som presenteras här kvantifiering och jämförelse av glukos lyhördheten för enskilda beta-celler. Det ger ett direkt fönster i beta-cellen funktionalitet, en viktig parameter i utvecklingen av diabetes.

Våra blodglukossänkande upprätthålls inom ett snävt intervall, till stor del på grund av funktionen av endokrina bukspottkörteln. Den endokrina rollen i bukspottkörteln utförs av de Langerhanska öar, som innehåller hormon utsöndrar celler. Insulin-utsöndrar beta-cellerna är ansvariga för att sänka blodsockret efter en måltid som innehåller kolhydrater. Otillräcklig insulinutsöndringen från beta-cellen kan resultera i diabetes1, som kännetecknas av ihållande höga blod-glukos. Typ 1 och typ 2-Diabetes, som för närvarande drabbar mer än 400 miljoner människor i världen, leder till morbiditet och mortalitet2. Genom att undersöka de molekylära och miljömässiga faktorer som bidrar till beta-cell dysfunktion, förstår vi bättre hur typ 2-diabetes startar och fortskrider. Förmågan att skilja mänskliga stamceller till funktionella beta-celler in vitro- kan dessutom ge en källa till nya beta-celler för cell-ersättning terapier i typ 1-Diabetes. Därför är det viktigt att studera beta-cell funktion och mognad i genetiska modellorganismer för att få den nödvändiga kunskapen för att göra funktionella beta-celler i en maträtt.
Beta-cell funktionalitet kan övervakas på hela-holme nivå av kvantifiera den totala mängden insulin utsöndras som svar på glukos-stimulering. Denna kumulativa strategi studier Holmen som en enda grupp av celler utan att skilja cellens individuella egenskaper. Analysen av glukos svar av enskilda beta-celler visade emellertid en mångfald i betacellerna funktionella egenskaper och förekomsten av heterogenitet3. För att bedöma funktionen i enskilda beta-celler, är det möjligt att övervaka de intracellulära förändringar som leder till insulin sekretionen4. Insulinutsöndringen föregås av en post av glukos in i beta-cellerna. Den glukos som kommer in i beta-cellerna metaboliseras snabbt till ATP. Högre intracellulära ATP koncentrationerna minska öppen sannolikheten för ATP-känsliga kalium jonkanaler vilket leder till beta-cell depolarisation. Depolarisation öppnar spänningskänsliga kalcium jonkanaler och ökar intracellulär kalcium. I sin tur utlöser kalcium exocytos av insulin, som släpps i cirkulationen och sänker blodsockernivån genom att främja glukos-utnyttjande5,6,7.
Flera strategier har tillämpats för att undersöka funktionen av beta-celler, inklusive övervakning av membranet potential8, direkt visualisering av insulin-blåsor exocytos9och kvantifiering av intracellulära Ca2 + tillströmning som en proxy för glukos-lyhördhet10. Bland dem ger avbildning av intracellulära Ca2 + fördelen av up-scaling analysen till flera enskilda celler inom samma holme11,12, möjliggör direkt jämförelse av glukos-lyhördheten mellan enskilda beta-celler. Intracellulära Ca2 + koncentrationen kan övervakas med hjälp av kalcium-känsliga fluorescerande färgämnen13 eller genetiskt-kodade kalcium indikatorer (GECIs)14. Medan kalcium-indikator färgämnen brist celltyp specificitet, GECIs kan uttryckas i en viss celltyp av specifika initiativtagare. Dessutom ger den nya generationen av GECIs, såsom GCaMP6, bättre signal-brus-förhållande tillsammans med snabbare temporal dynamics15. Här beskriver vi nyttan av den nya generationen av GECIs, i särskilda GCaMP6s, att visualisera kalcium i beta-cellerna i encelliga upplösning. Vi tillämpa denna metod på zebrafiskar primära Holmen som vår modell av val. Under fosterutvecklingen, beta-celler i den primära islet härstammar från den dorsala och ventrala bukspottskörteln knoppar16. Den primära Holmen ligger vid en stereotypa anatomisk position inom zebrafiskar bukspottkörteln, möjliggör dess enkel identifiering och isolering. Beta-celler i den primära Holmen är nödvändiga för glukos-förordningen, eftersom deras genetiska ablation leder till hyperglykemi17,18. Dessutom blir dessa beta-celler glukos-lyhörd under tidig zebrafiskar utveckling19. Detta protokoll kan också tillämpas för imaging de sekundära holmar, som bildar under efter embryonala stadier. Protokollet tillåter att bilden betacellerna ex vivo, vid senare stadier av utveckling och under definierade glukos koncentrationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:276px;">Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">By request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">495015-0001-000</td>
			<td style="width:291px;">SteREO Discovery.V8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">423013-9010-000</td>
			<td style="width:291px;">Illuminator HXP 120 V</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Red Filter Cube</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">000000-1114-462&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Filter set 45 HQ TexasRed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">LSM 780</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine fibrinogen</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt solution)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm diameter glass-bottom dishes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">E10521&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11445-12</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">R, version 3.2.4</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">RStudio</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">plotcelltrace.R</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">A custom script provided with the manuscript</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

Betaceller-svara på ökande blodglukosvärden genom att utsöndra hormonet insulin. Dysfunktion av beta-celler leder till hyperglykemi och svår, livshotande konsekvenser. Förstå hur beta-cellerna fungerar under fysiologiska betingelser och vilka genetiska och miljömässiga faktorer kan orsaka deras dysfunktion kan leda till bättre behandlingsalternativ för patienter med diabetes. Förmågan att mäta halter av kalcium i beta-celler fungerar som en viktig indikator på beta-cell-funktion, som inflödet av kalcium joner utlösare insulinfrisättning. Här beskriver vi ett protokoll för övervakning av glukos-stimulerad kalcium tillströmningen i zebrafiskar beta-celler med hjälp av GCaMP6s, en genetiskt kodade sensor av kalcium. Metoden tillåter övervakning av intracellulära kalcium dynamiken med encelliga upplösning i ex vivo monterad holmar. Glukos-lyhördheten för beta-celler inom samma Holmen kan fångas samtidigt under olika glukos koncentrationer, vilket tyder på förekomst av funktionella heterogenitet bland zebrafiskar beta-celler. Tekniken ger dessutom hög temporal och spatial upplösning, som avslöjar den oscillerande naturen av kalcium tillströmningen vid glukos stimulering. Vår strategi öppnar dörrarna för att använda zebrafiskar som en modell för att undersöka vilka genetiska och miljömässiga faktorer till beta-cell funktion och dysfunktion.

Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, analyserades glukos svaren från beta-celler i en holme från en 45 dagar efter befruktning (dpf) zebrafiskar. För detta var den primära Holmen dissekeras från ett euthanized djur och monterad i fibrinogen-trombin mögel i en glas-botten maträtt. Holmen var nedsänkt i HBSS innehållande 5 mM glukos. Glukos koncentrationen ökade i en stegvis sätt till 10 mM och 20 mM. Svaren från beta-celler till de ökande koncentrationerna som glukos registrerades. Slutligen, beta-celler var Aricebo med 30 mM KCl (figur 1). Den depolarisation använder KCl inducerar kalcium post i friska beta-celler.
Med hjälp av FIJI och en programvara för analys av data, GCaMP6s fluorescensintensiteten hos enskilda beta-celler utvinns och normaliserade (figur 2). Sett från tracen av fluorescensintensiteten, visar enskilda beta-celler svängningar i GCaMP6s fluorescens vid glukos stimulering, som stannar vid KCl stimulering. Tekniken ger en cellulär upplösning på beta-cellens glukos-lyhördhet och ett fönster i deras funktionalitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figur 1: Ex vivo live-avbildning av kalcium tillströmningen med GCaMP6s i zebrafiskar betacellerna. En primär holme från Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafiskar (45 dpf) var monterad i fibrinogen-trombin mögel och inkuberas med 5 mM (basala) glukos. Beta-celler var märkt med en röd markör för kärnkraft medan GCaMP6s fluorescensen är närvarande i den gröna kanalen. Holmen var stimuleras med en glukos-ramp bestående av sekventiell inkubation med 10 mM och 20 mM D-glukos och Aricebo via tillägg av 30 mM KCl. pilspetsar markera enskilda beta-celler vars verksamhet analyserades. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figur 2: normaliserade GCaMP6s fluorescens intensitet-trace för enskilda betacellerna. Normaliserad GCaMP6s fluorescens intensitet-trace för beta-cellerna markerade med pilar i figur 1. X-axeln anger tiden i sekunder. Överst skildrar barer koncentrationen av glukos och KCl i HBSS medium. Y-axeln betecknar normaliserade fluorescensintensiteten under tiden-serien. För detta beräknas baslinjen intensitet (F0) genomsnittliga intensiteten under inkubation i 5 mM glukos. Detta dras från hela tidsserier data (F - F0). Intensitet-över baslinjen är normaliserat av maximalstyrkan visas av cellen (F - F0) / (Fmax- F0). Normaliserade spåret visar ett oscillerande svar av beta-celler till glukos vilket stabiliserar när cellerna är Aricebo med 30 mM KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Beta-cell funktionalitet är viktigt för blodglukos homeostas, som utvärderas med encelliga upplösning med en genetiskt kodade reporter för kalcium tillströmning.

Analys av Beta-cell-funktion som använder Single-cell Resolution kalcium Imaging i zebrafiskar holmar

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

In situ Kvantifiering av bukspottkörteln-cellmassan hos möss

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Encelliga Fate Kartläggning i zebrafisk

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hög upplösning Hela Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inom Zebrafish embryon för att studera genuttryck och funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analys av Nephron sammansättning och funktion i vuxen Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC protokoll Visualiserar proteinuttryck på Single Cell Beslut hela montera hudpreparat

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

En Rapid Automatiserad Protokoll för Muscle Fiber Population Analysis i råttmuskel Cross sektioner med hjälp tunga kedjan från myosin Immunohistokemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Single-Cell Resolution Tredimensionell avbildning av intakta organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

Fotodiodbaserad optisk avbildning för inspelning av nätverksdynamik med en neuronupplösning hos icke-transgena ryggradslösa djur

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...