Name: in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00
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이 작품은 수상에 의해 투자 되었다 아니. OCE-버로우즈 Wellcome 펀드 박사 농축 프로그램에서 국립 과학 재단 해양 과학 박사 친목 및 수상 no.1012629 통해 1323652.

1입니다. 파라핀 제거
주의: 증기 두건에서 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>100% 크 실 렌 유리 Coplin 단지 10 분의 후드 아래에 있는 얇은 sectioned 파라핀 끼워 넣어진 슬라이드 dewax 크 실 렌 녹는 플라스틱으로 플라스틱 Coplin jar를 사용 하지 마십시오. 사용 하기 전에 압력솥에 Coplin 항아리를 소독.</li>
	<li>다음 4 개의 메 마른 유리 Coplin 항아리를 준비: 100% 에탄올, 80% 에탄올, 70%...

<ol>
	<li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+Change,+Human+Impacts,+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs.">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933 (2003).</li><li>Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+economic+damage+of+climate+change+on+global+coral+reefs.">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification.">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742 (2007).</li><li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development.">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).</li><li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss.">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).</li><li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora:+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa.">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).</li><li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family.">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li><li>Darby, I. A., Hewitson, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization protocols. , (2006).</li><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization. , (1987).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li><li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900 (2013).</li><li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation.">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).</li><li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li><li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+(Leucoraja+erinacea).">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).</li><li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata.">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).</li><li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubozoan+jellyfish:+an+Evo/Devo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems.">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li></ol>

이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 의료 및 진화 발달 연구8,9,10,,1217이전 작품에서 수정 되었습니다. 이 프로토콜 발굴 표시 된 RNA 안티 감각 프로브는 보존 되 고 파라핀에 포함 된 성인 산호에 제자리에 하이브리드의 뉘앙스에 집중 한다. 이 메서드는 파라핀 포함 된...

산호는 중요 한 생태계 빌더 바다와 인간의 건강1,,23에서 생물 다양성에 대 한 중요 한. 그들은 기후 변화 및 다른 anthropogenic 스트레스 위협을 받고 있다 그리고 많은 산호 종 비판적으로 멸종 위기에 놓인 것으로 간주 됩니다. 따라서, 세포 및 분자 도구 진단 스트레스 산호를 위한 중요 한 필요가 있다. 또한, 거기 약간 이해 된다 성인 산호 조직, 그리고이 유전자의 기능에 따라서 작은 이해 내 유전자가 표현 하는 곳에 대 한. 이 문제를 해결 하려면 우리는 현장에서 교 잡 (틱), 일반적으로 사용 되는 프로토콜 인간의 의학 및 진화 개발 생물학, 성인 산호의 파라핀 끼워 넣어진 조직 추출에서 사용 하기 위해 적응 시켰다. 이 기술은 열 스트레스에 노출 등 스트레스 이벤트 받은 성인 산호에 사용 될 때 가장 강력 하다. 그러나,이 기술은 다양 한 조직 및 산호의 삶의 단계에 사용할 수 있습니다 그리고만 열 스트레스 산호4,,67에 국한 되지 않습니다. 또한,이 기술은 사용할 수 cDNA 순서 정보는 조직 또는 모든 metazoan의 셀에 사용할 수 있습니다.
이 방법의 목적은 보존 및 파라핀에 포함 되었으며 슬라이드에 구분 성인 산호 조직 내의 RNA 프로브를 시각화 하는 것입니다. 이 방법은 성인 산호 조직 내에서 핵 산의 시각화에 대 한 허용 하는 강력한 진단 도구입니다. 처음에이 방법은 의료 진단에 대 한 개발 하 고 이후 발생 생물학 및 진화 개발 생물학8,,910분야에서 인기 있는 도구가 되고있다. 분의 비-모델 시스템, 게놈에서 특히 중요 한 방법 이기도 하 고 transcriptomic 시퀀스 데이터 사용할 수 있지만 공간 유전자 표현 패턴을 알 수 있습니다. 진단 작업 비 모델 시스템에 대 한이 기술은 강력 하다는 세포와 조직 관심사의 유전자를 표현 하 고 더 많은 타겟된 치료 접근8,,910, 이어질 수 있습니다 나타낼 수 있습니다 때문에 11,12. 마지막으로,이 기술은 질적 및 양적 유전자 표현 데이터11와 결합 하는 때 더 강력한입니다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 이미 digoxigenin (발굴) 설계 연구원에 게 관심이 될 것입니다-표시 된 RNA 프로브 (감각 및 antisense 프로브)는 이제 제자리에서 교 잡의 샘플을 프로브를 실행할 준비가 되었습니다. 이 메서드를 수행 하기 위해 파라핀 산호 직물의 2 개의 직렬 섹션 테스트 중인 각 프로브에 대 한 필요 합니다. 한 섹션 감지 프로브 및 센스 프로브에 대 한 다른 사용 됩니다. 감각 프로브를 나타내는 일반적인 바인딩 컨트롤 될 것입니다. 만약 얼룩이 지는 감각 프로브에서 관찰, 센스 프로브 관심의 RNA를 특정 하지 않습니다. 프로브는 모든 유전자 표현에 대 한 디자인할 수 있습니다. 이 프로토콜에 몇 가지 예는 사용 이전 산호에 열 스트레스 동안 표현할 것을 발견 했다: FBJ murine 다리 바이러스 oncogene 체 B (포-B), 활성 단백질 (AP1), 종양 괴 사 인자 수용 체 41 (TNFR 41)11. 그들의 처리는 많은 안전10때문에 방사성 프로브를 사용 하 여 분 발굴 표시 된 RNA 프로브를 사용 하 여 것이 좋습니다. 또한,이 기술은 매우 민감한 이며 다양 한 조직 및 열 스트레스 성인 산호13,14,,1516넘어 배아에서 수행할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s solution</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>70468 50 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-198-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide mailers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-17B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-198-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide white apex superior adhesive</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Promega</td>
			<td>22309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM Purple, 100 mL</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Wash and Block Buffer Set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585762001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11681451001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC Buffer 20X concentration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320102-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47670-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, AR (ACS), For Histological Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK866806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PAV6232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97005-252, 97005-254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples

산호는 바다의 전반적인 건강 뿐만 아니라 인간의 건강에 대 한 중요 한 중요 한 바다 무척 추 동물. 그러나, 상승 바다 온도 해양 산성화 등 인간의 영향으로 인해 산호는 점점 더 위협을 받고. 이러한 과제를 해결 하기 위해 세포 및 분자 생물학 산호의 건강 진단에 대 한 중요 한 것을 입증 했다. 인간의 의학에서 일반적으로 사용 되는 기법 중 일부를 수정 연구자의 능력을 치료 하 고 산호 저장에 크게 향상 시킬 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 현장에서 교 잡 인간의 의학 및 진화 개발 생물학에서 주로 사용 하는 프로토콜 스트레스 성인 산호에 사용 하기 위해 적응 되었습니다.
이 방법의 목적은 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분 된 성인 산호 조직에서 RNA 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 것입니다. 이 메서드는 파라핀 및 샘플의 재 수 화 작용의 제거, 샘플, 사전 교 잡 부 화, RNA 프로브의 교 잡 그리고 RNA 프로브의 시각화의 침투성을 보장 하기 위해 샘플의 전처리에 중점을 둡니다. 이 때 강력한 방법 비 모형 유기 체를 사용 하 여 특정 유전자가 표현 및 프로토콜은 다른 비 모형 유기 체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 그러나, 방법은 식 강도 시각화 단계 및 프로브 농도 동안 사용 시간에 따라 달라질 수 있기 때문에 그것은 주로 질적 제한 됩니다. 또한,이 프로토콜 최대 5 일 (와 많은 경우에, 더 이상) 사용 되는 프로브에 따라 걸릴 수 있습니다 인내심 필요 하다. 마지막으로, 일반적인 배경 얼룩은 일반적, 그러나이 한계를 극복할 수 있습니다.

이 프로토콜을 완료 한 후 관심의 RNA 프로브를 표현 하는 조직과 세포의 식별 달성 될 것 이다. 이 프로토콜에 대 한 대표적인 결과 AP 1, FosB, 및 TNFR41입니다. 이러한 결과 이전 트레일러 놀 즈 외 에 출판 11, 열 스트레스에 노출 된 성인 산호에 프로브는 RNA의 표시 공간 표현 합니다. 다른 얼룩 유형의 두 가지 예는 그림 1에 표?...

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In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

이 프로토콜의 목표 성인 산호 샘플 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분에 교 잡 현장에서 수행 하는 것입니다. 이것은 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 RNA 방지 감지 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 데 사용 하는 질적 방법입니다.

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Research

JoVE Journal

Environment

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

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A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

에 대한 비 침습적 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 여성 미국의 바닷가에 연결 성공 (의 결정<em&gt; Homarus의 americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

연구

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