Name: combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Forskning blev finansieret af Oklahoma Center for avancement of Science og Technology anvendes Research Program fase II AR 132-053-2; og af Oklahoma Institut for landbrug speciale afgrøder forskning Grant Program. Vi takker Dr. HongJin Hwang og OSU Bioinformatik Core facilitet, som blev støttet af tilskud fra NSF (EOS-0132534) og NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 og 5P20RR15564-03).

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

I de seneste år har været ansat en række metoder til at studere plante virus biodiversitet i naturlige miljøer, som omfatter berigende for virus-lignende partikler (VLP) eller virus bestemt RNA eller DNA2,3,44, 45,46 . Disse metoder er efterfulgt af NGS og bioinformatic analyse. Målet med denne undersøgelse var at finde den kausale agens af en almindelig sygdom i en dyrket plante. Sygdommen blev rapporteret at være resultatet af en ukendt virus, som har ikke-kappeklædte bacilliform partikler, og som kun en 565 bp fragment er blevet klonet47. Disse oplysninger var tilstrækkelig for forudgående forskere hypotetisk tildele virus til slægten Badnavirus inden for familien Caulimoviridae. Mens forudgående rapporter en hypotese at canna mottle sygdom i canna liljer var resultatet af en enkelt badnavirus, brug af metagenomics tilgang skitseret i denne undersøgelse, vi har besluttet at sygdommen skyldtes to foreløbig badnavirus arter24. Styrken ved hjælp af en metagenome tilgang til at opdage den kausale agent for en sygdom er således, at vi nu kan identificere situationer hvor der kan være mere end én årsag.
Vores tilgang, der kombinerer DNA og RNA sequencing data er grundig og viser også, at resultaterne ved hjælp af to tilgange viste konsekvente resultater og bekræftet tilstedeværelsen af to beslægtet vira. Vi ansat en modificeret procedure for isolering af caulimoviruses og produceret en stikprøve, blev beriget for virus forbundet nukleinsyrer og der var beskyttet i virus kapsid. En service laboratorium var ansat til at udføre DNA-sekventering. Væsentlige konceptet for de novo sekventering er, at DNA polymerase indeholder fluorescerende mærket nukleotider i en DNA-skabelon strand under sekventiel cyklusser af DNA syntese. Contigs samlet efterfulgt af NGS blev indsendt til en bioinformatic arbejdsgang producerer et par contigs, der blev identificeret som virus contigs. Yderligere bekræftelse af to virus genomer10,24,48,49,50 er tilvejebragt ved bioinformatic analyse af RNA-seq data indhentet fra ribo-forarmet RNA præparater. Et interessant resultat var at lære, at befolkningerne i sekvenser inddrives af DNA og RNA sekventering fremlægges lignende fordelinger af ikke-virale og virale nukleinsyrer. Til DNA og RNA sekvensering var < 0.5% af sekvenser af virus oprindelse. Inden for befolkningen i virus sekvenser 78-82% tilhørte familien Caulimoviridae. Ved at sammenligne den forsamlede virus contigs fra DNA og RNA sekventering, bekræftede vi, at de to samlet genomer opstod i begge datasæt.
En bekymring for at bruge kun DNA-sekvensering til at identificere de nye virus genomer er badnavirus genom en åben cirkulære DNA. Vi anede, at sekvenser overlappende afbrydelser i genomet kan medføre hindringer for genom forsamling fra contigs. Indledende undersøgelse af DNA-sekventering resultater afslørede to lignende virus genomer. Vi den hypotese, at disse genomer enten repræsenteret genetiske mangfoldighed af arter, der ikke er blevet undersøgt, eller repræsenterede to arter Co inficere den samme plante24. Derfor, den kollektive bioinformatic analyse af datasæt fremstillet ved NGS DNA og RNA sekventering, aktiveret bekræftelse af tilstedeværelsen af to fuld længde genomer.
Der er en anden betænkning, som udviklede en alternativ metode til at udtrække VLP og nukleinsyrer fra planten homogeniseret for metagenomic undersøgelser, baseret på procedurer til at inddrive DNA fra blomkålsmosaikvirus (CaMV; en caulimovirus)3. Denne tilgang identificeret roman RNA og DNA virus sekvenser i ikke-dyrkede planter. De skridt, afledt af caulimovirus isolation procedure, der anvendes i denne undersøgelse for at opdage den kausale agent for en sygdom af dyrkede planter er i modsætning til trin stammer til at udtrække VLP fra naturligt inficerede planter24. Succes for både ændrede metoder antyder, at proceduren for caulimovirus isolation kan være et værdifuldt udgangspunkt for metagenomic undersøgelser af plant vira i almindelighed.

Nye plantesygdomme drive forskere til at udvikle nye værktøjer til at identificere den korrekte kausale stof(fer). Første rapporter af nye eller tilbagevendende virussygdomme er baseret på almindeligt forekommende symptomer som mosaik og misdannelser af blade, vene clearing, dværgvækst, visnen, læsioner, nekrose eller andre symptomer. Standard for at rapportere en ny virus, som den kausale agent for en sygdom er at adskille det fra andre forurenende patogener, udbrede det i egnet vært og reproducere sygdommen ved at vaccinere i sunde planter af den oprindelige vært arter. Begrænsning i denne tilgang er, at mange slægter af plant vira afhænge af et insekt eller andre vektorer for transmission til en passende vært eller tilbage til den oprindelige vært arter. I dette tilfælde, Søg efter den relevante vektor kan forlænges, kan der være problemer med at etablere laboratorium kolonier af vektoren, og yderligere bestræbelser er nødvendige for at udarbejde en protokol for eksperimenterende transmission. Hvis betingelserne for vellykket laboratorium transmission undersøgelser ikke kan opnås, så ligger arbejdet under standarden for at rapportere en ny virus-sygdom. For vira, der opstår i deres naturlige værter på meget lav titers, skal forskerne identificere alternative værter for formering til at opretholde tilstrækkelig smitsomme lagre for at udføre forskning. For virus arter, der inficerer kun nogle få anlæg kan det også være en hindring for voksende bestand kulturer1.
I de seneste år, forskere mere ofte beskæftiger høj overførselshastighed NGS og metagenomic metoder til at afdække virus sekvenser, der er til stede i miljøet, som kan findes ikke-forretningsmæssigt forbundne til en kendt sygdom, men kan tildeles taksonomiske arter og slægter 2 , 3 , 4. sådan tilgange til opdagelsen og kategorisering af genetisk materiale i et særskilt miljø giver en måde at beskrive virus mangfoldighed i naturen eller deres tilstedeværelse i en bestemt økosystem, men ikke nødvendigvis bekræfte, at en ramme for at definere kausale agenter for en tilsyneladende sygdom.
Badnavirus slægten tilhører familien Caulimoviridae af pararetroviruses. Disse vira er bacilliform i figuren med cirkulær dobbeltstrenget DNA genomer af ca 7-9 kb. Alle pararetroviruses replikere gennem mellemprodukt RNA. Pararetroviruses findes som episomes og replikere uafhængigt af plante kromosomale DNA5,6. Feltstudier af virus populationer viser, at disse virus populationer er genetisk komplekse. Derudover oplysninger indhentet på tværs af en række plante genomer af høj overførselshastighed sekventering har afsløret talrige eksempler på badnavirus genom fragmenter indsat af uægte integration begivenheder i anlægget genomer. Disse endogene badnavirus sekvenser er ikke nødvendigvis forbundet med infektion7,8,9,10,11. Efterfølgende brug af NGS at identificere nye badnaviruses som den kausale agens af sygdom kompliceres af delpopulation mangfoldighed af episomal genomer samt forekomsten af endogene sekvenser12,13.
Mens der er ikke en optimal pipeline for opdagelsen af roman pararetrovirus genomer, er der to fælles tilgange til at identificere disse vira som kausale agenter for sygdom. Én metode er at berige for små RNA sekvenser fra inficerede blade og derefter samle disse sekvenser for at rekonstruere virus genome(s)14,15,16,17. En anden fremgangsmåde er den rullende cirkel forstærkning (RCA) til at forstærke cirkulære DNA virus genomer18. RCA succes afhænger af alder af bladet og virus titer i den valgte væv. RCA produkter er underkastet begrænsning fordøjelse og klonet i plasmids til direkte sekventering19,20,21.
Canna gule mottle virus (CaYMV) er en badnavirus og er beskrevet som den ætiologiske årsag til gul mottle sygdom i canna, selv om kun en 565 bp fragment af genomet har været tidligere isoleret fra inficerede cannas22. En moderne undersøgelse identificeret CaYMV i Alpinia purpurata (blomstrende ingefær; CaYMV-Ap)23. Målet med denne undersøgelse var at inddrive komplet badnavirus genom sekvenser fra inficerede canna liljer. Vi beskriver en protokol til rensning af virus fra planten forurenende stoffer, og derefter isolere viral DNA fra denne forberedelse, og forberede en DNA bibliotek til brug i NGS. Denne fremgangsmåde fjerner behovet for mellemliggende molekylære forstærkning trin. Vi også isolere mRNA fra inficerede planter for RNA-FF. NGS, som omfatter RNA-seq blev udført ved hjælp af hver nukleinsyre forberedelse. Samlet contigs blev anset for at vedrører Badnavirus systematisk enhed i begge datasæt ved hjælp af National Center for bioteknologi og Information (NCBI) grundlæggende lokale justering søgeværktøj til nukleinsyrer (BLASTn). Vi identificerede genomer af to badnavirus arter24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:368px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich St. Louis MO</td>
			<td style="width:133px;">S5976</td>
			<td style="width:440px;">Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">S0751</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:368px;">Na2SO3</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher Waltham, MA</td>
			<td style="width:133px;">28790</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">urea</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">PB169-212</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">X-100</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:168px;">VWR Radnor, PA</td>
			<td>21910-107</td>
			<td>Filter homogenate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP152-5</td>
			<td>Pellet resuspension&#38; DNA resuspension buffers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">MgCl2</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum, Gardena, CA</td>
			<td style="width:133px;">M1035</td>
			<td>Pellet resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum</td>
			<td style="width:133px;">E1045</td>
			<td>Stops enzyme reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">25530</td>
			<td>DNA resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">phenol:chloroform:isoamylalcohol&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">P2069</td>
			<td>Dissolve virion proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DNAse I</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M6101</td>
			<td>Degrade cellular DNA from extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">6B-100</td>
			<td>Virus DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Laboratory blender</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>58984-030</td>
			<td>Grind leaf samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">Floor model ultracentrifuge&#160; &#38;Ti70 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter, Irving TX&#160;</td>
			<td style="width:133px;">A94471</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:368px;">Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">369001</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">75876-022</td>
			<td>Mixing urea into samples overnight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Rubber policeman</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">470104-462</td>
			<td>Dissolve virus pellet</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">&#160;2100 bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:168px;">Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td>
			<td style="width:133px;">G2939BA</td>
			<td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td>
			<td></td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td>
			<td></td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">ND-2000</td>
			<td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plant total RNA isolation kit</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">STRN50-1KT</td>
			<td>Isolate RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>10128-514</td>
			<td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">RNA concentrator spin column</td>
			<td style="width:168px;">Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td style="width:133px;">R1013</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">rRNA removal kit</td>
			<td style="width:168px;">Illumina, San Diego, CA</td>
			<td style="width:133px;">MRZPL116</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">12321D</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">&#160;RNA&#160; enrichment system</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td style="width:133px;">7277300001</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">16500100</td>
			<td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">15585011</td>
			<td>Agarose gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pGEM-T +JM109 competent cells</td>
			<td style="width:168px;">Promega, Madison, WI</td>
			<td style="width:133px;">A3610</td>
			<td>Clone genome fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pFU Taq polymerase</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M7741</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dNTPs</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">U1511</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">PCR oligonucleotides</td>
			<td style="width:168px;">IDT, Coralvill, IA</td>
			<td style="width:133px;">Custom order</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Miniprep DNA purification kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A1330</td>
			<td style="width:440px;">Plasmid DNA purification prior to sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A9281</td>
			<td style="width:440px;">Prepare PCR products for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">pDRAW32 software</td>
			<td style="width:168px;">ACAClone</td>
			<td></td>
			<td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">MEGA6.0 software</td>
			<td style="width:168px;">MEGA</td>
			<td></td>
			<td>Molecular evolutionary genetics analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Primer 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Simgene.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT&#8482; RiboGreen&#8482; RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td>Fluorometric determination of RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior&#8482; pyrosequencing System</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5526337001</td>
			<td>Sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996520001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996490001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996538001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Oil &#38; Breaking Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996511001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996554001</td>
			<td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996619001</td>
			<td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IKA Turrax mixer</td>
			<td></td>
			<td>3646000</td>
			<td>Special mixer used with Turrax Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td>
			<td></td>
			<td>20003213</td>
			<td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Nebulizers Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5160570001</td>
			<td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior emPCR Bead Counter</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 635 001</td>
			<td>Library bead counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Bead Deposition Device</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 473 001</td>
			<td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Counterweight &#38; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 889 103 001</td>
			<td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Software</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 643 001</td>
			<td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Run Processor v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS De Novo Assembler v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Reference Mapper v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

Denne metagenome fremgangsmåde bruges til at identificere plant vira med cirkulært DNA genomer og deres udskrifter. Ofte plante DNA virus at forekomme i lav titers i deres vært eller kan ikke være mekanisk podes til en anden vært er vanskelige at formere for at opnå en større titer af smitsomme materiale. Inficerede blade er jorden i en mild buffer med optimale pH og ioniske sammensætning anbefales til rensning af de fleste bacilliform Para retrovira. Urea bruges til at bryde op optagelse organer, at fælde virioner og til at opløse cellulære komponenter. Differential centrifugering giver yderligere adskillelse af virioner fra planten forurenende stoffer. Derefter fjerner proteinase K behandling capsids. Derefter er det virale DNA koncentreret og anvendes til next generation sequencing (NGS). NGS data bruges til at samle contigs, der er indsendt til NCBI-BLASTn til at identificere et undersæt af virus sekvenser i den genererede datasæt. I en parallel pipeline er RNA isoleret fra inficerede blade ved hjælp af en standard kolonne-baserede RNA ekstraktion metode. Derefter udføres ribosomet udtynding til at berige for en delmængde af mRNA og virus udskrifter. Samlet sekvenser afledt af RNA sekventering (RNA-FF.) blev forelagt NCBI-BLASTn til at identificere et undersæt af virus sekvenser i dette dataset. I vores undersøgelse identificeret vi to relaterede fuld længde badnavirus genomer i de to datasæt. Denne metode er den foretrukne til en anden fælles tilgang, der udtrækker den samlede befolkning i små RNA sekvenser for at rekonstruere plante virus genomiske sekvenser. Denne sidstnævnte metagenomic pipeline genopretter virus relateret sekvenser der indsættes retro-transskribere elementer i anlægget genom. Dette er koblet til biokemiske eller Molekylær assays til yderligere skelne de aktivt smitstoffer. Metoden er dokumenteret i denne undersøgelse, genopretter sekvenser repræsentant for replikering af vira, der sandsynligvis angiver active virusinfektion.

Denne modificerede virus rensning metode forudsat en berigelse af virus DNAs nyttig til at identificere to virus arter af NGS og bioinformatik. Efter at homogenatet var centrifugeres ved 40.000 x g i 2,5 h, var der en grøn pellet i bunden af røret og en hvid pellet langs længden. Den grønne pellet var genopslemmes ind i et microcentrifuge rør og de hvide pellet var genopslemmes i to microcentrifuge rør. PCR blev udført ved hjælp af standard CaYMV PCR diagnostiske primere, og produkter blev opdaget i den solubilized hvid pellet og ikke den grønne pellet (fig. 1A). En prøve af den rå forberedelse blev undersøgt af transmissions Elektron Mikroskopi og vi observerede bacilliform partikler måling 124-133 nm længde (figur 1B). Det er inden for den forventede modal længden af de fleste badnaviruses. DNA blev udvundet fra de hvide og grønne pellets og genopslemmes separat. I figur 1C, vi læsset 5 µL DNA ekstraheret fra grønne og hvide pellet prøve (1,6 µg DNA for den grønne del) og 3,1 µg DNA for den hvide fraktion til 0,8% Agarosen gel elektroforese og analyseret DNA efter ethidiumbromid farvning. Den grønne brøkdel indeholdt lavmolekylære DNA, mens den hvide brøkdel produceret to bands af højere molekylvægt DNA, samt den lavere molekylvægt DNA (figur 1C). Gelen præsenteret i figur 1C blev kørt i 40 min. ved 100 V og smøre i lane 3 tyder på, at gel spændingen bør sænkes til at producere klarere bands. Disse data tyder på at den hvide pellet blev beriget til virioner. DNA (0,6 µg/mL) koncentration udvindes fra den hvide prøve var lav, men tilstrækkelig til NGS, som kræver et minimum af 10 ng af DNA til at fortsætte. Fragmenterede DNAs blev brugt til at forberede NGS et bibliotek.
Sideløbende blev RNA udvundet fra inficerede canna planter (fig. 1D) for høj overførselshastighed RNA-FF. En standard arbejdsprocessen blev gennemført for biblioteket forberedelse, NGS, oprettelse af contigs, og at identificere virale genom sekvenser (figur 1E). Outputresultater fra DNA og RNA som råvarer blev sammenlignet.
Vi opnåede 188,626 rå DNA læsninger af NGS ved hjælp af DNA isoleret fra rå virus forberedelse. Læser blev samlet i 13,269 contigs og BLASTn blev brugt til at søge NCBI datasæt af nukleotidsekvenser (ved hjælp af Viridplantae TaxID: 33090 og Virus TaxID: 10239 som de begrænsende organismer) (figur 1E). NCBI-BLASTn resultater viste, at 93% af de novo samlet contigs var cellulære sekvenser, 22% var ukendt, og 0,3% var virus contigs (figur 2A). Fleste af contigs kategoriseret som cellulære sekvenser blev identificeret som mitokondrier eller grønkorn DNA. I datasættet for virus contigs, 32% af virus contigs var relateret til medlemmer af Caulimoviridae (som ikke var Badnavirus sekvenser) og 58% af disse var relateret til Badnavirus. Af virus contigs, 29% var meget lignende (e < 1 x 10-30) til CaYMV isoleres V17 ORF3 gen (EF189148.1), sukkerrør bacilliform virus isolere Batavia D, komplet genom (FJ439817.1), og banan streak CA virus komplet genom ( KJ013511). Inden for denne befolkning var der lange contigs, der lignede to fuld længde genomer.
Høj overførselshastighed RNA-seq produceret 153,488 renset enkelte sekvens læser med et gennemsnit læse længde af < 500 bp. Contig forsamling reduceret dette til 8,243 contigs. Disse blev forelagt NCBI-BLASTn (ved hjælp af Viridplantae TaxID: 33090 og Virus TaxID: 10239 som de begrænsende organismer) og udgange placeret 76% af contigs i en kategori af plante cellulære sekvenser, 23% var ukendt, og 0,1% blev kategoriseret som virus () contigs Figur 2 B). nærmere undersøgelse af befolkningen i befolkningens 0,1% af virus contigs bestemmes, at 68% af disse var knyttet til Caulimoviridae (figur 2B). Tre store contigs inden for denne befolkning blev identificeret med høj lighed (e < 1 X 10-30) til CaYMV isoleres V17 ORF3 gen (EF189148.1), sukkerrør bacilliform virus isolere Batavia D, komplet genom (FJ439817.1) og Banana streak CA virus komplet genom (KJ013511). Behandlingen af de tre contigs, kom vi manuelt to af disse til at producere en fuld længde virusgenom.
Vi sammenlignede virus genomet længde contigs produceret af DNA og RNA sekventering som en gensidig stillads til at bekræfte tilstedeværelsen af to fuld længde virus genomer. En fuld længde virus genomet i 6,966 bp var tentativt kaldet Canna gule mottle associeret virus 1 (CaYMAV-1) (fig. 3A). Den anden genom blev 7,385 bp og en variant af CaYMV inficerer Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (fig. 3A).
Endelig, PCR-primere, som var designet til klon ~ 1000 bp fragment af hver virus, blev brugt til varierende opdager både genomer i en befolkning på 227 canna planter der repræsenterer ni kommercielle sorter. I mange tilfælde var enkelte planter smittet med både virus. Vi leverer et eksempel af RT-PCR påvisning af CaYMAV-1 og CaYMV-Ap01 i de 12 planter. Tre af disse var positiv kun for CaYMV-Ap01 og ni var positive for både virus (fig. 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Figur 1 : Virus nukleinsyre præparater og NGS arbejdsproces. (A) Agarosen (1,0%) gel elektroforese af 565 bp PCR fragmenter af CaYMV genomer. To PCR produkter blev fundet i prøver forberedt fra den hvide pellet (baner 1, 2), men ikke i den grønne pellet prøve (lane 3). Positiv kontrol (+) repræsenterer en PCR produkt amplificeret fra inficerede plante DNA, der blev isoleret ved hjælp af en automatiseret metode med standard Paramagnetiske cellulose partikler. Lane L indeholder DNA ladder anvendes som en standard for måling af størrelsen af lineære DNA bands i stikprøven baner. (B) eksempel på virus partikel set af transmissions Elektron Mikroskopi i den hvide pellet inddrives af rå fraktionering af inficerede canna blade. (C) Agarosen (0,8%) gel elektroforese DNA inddrives fra green (lane 1) og hvid (lane 2) pellets at testet positiv ved PCR i panelet A. De røde og gule prikker ved siden af lane 2 identificere to høj molekylvægt DNA bands, der opstår i den hvide fraktion. (D) Agarosen (1%) gel elektroforese af total RNA inddrives af kolonne-baserede RNA oprensning. Lane L indeholder DNA ladder anvendes som en standard for måling af størrelsen af lineære bands i stikprøven baner. Lane 1-6 indeholder RNA isoleret fra inficerede canna blade der var samlet på en enkelt prøve for ribo-udtynding og RNA-FF. (E) skematisk pipeline af nukleinsyre isolering, bibliotek forberedelse, sekventering, contig forsamling og virusgenom Discovery. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Figur 2 : Krone diagrammer visualisere de taksonomiske kategorier af contigs. (A) i diagrammet på den venstre viser overflod og taksonomisk fordeling af contigs samlet fra rå virus forberedelse. Den rigtige diagramtype skildrer proportioner af virus contigs forbundet med Caulimoviridae familien, Badnavirus slægt og tre nært beslægtede arter. (B) i panelet til venstre viser overfloden af contigs stammer fra RNA-seq baseret på deres taksonomisk fordeling. Til højre er grafen skildrer overfloden af contigs inden for befolkningen i virus contigs forbundet med Caulimoviridae familien, Badnavirus slægt og tre nært beslægtede arter. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Figur 3 . Karakterisering af CaYMAV-1 og CaYMV-Ap01 genomer. (A) skematisk repræsentation af Canna gule mottle knytte virus 1 (CaYMAV) og Canna gule mottle virus svarende til genomet isoleret fra Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nukleotid positioner 1-10 er identificeret som i starten af genomet og indeholder en tRNAmødte anticodon websted typisk for de fleste badnavirus genomer. Stop og start positioner for oversættelse af åben behandling ramme (ORF) 1 og 2 er tilstødende. Disse proteiner har ukendte funktioner. ORF3 er en polyprotein indeholdende zink finger (ZnF), protease (Pro), reverse transkriptase (RT) og RNAse H domæner. En 3' poly(A) signal sekvens bevares for både virus genomer. (B) RT-PCR analyse blev udført ved hjælp af RNA isoleret fra virus inficerede blade og primere, der registrerer CaYMAV og CaYMV-Ap01. I den samme befolkning på 12 planter, var tre inficeret med CaYMV-Ap01 kun, mens de resterende var smittet med både CaYMAV og CaYMV-Ap01. (+) angiver positiv kontrol og (-) angiver negativ kontrol. Denne figur er gengivet/ændret fra Wijayasekara et al. 24 med tilladelsen. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Ved at kombinere analysen af DNA i en rå Virion ekstraktion med analysen af RNA fra inficerede blade til at opdage nye Virus genomer

Her vil vi præsentere en ny tilgang for at identificere plant vira med dobbelt-strenget DNA genomer. Vi bruger standard metoder til at udtrække DNA og RNA fra inficerede blade og udføre næste generation sequencing. Bioinformatic værktøjer samle sekvenser til contigs, identificere contigs repræsenterer virus genomer og tildele taksonomiske grupper genomer.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolering og genom analyse af enkelte Virioner benytter &quot;enkelt virus Genomics &#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrensning af Influenzavirus ribonukleoprotein komplekser fra kromatin af inficerede celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolering og analyse af Brain-sekvestrerede Leukocytter fra<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-inficerede mus

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nye værktøjer til at udvide regulatoriske T celler fra HIV-1-inficerede personer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Hurtig analyse af kromosomafvigelser i Mouse B lymfocytter ved PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro analyse af MyD88-medieret Cellular immunrespons til West Nile Virus mutantstamme Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fænotypisk og funktionel analyse af Aktiverede Regulatory T celler isoleret fra kronisk lymfatisk choriomeningitisvirus-inficerede mus

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Redning og karakterisering af rekombinant virus fra en ny verden Zika Virus infektiøs klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...