Name: combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00
Duration: 8 min 56 s
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Forschung wurde durch Oklahoma Zentrum für die Förderung von Wissenschaft und Technik angewandte Forschung Programm Phase II AR 132-053-2 finanziert; und von der Oklahoma Abteilung der Landwirtschaft Sonderkulturen Research Grant Program. Wir danken Dr. HongJin Hwang und der OSU Bioinformatik Core Facility, die durch Zuschüsse von NSF (EOS-0132534) und NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 und 5P20RR15564-03) unterstützt wurde.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Methoden eingesetzt, um pflanzliche Virus Biodiversität in natürlichen Umgebungen zu studieren, darunter bereichernd für virusähnliche Partikel (VLP) oder Virus spezifische RNA oder DNA-2,3,44, 45,46 . Diese Methoden werden von NGS und bioinformatische Analyse gefolgt. Das Ziel dieser Studie war den kausalen Agent eine häufige Erkrankung in eine kultivierte Pflanze zu finden. Die Krankheit wurde berichtet, das Ergebnis von einem unbekannten Virus, die hat unbehüllte Bacilliform Teilchen, und nur ein 565 bp Fragment wurde für die geklonte47. Diese Information war ausreichend für vorherige Forscher hypothetisch das Virus der Gattung Badnavirus innerhalb der Familie Caulimoviridaezuweisen. Während vorherige Berichte vermutet, dass Canna Mottle Krankheit in Canna Lilien das Ergebnis einer einzigen Badnavirus war, mit dem Metagenomik Ansatz in dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Krankheit durch zwei vorläufige Badnavirus Arten24verursacht wurde. So ist die Stärke mit einem Metagenom Ansatz, um den kausalen Agent einer Krankheit zu entdecken, dass wir jetzt Situationen zu erkennen wo es mehr als eine Ursache sein kann.
Unser Ansatz, die Kombination von DNA und RNA Sequenzierungsdaten ist gründlich und zeigt auch, dass die Ergebnisse mit zwei Ansätzen konsistente Ergebnisse gezeitigt und das Vorhandensein von zwei verwandten Viren bestätigte. Wir beschäftigt eine modifizierte Verfahren zur Isolierung von Caulimoviruses und produziert eine Stichprobe, wurde associated Virus-Nukleinsäuren bereichert und, innerhalb der Virus-Kapsid geschützt waren. Ein Servicelabor erhielt den Auftrag zur Durchführung der DNA-Sequenzierung. Das wesentliche Konzept für die de Novo Sequenzierung ist, dass die DNA-Polymerase die fluoreszierenden beschriftet Nukleotide in einem DNA-Strang Vorlage beim sequenziellen Zyklen der DNA-Synthese enthält. Die Contigs montiert gefolgt von NGS wurden in einer bioinformatischen Workflow produzieren ein paar Contigs, die als Virus Contigs identifiziert wurden eingereicht. Eine weitere Bestätigung von zwei Viren Genome10,24,48,49,50 wurde durch bioinformatische Analyse der RNA-Seq Daten aus Ribo-abgereicherte RNA Vorbereitungen erhalten. Ein interessantes Ergebnis war zu erfahren, dass die Bevölkerungen der Sequenzen von DNA und RNA Sequenzierung wiederhergestellt sofern ähnliche Verteilungen von nicht-viralen und viralen Nukleinsäuren. Für die Sequenzierung von DNA und RNA, < 0,5 % der Sequenzen waren Virus Ursprungs. Innerhalb der Bevölkerung des Virus Sequenzen 78-82 % der Familie Caulimoviridaegehörte. Durch den Vergleich der montierten Virus Contigs von DNA und RNA Sequenzierung, haben wir bestätigt, dass die zwei montierten Genome in beiden Datensätzen aufgetreten.
Ein Anliegen der Verwendung nur DNA-Sequenzierung, um das neue Virus-Genom zu identifizieren ist, dass das Badnavirus Genom einer offenen kreisförmige DNA. Wir vermutet, dass überlappende Diskontinuitäten im Genom Sequenzen Hindernisse für die Genom-Montage von Contigs darstellen könnte. Erstuntersuchung der DNA-Sequenzierung Ergebnisse ergab zwei ähnliche Viren Genome. Wir die Hypothese auf, dass diese Genome entweder genetische Vielfalt einer Spezies vertreten, die nicht untersucht worden ist, oder vertretene zwei Arten Co infizieren die gleiche Pflanze24. Daher aktiviert die kollektive bioinformatische Analyse von Datensätzen durch die NGS DNA und RNA Sequenzierung, die Bestätigung der Anwesenheit von zwei Genome in voller Länge.
Gibt es einen weiteren Bericht, der eine alternative Methode für die Extraktion VLP und Nukleinsäuren aus Anlage Homogenates für metagenomischen Untersuchungen, basierend auf Verfahren, die DNA von Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV; eine Caulimovirus)3erholen entwickelt. Dieser Ansatz identifiziert Roman RNA und DNA-Virus Sequenzen in nicht kultivierten Pflanzen. Die Schritte abgeleitet aus dem Caulimovirus-Isolierung-Verfahren in dieser Studie verwendet, um den kausalen Agent auf eine Erkrankung der Kulturpflanzen zu entdecken sind im Gegensatz zu den Schritten zum Extrahieren VLP natürlich infizierten Pflanzen24abgeleitet. Der Erfolg der beiden veränderte Methoden legt nahe, dass das Rahmen-Verfahren zur Caulimovirus Isolierung ein wertvoller Ausgangspunkt für metagenomischen Untersuchungen von Pflanzenviren im Allgemeinen sein kann.

Aufstrebenden Pflanzenkrankheiten fahren Forscher entwickeln neue Werkzeuge, um die richtige kausale Agents zu identifizieren. Erste Berichte über neue oder wiederkehrende Virosen basieren auf häufig auftretende Symptome wie Mosaik und Fehlbildungen des Blatt, Vene, clearing, Kleinwuchs, welken, Läsionen, Nekrose oder andere Symptome. Der Standard für die Meldung eines neuen Virus, wie der kausale Agent für eine Krankheit ist, es von anderen kontaminierende Erreger zu trennen in geeigneten Host zu verbreiten und vermehren sich die Krankheit durch impfen in gesunde Pflanzen von der ursprünglichen Wirtsarten. Die Einschränkung bei diesem Ansatz ist, dass ein Insekt oder andere Vektoren für die Übertragung zu einem geeigneten Wirt oder zurück zu den ursprünglichen Wirtsarten viele Gattungen von Pflanzenviren abhängen. In diesem Fall die Suche nach der geeigneten Vektor kann verlängert werden, möglicherweise gibt es Schwierigkeiten, Labor Kolonien des Vektors zu etablieren und weitere Anstrengungen sind erforderlich, um ein Protokoll für die experimentelle Übertragung zu entwickeln. Wenn die Voraussetzungen für die erfolgreiche Übertragung Laborstudien nicht erreicht werden können, fällt die Arbeit hinter den Standard für die Meldung einer neuen Viruskrankheit. Für Viren, die in ihrer natürlichen Wirte auf sehr niedrige Titer auftreten, müssen Forscher alternative Gastgeber für die Vermehrung um ausreichende infektiöse Vorräte für die Durchführung von Recherchen erhalten identifizieren. Dies kann auch ein Hindernis für den Anbau von Stammkulturen1Virus-Arten, die nur ein paar Pflanzen infizieren.
In den letzten Jahren beschäftigen Wissenschaftler immer häufiger Hochdurchsatz-NGS und metagenomische Ansätze Virus Sequenzen aufzudecken, die in der Umgebung vorhanden, die möglicherweise nicht im Zusammenhang mit einer bekannten Krankheit vorhanden sind, aber taxonomische Arten und Gattungen zugeordnet werden kann 2 , 3 , 4. solche Ansätze zur Entdeckung und Kategorisierung des genetischen Materials in einer deutlichen Umgebung bieten die Möglichkeit, Virus-Vielfalt in der Natur oder ihre Präsenz in einem bestimmten Ökosystem beschreiben bestätigt jedoch nicht unbedingt zu einem Rahmen für die Festlegung kausale Agenten für eine offensichtliche Krankheit.
Gattung Badnavirus gehört zur Familie Caulimoviridae von Pararetroviruses. Diese Viren sind Bacilliform in Form mit kreisförmigen Doppelstrang DNA Genome von etwa 7 bis 9 kb. Alle Pararetroviruses werden durch ein RNA-Zwischenprodukt repliziert. Pararetroviruses gibt es als Episomes und unabhängig von der Pflanze chromosomale DNA-5,6zu replizieren. Feldstudien über Virus Populationen zeigen, dass diese Virus-Populationen genetisch komplexer sind. Darüber hinaus Informationen über eine Reihe von pflanzengenomen von Hochdurchsatz-Sequenzierung haben aufgedeckt, zahlreiche Beispiele von Badnavirus Genom Fragmente pflanzengenomen durch illegitime Integrationsveranstaltungen eingefügt. Diese endogene Badnavirus-Sequenzen sind nicht unbedingt in Zusammenhang mit Infektionen7,8,9,10,11. Anschließend wird die Verwendung von NGS, neue Badnaviruses als kausale Agent der Krankheit zu identifizieren durch die Teilgesamtheit Vielfalt episomal Genome sowie das Auftreten von endogenen Sequenzen12,13erschwert.
Zwar gibt es nicht eine optimale Pipeline für die Entdeckung von Roman Pararetrovirus Genomen, gibt es zwei Möglichkeiten, diese Viren als kausale Agenten für die Krankheit zu identifizieren. Eine Methode ist die Bereicherung für kleine RNA-Sequenzen aus den infizierten Blättern und dann montieren Sie diese Sequenzen um das Virus Genome(s)14,15,16,17wieder zusammenzusetzen. Ein weiterer Ansatz ist die rollenden Kreis Verstärkung (RCA), kreisförmige DNA-Virus Genome18zu verstärken. Der Erfolg von RCA hängt das Alter des Blattes und der Virustiter im ausgewählten Gewebe. Die RCA-Produkte sind Beschränkungsverdauung unterzogen und in Plasmide für direkte Sequenzierung19,20,21kloniert.
Canna gelbe Mottle virus (CaYMV) ist ein Badnavirus und wird beschrieben als die ätiologische Ursache der gelben Mottle Krankheit in Canna, obwohl nur ein 565 bp Fragment des Genoms von infizierten Cannas22zuvor isoliert wurde. Eine zeitgenössische Studie identifiziert CaYMV in Alpinia Purpurata (Blüte Ingwer; CaYMV-Ap)23. Das Ziel dieser Studie war, komplette Badnavirus Genomsequenzen von infizierten Canna Lilien zu erholen. Wir beschreiben ein Protokoll zum Virus von pflanzlichen Verunreinigungen zu reinigen, und dann isolieren virale DNA aus dieses Präparat und bereiten eine DNA-Bibliothek für den Einsatz in NGS. Dadurch entfällt die Notwendigkeit zwischen-Molekulare Verstärkung Schritte. Wir isolieren auch mRNA von infizierten Pflanzen für RNA-FF NGS, die RNA-Seq umfasst mit jeden Nukleinsäure-Vorbereitung durchgeführt wurde. Montierten Contigs befanden sich auf dem Badnavirus Taxon in beiden Datensätzen über das nationale Zentrum für Biotechnologie und Information (NCBI) grundlegende lokale Suche Ausrichtwerkzeug für Nukleinsäuren (BLASTn) beziehen. Wir ermittelten die Genome von zwei Badnavirus Arten24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:368px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich St. Louis MO</td>
			<td style="width:133px;">S5976</td>
			<td style="width:440px;">Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">S0751</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:368px;">Na2SO3</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher Waltham, MA</td>
			<td style="width:133px;">28790</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">urea</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">PB169-212</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">X-100</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:168px;">VWR Radnor, PA</td>
			<td>21910-107</td>
			<td>Filter homogenate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP152-5</td>
			<td>Pellet resuspension&#38; DNA resuspension buffers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">MgCl2</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum, Gardena, CA</td>
			<td style="width:133px;">M1035</td>
			<td>Pellet resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum</td>
			<td style="width:133px;">E1045</td>
			<td>Stops enzyme reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">25530</td>
			<td>DNA resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">phenol:chloroform:isoamylalcohol&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">P2069</td>
			<td>Dissolve virion proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DNAse I</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M6101</td>
			<td>Degrade cellular DNA from extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">6B-100</td>
			<td>Virus DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Laboratory blender</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>58984-030</td>
			<td>Grind leaf samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">Floor model ultracentrifuge&#160; &#38;Ti70 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter, Irving TX&#160;</td>
			<td style="width:133px;">A94471</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:368px;">Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">369001</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">75876-022</td>
			<td>Mixing urea into samples overnight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Rubber policeman</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">470104-462</td>
			<td>Dissolve virus pellet</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">&#160;2100 bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:168px;">Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td>
			<td style="width:133px;">G2939BA</td>
			<td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td>
			<td></td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td>
			<td></td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">ND-2000</td>
			<td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plant total RNA isolation kit</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">STRN50-1KT</td>
			<td>Isolate RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>10128-514</td>
			<td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">RNA concentrator spin column</td>
			<td style="width:168px;">Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td style="width:133px;">R1013</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">rRNA removal kit</td>
			<td style="width:168px;">Illumina, San Diego, CA</td>
			<td style="width:133px;">MRZPL116</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">12321D</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">&#160;RNA&#160; enrichment system</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td style="width:133px;">7277300001</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">16500100</td>
			<td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">15585011</td>
			<td>Agarose gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pGEM-T +JM109 competent cells</td>
			<td style="width:168px;">Promega, Madison, WI</td>
			<td style="width:133px;">A3610</td>
			<td>Clone genome fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pFU Taq polymerase</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M7741</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dNTPs</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">U1511</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">PCR oligonucleotides</td>
			<td style="width:168px;">IDT, Coralvill, IA</td>
			<td style="width:133px;">Custom order</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Miniprep DNA purification kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A1330</td>
			<td style="width:440px;">Plasmid DNA purification prior to sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A9281</td>
			<td style="width:440px;">Prepare PCR products for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">pDRAW32 software</td>
			<td style="width:168px;">ACAClone</td>
			<td></td>
			<td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">MEGA6.0 software</td>
			<td style="width:168px;">MEGA</td>
			<td></td>
			<td>Molecular evolutionary genetics analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Primer 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Simgene.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT&#8482; RiboGreen&#8482; RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td>Fluorometric determination of RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior&#8482; pyrosequencing System</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5526337001</td>
			<td>Sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996520001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996490001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996538001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Oil &#38; Breaking Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996511001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996554001</td>
			<td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996619001</td>
			<td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IKA Turrax mixer</td>
			<td></td>
			<td>3646000</td>
			<td>Special mixer used with Turrax Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td>
			<td></td>
			<td>20003213</td>
			<td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Nebulizers Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5160570001</td>
			<td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior emPCR Bead Counter</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 635 001</td>
			<td>Library bead counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Bead Deposition Device</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 473 001</td>
			<td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Counterweight &#38; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 889 103 001</td>
			<td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Software</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 643 001</td>
			<td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Run Processor v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS De Novo Assembler v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Reference Mapper v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

Dieser Ansatz Metagenom wird verwendet, um Pflanzenviren mit kreisförmigen DNA Genome und ihre Zeugnisse zu identifizieren. Oft Pflanze DNA-Viren, die in niedrige Titer in ihrem Wirt auftreten oder können nicht mechanisch geimpft werden, auf einen anderen Host sind schwer zu propagieren, um eine höhere Titer von infektiösem Material zu erreichen. Infizierte Blätter sind Boden in einem milden Puffer mit optimalen pH-Wert und Ionischen Zusammensetzung empfohlen für die meisten Bacilliform Para Retroviren zu reinigen. Harnstoff wird verwendet, Einschlusskörperchen aufzubrechen, die Virionen Falle und zelluläre Komponenten auflösen. Differentielle Zentrifugation liefert weitere Trennung der Virionen von pflanzlichen Verunreinigungen. Proteinase K Behandlung entfernt dann die Capsids. Dann wird die virale DNA konzentriert und für Next Generation Sequencing (NGS) verwendet. Die NGS-Daten dienen zum montieren Contigs die eingereicht werden, NCBI-BLASTn, eine Teilmenge der Virus-Sequenzen in das generierte Dataset zu identifizieren. In einer parallelen Pipeline ist RNA isoliert aus den infizierten Blättern mit einer standard spaltenbasierten RNA Extraktionsmethode. Dann wird Ribosom Erschöpfung durchgeführt, um für eine Teilmenge von mRNA und Virus Transkripte zu bereichern. Montierte Sequenzen von RNA Sequenzierung (RNA-Seq) abgeleitet abgegeben NCBI-BLASTn, eine Teilmenge der Virus-Sequenzen in diesem Dataset zu identifizieren. In unserer Studie haben wir zwei verwandte in voller Länge Badnavirus Genome in den beiden Datensätzen identifiziert. Diese Methode wird bevorzugt, eine andere Möglichkeit die Gesamtbevölkerung von kleinen RNA-Sequenzen zur Pflanze Virus Genomsequenzen rekonstruieren extrahiert. Dieses letztere metagenomische Pipeline erholt sich Virus im Zusammenhang mit Sequenzen, die sind Retro-Transkription Elemente eingefügt in das pflanzliche Genom. Damit verbunden ist, Biochemische und molekulare Tests weiter aktiv Krankheitserreger zu erkennen. Der Ansatz in der vorliegenden Studie dokumentiert erholt sich Sequenzen Vertreter der Replikation von Viren, die wahrscheinlich aktive Virus-Infektion hinweisen.

Diese veränderten Virus Reinigung Methode bereitgestellt, eine Bereicherung des Virus DNA nützlich zur Identifikation von zwei Virus-Arten von NGS und Bioinformatik. Nachdem das Homogenat bei 40.000 x g für 2,5 h zentrifugiert wurde, gab es einen grünen Pellet am Boden des Röhrchens und einem weißen Pellet entlang der Länge. Das grüne Pellet wurde in einem Microcentrifuge Schlauch Nukleinsäuretablette und das weißen Pellet wurde in zwei Mikrozentrifugenröhrchen Nukleinsäuretablette. PCR wurde mit standard CaYMV PCR-Diagnostik-Primern durchgeführt, und Produkte wurden in die solubilized weißen Pellet und nicht die grüne Kugel (Abb. 1A) nachgewiesen. Ein Beispiel für die groben Vorbereitung war von Transmissions-Elektronenmikroskopie untersucht und wir beobachteten Bacilliform Partikel Messen 124-133 nm Länge (Abbildung 1B). Dies ist innerhalb der prognostizierten modal Länge von den meisten Badnaviruses. DNA wurde extrahiert aus der weißen und grünen Pellets und Nukleinsäuretablette getrennt. In Abbildung 1Cluden wir 5 µL DNA extrahiert von den grünen und weißen Pellet Probe (1,6 µg DNA für die grüne Fraktion) und 3,1 µg DNA für die weißen Bruchteil um 0,8 % Agarose gel Elektrophorese und analysierten die DNA nach Interkalation Bromid Färbung. Die grüne Fraktion enthaltenen niedermolekularen DNA, während der weiße Anteil zwei Bänder aus höherem Molekulargewicht DNA sowie das geringere Molekulargewicht DNA (Abbildung 1C) produziert. Das Gel, dargestellt in Abbildung 1C für 40 min. bei 100 V ausgeführt wurde und der Abstrich auf Spur 3 legt nahe, dass die Gel Spannung gesenkt werden sollte, um klarere Bands produzieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass die weiße Kugel für Virionen angereichert wurde. Die DNA (0,6 µg/mL) Konzentration der weißen Probe entnommen war gering, aber ausreichend für NGS, die erfordert ein Minimum von 10 ng DNA um fortzufahren. Fragmentierte DNA wurden verwendet, um eine Bibliothek auf NGS vorzubereiten.
Parallel wurde RNA aus infizierten Canna Pflanzen (Abbildung 1D) für Hochdurchsatz-RNA-FF gewonnen. Ein standard Workflow erfolgte für Bibliothek Vorbereitung, NGS, Erstellen von Contigs und virale Genomsequenzen (Abbildung 1E) zu identifizieren. Die Ausgangsresultate hindern, DNA und RNA als Ausgangsstoffe wurden verglichen.
Wir erhalten 188.626 rohe DNA liest von NGS mit DNA isoliert von der rohen Virus Vorbereitung. Liest in 13.269 Contigs versammelt waren und BLASTn wurde verwendet, um das NCBI-Dataset von Nukleotidsequenzen suchen (mit Viridplantae TaxID: 33090 und Virus USt: 10239 als begrenzenden Organismen) (Abbildung 1E). Die NCBI-BLASTn-Ergebnisse zeigten, dass 93 % der de Novo montiert Contigs zellulären Sequenzen waren, 22 % unbekannt waren, und 0,3 % Virus Contigs (Abb. 2A). Die Mehrheit der Contigs kategorisiert, wie zelluläre Sequenzen wie Mitochondrien identifiziert wurden oder Chloroplast DNA. Innerhalb des Datasets der Virus Contigs, 32 % der Virus Contigs wurden im Zusammenhang mit Mitgliedern des Caulimoviridae (die nicht Badnavirus Sequenzen waren) und 58 % davon wurden im Zusammenhang mit Badnavirus. Von dem Virus Contigs 29 % waren sehr ähnlich (e < 1 x 10-30), CaYMV isolieren V17 ORF3-gen (EF189148.1), Zuckerrohr-Bacilliform-Virus zu isolieren Batavia D, vollständige Genom (FJ439817.1), und Banane Streifen CA Virus komplette Genom ( KJ013511). Innerhalb dieser Population gab es lange Contigs, die zwei volle Länge Genome ähnelte.
Hochdurchsatz-RNA-Seq produziert 153.488 gereinigte einzelne Sequenz liest mit einer durchschnittlichen Länge von < 500 BP. Contig Montage lesen reduziert dies auf 8.243 Contigs. Diese wurden eingereicht, NCBI-BLASTn (mit Viridplantae TaxID: 33090 und Virus USt: 10239 als begrenzenden Organismen) und die Ausgänge platziert 76 % der Contigs in einer Kategorie Pflanze zellulären Sequenzen, 23 % waren unbekannt, und 0,1 % wurden als Virus Contigs (kategorisiert Abbildung 2 ( B). näherer Betrachtung der Bevölkerung die 0,1 % der Bevölkerung des Virus Contigs festgestellt, dass 68 % davon Caulimoviridae (Abbildung 2B) zugeordnet wurden. Drei große Contigs innerhalb dieser Population wurden mit hohen Ähnlichkeit identifiziert (e < 1 X 10-30), CaYMV isolieren V17 ORF3-gen (EF189148.1) Zuckerrohr Bacilliform-Virus zu isolieren, Batavia D, vollständige Genom (FJ439817.1) und Banane-Streifen CA-Virus vollständige Genom (KJ013511). Prüfung der drei Contigs, traten wir manuell zwei davon, eine Full-Length Virusgenom zu produzieren.
Wir verglichen die Virus-Genom Länge Contigs produziert von DNA und RNA Sequenzierung als gegenseitige Gerüst, das Vorhandensein von zwei Full-Length Virus Genome zu bestätigen. Eine Full-Length Virusgenom von 6.966 bp wurde vorläufig benannt Canna gelbe Mottle verbundenen Virus 1 (CaYMAV-1)(Abbildung 3). Das zweite Genom wurde 7.385 bp und eine Variante des CaYMV infizieren Alpinia Purpurata (CaYMV-Ap01)(Abbildung 3).
Zu guter Letzt PCR Zündkapseln, die entworfen wurden, um Klon ~ 1.000 bp Fragment von jedem Virus dienten differentiell beide Genome in einer Population von 227 Canna-Pflanzen für neun kommerziellen Sorten erkennen. In vielen Fällen wurden einzelne Pflanzen mit beiden Viren infiziert. Wir bieten ein Beispiel für RT-PCR-Nachweis von CaYMAV-1 und CaYMV-Ap01 in 12 Werken. Drei davon waren positiv nur für CaYMV-Ap01 und neun positiv für beide Viren (Abbildung 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Abbildung 1 : Virus-Nukleinsäure-Vorbereitungen und NGS Workflow. (A) Agarose (1,0 %) gel-Elektrophorese von 565 bp-PCR-Fragmente von CaYMV Genomen. Zwei PCR-Produkte wurden in Proben aus der weißen Pellet (Bahnen 1, 2) vorbereitet, aber nicht in die grüne Pellet-Probe (Bahn 3) nachgewiesen. Positivkontrolle (+) stellt ein PCR-Produkt von infizierten Pflanzen-DNA, die mit einem automatisierten Verfahren mit standard paramagnetischen Zellulose Partikel isoliert wurde verstärkt. Lane L enthält die DNA-Leiter als Standard für die Messung der Größe des linearen DNA-Bänder in Probe Bahnen verwendet. (B) Beispiel der Viruspartikel von Transmissions-Elektronenmikroskopie im weißen Pellet erholt von Rohöl Fraktionierung von infizierten Canna Blätter angezeigt. (C) Agarose (0,8 %) gel-Elektrophorese von DNA erholte sich von den grünen (Spur 1) und weiß (Bahn 2) pellets, positiv getestet durch PCR im Bedienfeld "A." Die rote und gelbe Punkte neben Bahn 2 identifizieren zwei hochmolekularen DNA-Bänder, die in den weißen Bruch auftreten. (D) Agarose (1 %) gel-Elektrophorese von Gesamt-RNS durch spaltenbasierten RNA Reinigung wiederhergestellt. Lane L enthält die DNA-Leiter als Standard für die Messung der Größe des linearen Bändern in Probe Bahnen verwendet. Spur 1-6 enthält RNA isoliert von infizierten Canna Blätter, die zusammengefasst wurden auf eine einzelne Probe für Ribo-Erschöpfung und RNA-f (E) schematische Pipeline von Nukleinsäure-Isolationen, Bibliothek Vorbereitung, Sequenzierung, Contig Montage und Virusgenom Entdeckung. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Abbildung 2 : Krone Diagramme visualisieren die taxonomischen Kategorien von Contigs. (A) das Diagramm auf der linken Seite zeigt die Fülle und taxonomische Verteilung von Contigs aus Rohöl Virus Vorbereitung zusammengestellt. Das rechte Diagramm zeigt die Proportionen des Virus Contigs der Familie Caulimoviridae , Badnavirus Gattung und drei nah verwandte Arten zugeordnet. (B) zeigt das Panel auf der linken Seite die Fülle von Contigs RNA-Seq abgeleitet basierend auf deren taxonomische Verteilung. Auf der rechten Seite ist der Graph zeigt die Fülle von Contigs innerhalb der Bevölkerung des Virus Contigs der Familie Caulimoviridae , Badnavirus Gattung und drei nah verwandte Arten zugeordnet. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Abbildung 3 . Charakterisierung von CaYMAV-1 und CaYMV-Ap01 Genomen. (A) schematische Darstellung der Canna gelbe Mottle Virus 1 zuordnen (CaYMAV) und Canna gelbe Mottle Virus ähnlich wie das Genom isoliert von Alpinia Purpurata (CaYMV-Ap01). Nukleotid-Positionen 1-10 wird als Beginn des Genoms identifiziert und enthält eine tRNAtraf Anticodon Website typisch für die meisten Badnavirus Genomen. Stop und Start Positionen für die Übersetzung der offenen Leserahmen (ORF) 1 und 2 liegen. Diese Proteine haben unbekannte Funktionen. ORF3 ist ein funkionalen mit Zinkfinger (ZnF), Protease (Pro), Reverse Transkriptase (RT) und RNAse H-Domänen. Eine 3' poly(A) Signalsequenz ist für beide Virus-Genom erhalten. (B) RT-PCR-Analyse wurde durchgeführt mit RNA isoliert vom Virus infizierte Blätter und Grundierungen, die CaYMAV und CaYMV-Ap01 erkennen. In der gleichen Bevölkerung von 12 Pflanzen waren drei mit CaYMV-Ap01 nur infiziert während der verbleibenden mit CaYMAV und CaYMV-Ap01 infiziert waren. (+) zeigt positive Kontrolle und (-) zeigt negative Kontrolle. Diese Zahl ist von Wijayasekara Et Al. reproduziert/geändert 24 mit Erlaubnis. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

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