Name: combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

وقد مولت البحوث مركز أوكلاهوما "النهوض بالعلوم" والتكنولوجيا تطبيق البحث برنامج المرحلة الثانية ع 132-053-2؛ ووزارة الزراعة تخصص محاصيل أوكلاهوما برنامج المنح البحثية. ونحن نشكر الدكتور هوانغ هونججين ومرفق الأساسية المعلوماتية الحيوية أوسو الذي كان مدعوما من المنح المقدمة من جبهة الخلاص الوطني (ايوس-0132534)، والمعاهد الوطنية للصحة (2P20RR016478-04، 1P20RR16478-02 و 5P20RR15564-03).

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وقد استخدمت في السنوات الأخيرة مجموعة متنوعة من أساليب لدراسة التنوع البيولوجي الفيروسات النباتية في البيئات الطبيعية التي تشمل إثراء لجسيمات شبيهة بالفيروس (عزام) أو فيروس محدد الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي2،3،44، 45،46 . وتتبع هذه الأساليب تحليل خ ع وبيوينفورماتيك. وكان الهدف من هذه الدراسة للبحث عن عامل المسببة لمرض شائع في النباتات مزروعة. أبلغ هذا المرض نتيجة لفيروس غير معروف يحتوي على جسيمات باسيليفورم غير المغلفة، والتي كانت فقط جزء bp 565 المستنسخة47. هذه المعلومات غير كافية للباحثين السابقة لتعيين الفيروس نظرياً إلى جنس بادنافيروس داخل الأسرة كوليموفيريداي. في حين أن التقارير السابقة عن الافتراض بأن المرض رقش القنا في الزنابق القنا هو نتيجة بادنافيروس واحد، باستخدام النهج metagenomics المبينة في هذه الدراسة، عقدنا العزم أن المرض سببه بادنافيروس مؤقت اثنين الأنواع24. وهكذا، قوة استخدام نهج ميتاجينومي لاكتشاف عامل المسببة للمرض أنه يمكننا الآن تحديد الحالات حيث قد يكون هناك سبب واحد أو أكثر.
لدينا نهج الجمع بين بيانات تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي دقيق ويوضح أيضا أن النتائج باستخدام نهجين أسفرت عن نتائج متسقة، وأكدت وجود اثنين من الفيروسات ذات الصلة. ونحن العاملين إجراء تعديل لعزل كوليموفيروسيس وأنتجت عينة التي تم إثراء للأحماض النووية المرتبطة الفيروس والتي كانت محمية داخل قفيصه الفيروس. وتم التعاقد مع مختبر خدمة الاضطلاع بتسلسل الحمض النووي. مفهوم أساسي لتسلسل حيثياته بوليميراز الدنا أن يدمج الفلورسنت المسمى النيوكليوتيدات في حبلا قالب الحمض النووي خلال دورات متتالية لتركيب الدنا. كونتيجس تجميعها اتباع طريق خ ع قدمت في سير عمل بيوينفورماتيك المنتجة لعدد قليل من كونتيجس التي تم تحديدها كفيروس كونتيجس. تم الحصول على تأكيد آخر للفيروسات اثنين جينومات10،24،،من4849،50 من خلال تحليل الحمض النووي الريبي seq البيانات المتحصل عليها من استعدادات الجيش الملكي النيبالي المنضب ريبو bioinformatic. وقدمت إحدى نتائج مثيرة للاهتمام أن تعلم أن السكان في تسلسل المستردة بتسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي توزيعات مماثلة من الأحماض النووية غير الفيروسية والفيروسية. لتسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، كانت < 0.5% من تسلسل الفيروس الأصلي. ضمن السكان فيروس متواليات 78-82% تنتمي إلى أسرة كوليموفيريداي. بمقارنة كونتيجس الفيروسات المجتمعة من تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، أكدنا أن الجينوم المجتمعون اثنين وقعت في مجموعات البيانات على حد سواء.
مصدر قلق لاستخدام تسلسل الحمض النووي فقط لتحديد جينومات الفيروس الجديد هو أن الجينوم بادنافيروس الحمض النووي دائري مفتوح. ونحن من يظن أن متواليات متداخلة ثغرات في الجينوم قد تشكل عقبات للجينوم للجمعية من كونتيجس. وكشفت دراسة أولية لنتائج تسلسل الحمض النووي هما جينوم الفيروس مماثلة. افترضنا أن الجينوم هذه تمثل أما التنوع الوراثي للأنواع التي لم تدرس، أو تمثل نوعين من أنواع المشترك إصابة نفس المصنع24. ولذلك، تمكين تحليل bioinformatic الجماعي لمجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من "خ ع الحمض النووي" والجيش الملكي النيبالي التسلسل، تأكيد وجود اثنين كامل طول الجينوم.
وهناك تقرير آخر الذي وضع طريقة بديلة لاستخراج عزام والأحماض النووية من مصنع هوموجيناتيس للدراسات الجينومية، استناداً إلى إجراءات لاسترداد الحمض النووي من فيروس تبرقش القنبيط (كامب؛ كوليموفيروس)3. وحدد هذا النهج رواية الجيش الملكي النيبالي وتسلسلات فيروس الحمض النووي في النباتات غير المزروعة. الخطوات المستمدة من إجراءات العزل كاوليموفيروس المستخدمة في هذه الدراسة لاكتشاف عامل المسببة لمرض نباتات المزروعة عكس خطوات اشتقاق لاستخراج عزام من النباتات المصابة بطبيعة الحال24. نجاح كلا الأسلوبين تعديل يشير إلى أن الإجراء الإطار للعزلة كوليموفيروس قد تكون نقطة انطلاق قيمة الدراسات الجينومية من الفيروسات النباتية بشكل عام.

أمراض النباتات الناشئة محرك الباحثين لتطوير أدوات جديدة للتعرف السببية الصحيحة (المحليون). تستند التقارير الأولية من الأمراض الفيروسية الجديدة أو المتكررة على الأعراض التي تحدث عادة مثل الفسيفساء والتشوهات ليف، الوريد مسح، والتقزم، ذبول، والآفات، نخر، أو أعراض أخرى. القياسية للإبلاغ عن ظهور فيروس جديد كما وكيل المسببة لمرض فصله من مسببات الأمراض تلويث أخرى، نشر في مناسبة المضيف، واستنساخ هذا المرض بتطعيم في منشآت صحية من الأنواع المضيف الأصلي. القيد في هذا النهج أن أجناس العديد من الفيروسات النباتية تعتمد على الحشرات أو ناقلات أخرى لانتقال العدوى إلى مضيف مناسب أو العودة إلى الأنواع المضيف الأصلي. في هذه الحالة، يمكن أن يطول البحث عن ناقلات مناسبة، قد تكون هناك صعوبات إقامة المستعمرات مختبر مكافحة ناقلات، وتبذل المزيد من الجهود اللازمة لوضع بروتوكول للبث التجريبي. وإذا تعذر تحقيق الشروط اللازمة للدراسات المختبرية نجاح الإرسال، ثم العمل يقصر عن المعيار للإبلاغ عن مرض فيروس جديد. للبحث عن الفيروسات التي تحدث في مضيفيهم الطبيعية في التتر منخفضة جداً، يجب تحديد الباحثين المضيفين البديلة للنشر للحفاظ على مخزونات المعدية كافية لإجراء البحوث. أنواع الفيروسات التي تصيب النباتات قليلة فقط وهذا يمكن أيضا عائقا لنمو الثقافات الأسهم1.
في السنوات الأخيرة، هي أكثر في كثير من الأحيان أن توظيف العلماء خ ع الفائق والنهج الجينومية للكشف عن تسلسل الفيروس الموجودة في البيئة، والتي قد تكون موجودة لا علاقة لها بمرض معروف، ولكن يمكن تعيينها إلى الأنواع التصنيفية وأجناس 2 , 3 , 4-هذه النهج لاكتشاف وتصنيف المواد الجينية في بيئة متميزة توفر طريقة لوصف تنوع الفيروسات بطبيعتها أو وجودها في نظام إيكولوجي معين ولكن لا تؤكد بالضرورة إلى وضع إطار لتحديد العوامل السببية لمرض الظاهر.
جنس بادنافيروس ينتمي إلى عائلة كوليموفيريداي باراريتروفيروسيس. هذه الفيروسات باسيليفورم في الشكل مع جينوم الحمض النووي حبلا مزدوجة دائرية من 7 إلى 9 كيلو بايت تقريبا. باراريتروفيروسيس جميع النسخ المتماثل من خلال وسيط الجيش الملكي النيبالي. باراريتروفيروسيس قائمة بوصفها ابيسوميس، وتكرار مستقلة من النباتات الصبغية الحمض النووي5،6. دراسات ميدانية للفيروس السكان تشير إلى أن هؤلاء السكان فيروس وراثيا المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، كشفت معلومات تم الحصول عليها عبر مجموعة من جينوم النبات بتسلسل الإنتاجية العالية أمثلة عديدة من أجزاء الجينوم بادنافيروس إدراجها بأحداث التكامل غير شرعي في جينومات النباتات. هذه التسلسلات بادنافيروس الذاتية لا ترتبط بالضرورة بالعدوى7،،من89،،من1011. وفي وقت لاحق، استخدام خ ع لتحديد بادنافيروسيس الجديد كعامل سببية المرض يعقدها يتدنى تنوع الجينوم ابيسومال، فضلا عن حدوث تسلسل الذاتية12،13.
أن هناك لا أحد أنابيب الأمثل لاكتشاف الجينوم باراريتروفيروس الرواية، فهناك نهجان مشتركة لتحديد هذه الفيروسات كالعوامل المسببة للمرض. أسلوب واحد هو إثراء لتسلسل الحمض النووي الريبي صغيرة من الأوراق المصابة وثم تجميع هذه التسلسلات إعادة تشكيل الفيروس genome(s)14،15،،من1617. وثمة نهج آخر هو التضخيم دائرة المتداول (RCA) لتضخيم جينومات الفيروس الحمض النووي الدائري18. يتوقف نجاح RCA سن الورقة وعيار الفيروس في الأنسجة المختارة. المنتجات RCA تخضع لقيود الهضم والمستنسخة في والبلازميدات لمباشرة تسلسل19،،من2021.
فيروس رقش أصفر القنا هو بادنافيروس (كايمف) ويوصف بأنه قضية المسببة للمرض رقش أصفر في القنا، على الرغم من أن جزء bp 565 الجينوم فقط تم عزل سابقا من المصابين كاناس22. حددت دراسة معاصرة كايمف في بوربوراتا خولنجان (الزنجبيل المزهرة؛ كايمفاب)23. وكان الهدف من هذه الدراسة لاسترداد تسلسل الجينوم بادنافيروس كاملة من الزنابق القنا المصابة. نحن وصف بروتوكول لتنقية الفيروس من النبات الملوثات، وثم عزل الحمض النووي الفيروسي من هذا الإعداد، وإعداد مكتبة الحمض النووي لاستخدامها في فئة الخدمات العامة الوطنية. وهذا النهج يلغي الحاجة للخطوات الوسيطة التضخيم الجزيئية. ونحن أيضا عزل مرناً من النباتات المصابة خ ع ما يليها الجيش الملكي النيبالي، الذي يتضمن تسلسل الحمض النووي الريبي أجريت باستخدام كل إعداد الحمض النووي. تم العثور على كونتيجس المجمعة تتصل أصنوفة بادنافيروس في كل مجموعات البيانات باستخدام المركز الوطني للتكنولوجيا الحيوية والمعلومات (نكبي) أداة البحث الأساسية المحلية المحاذاة للأحماض النووية (بلاستن). وقد حددنا الجينوم بادنافيروس اثنين الأنواع24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:368px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich St. Louis MO</td>
			<td style="width:133px;">S5976</td>
			<td style="width:440px;">Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">S0751</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:368px;">Na2SO3</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher Waltham, MA</td>
			<td style="width:133px;">28790</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">urea</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">PB169-212</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">X-100</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:168px;">VWR Radnor, PA</td>
			<td>21910-107</td>
			<td>Filter homogenate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP152-5</td>
			<td>Pellet resuspension&#38; DNA resuspension buffers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">MgCl2</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum, Gardena, CA</td>
			<td style="width:133px;">M1035</td>
			<td>Pellet resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum</td>
			<td style="width:133px;">E1045</td>
			<td>Stops enzyme reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">25530</td>
			<td>DNA resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">phenol:chloroform:isoamylalcohol&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">P2069</td>
			<td>Dissolve virion proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DNAse I</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M6101</td>
			<td>Degrade cellular DNA from extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">6B-100</td>
			<td>Virus DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Laboratory blender</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>58984-030</td>
			<td>Grind leaf samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">Floor model ultracentrifuge&#160; &#38;Ti70 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter, Irving TX&#160;</td>
			<td style="width:133px;">A94471</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:368px;">Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">369001</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">75876-022</td>
			<td>Mixing urea into samples overnight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Rubber policeman</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">470104-462</td>
			<td>Dissolve virus pellet</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">&#160;2100 bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:168px;">Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td>
			<td style="width:133px;">G2939BA</td>
			<td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td>
			<td></td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td>
			<td></td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">ND-2000</td>
			<td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plant total RNA isolation kit</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">STRN50-1KT</td>
			<td>Isolate RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>10128-514</td>
			<td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">RNA concentrator spin column</td>
			<td style="width:168px;">Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td style="width:133px;">R1013</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">rRNA removal kit</td>
			<td style="width:168px;">Illumina, San Diego, CA</td>
			<td style="width:133px;">MRZPL116</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">12321D</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">&#160;RNA&#160; enrichment system</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td style="width:133px;">7277300001</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">16500100</td>
			<td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">15585011</td>
			<td>Agarose gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pGEM-T +JM109 competent cells</td>
			<td style="width:168px;">Promega, Madison, WI</td>
			<td style="width:133px;">A3610</td>
			<td>Clone genome fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pFU Taq polymerase</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M7741</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dNTPs</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">U1511</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">PCR oligonucleotides</td>
			<td style="width:168px;">IDT, Coralvill, IA</td>
			<td style="width:133px;">Custom order</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Miniprep DNA purification kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A1330</td>
			<td style="width:440px;">Plasmid DNA purification prior to sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A9281</td>
			<td style="width:440px;">Prepare PCR products for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">pDRAW32 software</td>
			<td style="width:168px;">ACAClone</td>
			<td></td>
			<td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">MEGA6.0 software</td>
			<td style="width:168px;">MEGA</td>
			<td></td>
			<td>Molecular evolutionary genetics analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Primer 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Simgene.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT&#8482; RiboGreen&#8482; RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td>Fluorometric determination of RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior&#8482; pyrosequencing System</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5526337001</td>
			<td>Sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996520001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996490001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996538001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Oil &#38; Breaking Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996511001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996554001</td>
			<td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996619001</td>
			<td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IKA Turrax mixer</td>
			<td></td>
			<td>3646000</td>
			<td>Special mixer used with Turrax Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td>
			<td></td>
			<td>20003213</td>
			<td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Nebulizers Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5160570001</td>
			<td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior emPCR Bead Counter</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 635 001</td>
			<td>Library bead counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Bead Deposition Device</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 473 001</td>
			<td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Counterweight &#38; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 889 103 001</td>
			<td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Software</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 643 001</td>
			<td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Run Processor v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS De Novo Assembler v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Reference Mapper v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

يتم استخدام هذا النهج ميتاجينومي للتعرف على الفيروسات النباتية مع التعميم الحمض النووي الجينوم وتلك النصوص. ويصعب غالباً فيروسات الحمض النووي النباتية التي تحدث في انخفاض التتر في المضيفة لهم، أو لا يمكن تلقيح ميكانيكيا لمضيف آخر للنشر إلى تحقيق من عيار أكبر من المواد المعدية. الأوراق المصابة هي أرض الواقع في منطقة عازلة خفيفة مع الرقم الهيدروجيني الأمثل والأيونية تكوين الموصى بها لتنقية معظم الفيروسات التراجعية في الفقرة باسيليفورم. يتم استخدام اليوريا إلى تفريق إدراج الهيئات التي اعتراض فيريونس وحل المكونات الخلوية. الطرد المركزي التفاضلي توفر مزيدا من فصل فيريونس عن الملوثات النبات. ثم يزيل العلاج بروتيناز ك كابسيدس. ثم ركزت الحمض النووي الفيروسي واستخدامها للجيل التالي التسلسل (خ ع). وتستخدم البيانات خ ع لتجميع كونتيجس التي تقدم إلى نكبي-بلاستن لتحديد مجموعة فرعية تسلسل الفيروس في مجموعة البيانات الذي تم إنشاؤه. في خط مواز، الجيش الملكي النيبالي معزول من يترك المصاب باستخدام أسلوب استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى عمود قياسي. ثم يجري استنفاد الريبوسوم لإثراء لمجموعة فرعية نصوص مرناً والفيروسات. تجميع تسلسل المستمدة من الحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) قدمت إلى نكبي-بلاستن لتحديد مجموعة فرعية تسلسل الفيروس في dataset هذه. وفي دراستنا، حددنا الجينوم بادنافيروس كامل طول يتصل اثنان في مجموعات البيانات اثنين. هذا الأسلوب المفضل لنهج مشترك آخر الذي يستخرج السكان الكلي لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة إعادة تشكيل الفيروس مصنع تسلسل الجينوم. هذا الفيروس يستعيد خط أنابيب الجينومية الأخيرة المتعلقة بتسلسل أن يتم إدراج العناصر الرجعية تدوين في جينوم النبات. ويقترن هذا بفحوصات الكيمياء الحيوية أو الجزيئية زيادة تمييز العوامل المعدية بنشاط. النهج الموثقة في هذه الدراسة، يسترد متواليات الممثل تكرار الفيروسات التي يرجح أن تشير إلى الإصابة بعدوى الفيروس النشط.

وقدمت هذا الأسلوب تنقية الفيروسات المعدلة إثراء للفيروسات المعينة مفيدة لتحديد نوعين من أنواع الفيروسات خ ع والمعلوماتية الحيوية. بعد أن تم طرد في هوموجيناتي في س 40,000 ز ح 2.5، كان هناك من بيليه خضراء في الجزء السفلي من الأنبوب وبيليه أبيض على الطول. كان حراكه بيليه الأخضر إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد وكان حراكه بيليه الأبيض في أنابيب ميكروسينتريفوجي اثنين. بكر أجرى استخدام القياسية PCR كايمف التشخيص الإشعال، وتم الكشف عن المنتجات في سولوبيليزيد بيليه الأبيض ولا بيليه الخضراء (الشكل 1أ). تم فحص عينة من إعداد النفط الخام مجهر إلكتروني ولاحظنا جسيمات باسيليفورم قياس 124-133 نيوتن متر في الطول (الشكل 1ب). هذه حدود طول مشروط توقع معظم بادنافيروسيس. الحمض النووي المستخرج من الكريات البيضاء والخضراء وحراكه بشكل منفصل. في الشكل 1ج، نحن تحميل 5 ميليلتر من الحمض النووي المستخرج من الأخضر وعينه بيليه الأبيض (1.6 ميكروغرام للحمض النووي للكسر الخضراء) و 3.1 ميكروغرام للحمض النووي للكسر الأبيض إلى 0.8% [اغروس] هلام التفريد وتحليل الحمض النووي عقب اثيديوم بروميد تلوين. كسر الأخضر الواردة الوزن الجزيئي المنخفض الحمض النووي حين الكسر الأبيض أنتجت شريطين من ارتفاع الوزن الجزيئي الحمض النووي، فضلا عن انخفاض الوزن الجزيئي الحمض النووي (الشكل 1ج). تم تشغيل هلام المعروضة في الشكل 1ج لمدة 40 دقيقة في 100 الخامس والتشويه في حارة 3 تشير إلى أنه ينبغي خفض الجهد هلام لإنتاج شرائط أكثر وضوحاً. تشير هذه البيانات إلى أن بيليه الأبيض وقد أثري فيريونس. وكان تركيز الحمض النووي (0.6 ميكروغرام/مل) المستخرجة من العينة البيضاء منخفضة، ولكنها كافية لفئة الخدمات العامة الوطنية، الأمر الذي يتطلب حدا أدنى 10 نانوغرام من الحمض النووي المضي قدما. واستخدمت مجزأة السلطات الوطنية المعينة ﻹعداد مكتبة خ ع.
في موازاة ذلك، تم استخراج الحمض النووي الريبي من النباتات المصابة القنا (الشكل 1د) للحمض النووي الريبي الفائق-ما يليها أجرى سير عمل قياسية لإعداد مكتبة، خ ع، خلق كونتيجس، وتحديد تسلسل الجينوم الفيروسي (الشكل 1ﻫ). وقورنت النتائج الناتج من استخدام الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي كالمواد الأولية.
حصلنا على 188,626 يقرأ الحمض الخام من خ ع استخدام الحمض النووي المعزولة من إعداد الفيروس الخام. ما يلي: تم تجميعها في كونتيجس 13,269، وتم استخدام بلاستن للبحث عن مجموعة البيانات نكبي من متواليات النوكليوتيدات (استخدام تاكسيد فيريدبلانتاي: 33090 و "فيروس تاكسيد": 10239 كالكائنات الحية الحد) (الشكل 1ﻫ). كشفت النتائج نكبي-بلاستن أن 93% كونتيجس دي نوفو تجميع تسلسل الخلوية، 22% لم تكن معروفة، و 0.3% فيروس كونتيجس (الشكل 2أ). أغلبية كونتيجس المصنفة على أنها حددت تسلسل الخلوية المتقدرية أو بلاستيدات الخضراء الحمض النووي. داخل dataset من الفيروسات كونتيجس، 32% كونتيجس الفيروس كانت تتصل بأعضاء كوليموفيريداي (التي لم تكن متواليات بادنافيروس) وكانت تتصل 58% من هذه بادنافيروس. من كونتيجس الفيروسات، 29 في المائة كانت مشابهة جداً (ه < 1 × 10-30) للجينات V17 ORF3 عزل كايمف (EF189148.1) وعزل فيروس باسيليفورم قصب السكر "د باتافيا"، الجينوم الكامل (FJ439817.1)، وإكمال الفيروسات CA الانتصارات الموز (الجينوم KJ013511). ضمن هذه الفئة من السكان، وكانت هناك كونتيجس طويل يشبه اثنين كامل طول الجينوم.
الفائق الجيش الملكي النيبالي-seq أنتجت ما يلي تسلسل الفردية تنظيفها 153,488 مع متوسط قراءة طول < 500 هناك الجمعية Contig تخفيض هذا إلى كونتيجس 8,243. هذه قدمت إلى نكبي-بلاستن (استخدام تاكسيد فيريدبلانتاي: 33090 و "فيروس تاكسيد": 10239 كالكائنات الحية الحد) والنواتج التي وضعها 76% من كونتيجس في فئة من النباتات الخلوية متواليات، 23% لم تكن معروفة، وصنفت 0.1% كفيروس كونتيجس ( الشكل 2 ب)-تقرر دراسة أوثق لسكان السكان 0.1% من كونتيجس الفيروس أن 68% من هؤلاء تم تعيينها إلى كاوليموفيريداي (الشكل 2ب). وحددت ثلاثة كونتيجس كبيرة داخل هذه الفئة من السكان مع تشابه عالية (ه < 1 × 10-30) إلى كايمف V17 ORF3 عزل الجينات (EF189148.1)، عزل فيروس باسيليفورم قصب السكر "د باتافيا" والجينوم الكامل (FJ439817.1) والانتصارات الموز الفيروسات CA الجينوم الكامل (KJ013511). دراسة كونتيجس الثلاثة، انضممنا اثنين من هذه لإنتاج جينوم فيروس كامل طول يدوياً.
أننا بالمقارنة مع كونتيجس طول جينوم الفيروس التي تنتجها تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي سقالة متبادل تأكيد وجود جينوم الفيروس كامل طول اثنين. جينوم الفيروس كامل طول واحد 6,966 bp سمي مبدئياً القنا رقش أصفر المرتبطة الفيروس 1 (كيماف-1) (الشكل 3أ). أن الجينوم الثاني كان 7,385 بي بي والبديل من كايمف إصابة بوربوراتا خولنجان (كايمف-Ap01) (الشكل 3أ).
وأخيراً، استخدمت كبسولة تفجير PCR التي صممت لاستنساخ ~ 1,000 bp جزء من كل الفيروسات، خلطات الكشف عن الجينوم سواء في عدد سكانها 227 القنا النباتات تمثل تسعة أصناف تجارية. في كثير من الحالات الفردية النباتات كانوا مصابين بالفيروسات على حد سواء. نحن نقدم مثالاً لكشف RT-PCR كايماف-1 وكايمف-Ap01 في النباتات 12. ثلاثة من هذه الإيجابية فقط كايمف-Ap01 وتسعة كانت إيجابية بالنسبة لكل الفيروسات (الشكل 3ب).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> الشكل 1 : فيروس الحمض النووي الاستعدادات وسير العمل خ ع. (أ) [اغروس] (1.0%) جل التفريد 565 الشظايا PCR bp الجينوم كايمف. تم الكشف عن اثنين من المنتجات PCR في عينات من بيليه الأبيض (الممرات 1، 2) ولكن ليس في العينة بيليه الخضراء (لين 3). مراقبة إيجابية (+) يمثل منتج PCR يضخم من النباتات المصابة الحمض النووي التي تم عزلها باستخدام أسلوب تلقائية التي تنطوي على جزيئات السليلوز باراماجنيتيك القياسية. L لين يحتوي على سلم الحمض النووي يستخدم كمعيار لقياس حجم الخطية شرائط الحمض النووي في الممرات عينة. (ب) مثال للجسيمات فيروس شوهدت مجهر إلكتروني في بيليه الأبيض تعافي بتجزئة النفط الخام من يترك القنا المصابة. (ج) [اغروس] (0.8 في المائة) جل التفريد الحمض النووي المستردة من الأخضر (لين 1) والكريات البيضاء (لين 2) أن إيجابية اختبار ببكر في لوحة أ تحديد النقاط الأحمر والأصفر بجوار حارة 2 شريطين الحمض النووي الوزن الجزيئي العالية التي تحدث في جزء صغير أبيض. (د) [اغروس] (1%) هلام التفريد من مجموع الحمض النووي الريبي المستردة بتنقية الحمض النووي الريبي يستند إلى العمود. L لين يحتوي على سلم الحمض النووي يستخدم كمعيار لقياس حجم العصابات الخطي في حارات عينة. لين 1-6 يحتوي على الحمض النووي الريبي معزول من يترك القنا المصابة التي تم تجميعها إلى عينة واحدة لاستنفاد ريبو والجيش الملكي النيبالي-ما يليها (ﻫ) أنابيب التخطيطي العزلة الحمض النووي وإعداد مكتبة، وتسلسلها، والجمعية contig وجينوم الفيروس الاكتشاف. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> الشكل 2 : المخططات الكرونا تصور فئات تصنيفية كونتيجس. (أ) التخطيط على الأيسر يظهر بوفرة وتوزيع كونتيجس التصنيفية تجميعها من إعداد الفيروس الخام. ويصور المخطط الصحيح نسب كونتيجس الفيروسات المرتبطة بالأسرة كوليموفيريداي وجنس بادنافيروس ، وثلاثة من الأنواع ذات صلة وثيقة. (ب) الفريق على اليسار يظهر وفرة كونتيجس المستمدة من تسلسل الحمض النووي الريبي استناداً إلى توزيعها التقسيمي. على اليمين هو الرسم البياني يصور وفرة كونتيجس ضمن سكان كونتيجس الفيروسات المرتبطة بالأسرة كوليموفيريداي وجنس بادنافيروس وثلاثة من الأنواع ذات الصلة عن كثب. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> الشكل 3 . وصف الجينوم كايماف-1 وكايمف-Ap01- (أ) تمثيل البيانية رقش القنا الأصفر إقران الفيروس 1 (كيماف) و فيروس رقش أصفر القنا مشابهة للجينوم معزولة عن بوربوراتا خولنجان (كايمف-Ap01)- مواقف النوكليوتيدات 1-10 يتم تحديدها كبداية للجينوم، ويحتوي على الحمض الريبي النووي النقالالتقى موقع anticodon نموذجي من معظم بادنافيروس الجينوم. مواقف التوقف والبدء بترجمة الإطار القراءة المفتوحة (ORF) 1 و 2 متجاورة. هذه البروتينات قد معروف مهامها. ORF3 بوليبروتين التي تحتوي على إصبع الزنك (زنف)، البروتياز (للمحترفين) وعكس المنتسخة (RT) والمجالات "رناسي ح". هو حفظ تسلسل إشارة poly(A) 3 ' لجينوم الفيروس على حد سواء. (ب) تحليل RT-PCR أجريت باستخدام الحمض النووي الريبي معزولة عن أوراق المصابين بالفيروس والإشعال التي تكشف عن كايماف وكايمف-Ap01. في نفس السكان من النباتات 12، ثلاثة كانوا مصابين كايمف-Ap01 فقط، بينما الباقي كانوا مصابين كيماف وكايمف-Ap01. (+) يشير إلى مراقبة إيجابية و (-) تشير إلى المراقبة السلبية. وهذا الرقم استنساخ/المعدلة من ويجاياسيكارا et al. 24 مع الإذن. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

وهنا يقدم نهجاً جديداً للتعرف على الفيروسات النباتية مع مورثات الحمض النووي المزدوج-حبلا. نحن نستخدم الطرق القياسية لاستخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الأوراق المصابة وإجراء تسلسل الجيل القادم. أدوات Bioinformatic تجميع تسلسل في كونتيجس، وتحديد كونتيجس يمثلون جينوم الفيروس وتعيين الجينوم للمجموعات التصنيفية.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام &#39;جينوم فيروس واحد&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

أدوات جديدة لتوسيع الخلايا التائية التنظيمية من الأفراد HIV-1-المصابة

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

المظهرية والتحليل الوظيفي من المنشط خلايا تنظيم تي المعزولة من الفئران المصابة بفيروس المزمنة الليمفاوي المشيمي

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...