Name: combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

המחקר מומן על-ידי אוקלהומה מרכז לקידום המדע, הטכנולוגיה להחיל מחקר התוכנית שלב II AR 132-053-2; ומחקר, אוקלהומה משרד החקלאות המומחיות יבולים גרנט תוכנית. אנו מודים דוקטור HongJin פאנג, ביואינפורמטיקה אוסו הליבה מתקן אשר נתמכה על ידי מענקים NSF (EOS-0132534) ו- NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02, 5P20RR15564-03).

המחברים אין לחשוף.

בשנים האחרונות מגוון שיטות יש כבר מועסקים ללמוד מגוון ביולוגי צמחים וירוס סביבות טבעיות אשר כוללים מעשירה חלקיקי כמו וירוס (הוי) או וירוס מסוים RNA או DNA2,3,44, 45,46 . שיטות אלה, מלוות המיתרים וניתוח bioinformatic. מטרתו של מחקר זה היתה למצוא את סוכן סיבתי של מחלה נפוצה במפעל מעובדים. המחלה דווח כדי להיות התוצאה של הווירוס בעל חלקיקים שאינם העטופים bacilliform, ועל אשר כבר רק רסיס bp 565 משובטים47. מידע זה היה מספיק עבור חוקרים קודמים להקצות באופן היפותטי הווירוס הסוג Badnavirus בתוך המשפחה Caulimoviridae. בעוד דוחות קודמים שיערו כי מחלת לנמר canna canna חבצלות היה התוצאה של badnavirus יחיד, באמצעות גישה metagenomics המתוארים במחקר זה, קבענו כי המחלה נגרמה badnavirus סופית שני מינים24. לכן, הכוח של שימוש בגישה metagenome לגלות את סוכן סיבתי של המחלה הוא כי אנחנו מסוגל לזהות מצבים שבהן עשוי להיות גורם אחד או יותר.
הגישה שלנו שילוב נתונים רצפי DNA ו- RNA היא יסודית, גם מדגים כי התוצאות באמצעות שתי גישות הניבו תוצאות עקביות, אישר את נוכחותם של שני וירוסים הקשורים. אנו המועסקים הליך שונה עבור בידוד של caulimoviruses, המיוצר מדגם זה היה מועשר עבור חומצות גרעין וירוס הקשורים ועל זה היו מוגנים בתוך capsid וירוס. מעבדת שירות היה מתכווץ כדי לבצע את רצפי DNA. המושג חיוני עבור רצף דה נובו הוא שאת ה-DNA פולימראז משלבת את פלורסנט שכותרתו נוקלאוטידים לתוך בשרך תבנית ה-DNA במהלך מחזורי רציף של סינתזת ה-DNA. Contigs התאספו שהופעלו על-ידי הגדרות הוגשו לתוך זרימת עבודה bioinformatic בהפקת contigs כמה שמצבן contigs וירוס. אישור נוסף של וירוס שני הגנום10,24,48,49,50 הושג באמצעות ניתוח bioinformatic של RNA-seq והנתונים שהתקבלו מדולדל ribo ההכנות RNA. אחד התוצאה מעניינת היה ללמוד כי באוכלוסיות של רצפי לשחזר אותו באמצעות רצפי DNA ו- RNA מסופקים התפלגויות דומות של חומצות גרעין נגיפי וויראליים. עבור רצפי DNA ו- RNA, < 0.5% של רצפי היו ממוצא וירוס. בתוך האוכלוסייה של וירוס רצפים 78-82% היה שייך למשפחת Caulimoviridae. על ידי השוואת את contigs וירוס שהורכב מ רצפי DNA ו- RNA, אנחנו אישר כי הגנום התאספו שני התרחשה ב שני נתונים (datasets).
חשש של באמצעות רצפי DNA היחידה לזיהוי הגנום וירוס חדש הוא הגנום badnavirus הוא ה-DNA מעגלי פתוח. אנו לשער כי רצפים חופפים שיבושים הגנום יכול להציג מכשולים להרכבה הגנום של contigs. בדיקה ראשונית של התוצאות רצפי DNA חשף שתי הגנום וירוס דומה. שיערנו כי הגנום אלה מיוצגים גם מגוון גנטי של זן לא נחקרה, או מייצגים שני מינים משותפת מדביק אותו צמח24. לפיכך, ניתוח bioinformatic הקולקטיבי של נתונים (datasets) מתקבל על ידי הגדרות DNA ו RNA רצף, איפשרה האישור של הנוכחות של שני באורך מלא הגנום.
יש עוד דו ח אשר פיתח שיטה חלופית עבור חילוץ וי ו חומצות גרעין של צמח homogenates ללימודים metagenomic, המבוססים על שגרות להתאושש DNA כרובית פסיפס וירוס (CaMV; caulimovirus)3. גישה זו מזוהה הרומן RNA וחלבונים וירוס DNA בצמחים שאינם מעובדים. השלבים נגזר מן ההליך בידוד caulimovirus השתמשו במחקר זה לגלות את סוכן סיבתי של מחלה של צמחים מתורבתים הם בניגוד השלבים נגזר לחילוץ וי מ צמחים נגועים באופן טבעי24. ההצלחה של שתי השיטות ששונה מרמז כי ההליך במסגרת caulimovirus בידוד עשוי להיות נקודת התחלה יקר ללימודים metagenomic של הצמח וירוסים באופן כללי.

מחלות צמחים המתעוררים כונן החוקרים לפתח כלים חדשים כדי לזהות את agent(s) סיבתי הנכון. דוחות ראשונית של מחלות וירוס חדש או חוזרות מבוססים על סימפטומים המתרחשים בדרך כלל כמו פסיפס של מומים של עלים, וריד ניקוי, גמדות, כמישה, נגעים, נמק, או תסמינים אחרים. התקן עבור דיווח וירוס חדש כמו סוכן סיבתי של מחלה היא להפריד אותו פתוגנים מזהמים אחרים, להפיץ את זה בפונדקאי מתאים, לשחזר את המחלה על ידי מזריקים לתוך צמחים בריאים של המין המארח המקורי. המגבלה בגישה זו היא כי סוגים רבים של וירוסים תלויים חרק או וקטורים אחרים לשידור פונדקאי מתאים או בחזרה המין המארח המקורי. במקרה זה, חפש את הווקטור המתאים יכול להיות ממושך, ייתכנו קשיים להקים מעבדה מושבות של וקטור ולאחר בהמשך המאמצים הדרושים כדי לתכנן עבור שידור ניסיוני פרוטוקול. אם לא ניתן להשיג את התנאים במחקרי מעבדה מוצלחת שידור, ואז העבודה נופל קצר התקן לדיווח מחלה וירוס חדש. וירוסים המתרחשים מארחיהם טבעי-titers נמוך מאוד, חוקרים עליך לזהות מארחים חלופי עבור הפצת כדי לשמור על מלאי זיהומיות מספיקות לביצוע המחקר. עבור מינים וירוס להדביק רק כמה צמחים זה יכול להיות גם מכשול לגידול תרבויות מניות1.
בשנים האחרונות מדענים הם להעסקת לעתים קרובות יותר תפוקה גבוהה הגדרות וגישות metagenomic לחשוף את רצפי וירוס הקיימים בסביבה, אשר קיים קשור מחלה ידועה, אך ניתן להקצות מינים בטקסונומיה ועוד סוגים 2 , 3 , 4. כזו גישות גילוי של אפיון חומרים גנטיים בסביבה ברורים לספק דרך לתאר את וירוס המגוון בטבע או נוכחותם מערכת אקולוגית מסוימת אבל לא בהכרח אישור מסגרת עבור הגדרת סוכני סיבתי עבור מחלה נראית לעין.
הסוג Badnavirus שייך למשפחת Caulimoviridae של pararetroviruses. וירוסים אלה הם bacilliform במצב עם גדיל כפול מעגלית DNA הגנום של-7 עד 9 kb. Pararetroviruses כל לשכפל דרך ביניים RNA. Pararetroviruses קיימים episomes וישכפלו עצמאית של הצמח בהכפלת ה-DNA5,6. מחקרים בתחום של אוכלוסיות וירוס עולה כי אוכלוסיות וירוס אלה מורכבים מבחינה גנטית. בנוסף, המידע שבידי במגוון של הצמח הגנום רצפי התפוקה גבוהה חשפו דוגמאות רבות badnavirus הגנום שברי המוכנסים על-ידי שילוב לגיטימי אירועים צמח הגנום. רצפי אנדוגני badnavirus אלה אינם קשורים בהכרח זיהום7,8,9,10,11. כתוצאה מכך, השימוש של הגדרות לזיהוי badnaviruses חדש כסוכן סיבתי של המחלה הינו מסובך המגוון subpopulation של הגנום episomal, כמו גם המופע של רצפי אנדוגני12,13.
אמנם לא אחת צינור אופטימלית עבור הגילוי של הגנום pararetrovirus הרומן, ישנן שתי גישות נפוצות כדי לזהות וירוסים אלה כסוכני סיבתי למחלה. שיטה אחת היא להעשיר עבור רצפי RNA קטן של עלים נגועים, ואז להרכיב את רצפי אלה צריך להשרות וירוס genome(s)14,15,16,17. גישה אחרת היא הגברה מעגל מתגלגל (RCA) כדי להגביר את הגנום של וירוס ה-DNA מעגלי18. ההצלחה של RCA תלוי גיל העלה כייל את וירוס בתוך הרקמה שנבחרו. המוצרים RCA נתון עיכול הגבלה, משובטים לתוך פלסמידים עבור ישיר רצף19,20,21.
Canna לנמר צהוב וירוס (CaYMV) badnavirus, מתואר הגורם etiological של מחלת לנמר צהוב קאנה, למרות רק שבר bp 565 של הגנום היה בעבר מבודד מן צפורנים נגוע22. מחקר עכשווי מזוהה CaYMV ב Alpinia purpurata (פריחה ג'ינג'ר; CaYMV-Ap)23. מטרתו של מחקר זה היה להתאושש רצפי הגנום badnavirus מלאה canna נגוע חבצלות. אנחנו מתארים עבור טיהור וירוס מן הצמח מזהמים ולאחר מכן לבודד את ה-DNA הנגיפי של הכנת פרוטוקול והכן ספריית DNA לשימוש המיתרים. גישה זו מבטלת את הצורך עבור שלבי ביניים הגברה מולקולרית. אנחנו גם לבודד mRNA מצמחים נגועים עבור ה-RNA-תת סעיף המיתרים, אשר כוללת RNA-seq בוצע באמצעות כל הכנה חומצת גרעין. Contigs התאספו נמצאו להתייחס טקסון Badnavirus ב שני datasets באמצעות המרכז הלאומי עבור ביוטכנולוגיה ו מידע (NCBI) יישור המקומי בסיסי בכלי החיפוש עבור חומצות גרעין (BLASTn). זיהינו הגנום של badnavirus שני מינים24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:368px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich St. Louis MO</td>
			<td style="width:133px;">S5976</td>
			<td style="width:440px;">Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">S0751</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:368px;">Na2SO3</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher Waltham, MA</td>
			<td style="width:133px;">28790</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">urea</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">PB169-212</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">X-100</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:168px;">VWR Radnor, PA</td>
			<td>21910-107</td>
			<td>Filter homogenate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP152-5</td>
			<td>Pellet resuspension&#38; DNA resuspension buffers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">MgCl2</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum, Gardena, CA</td>
			<td style="width:133px;">M1035</td>
			<td>Pellet resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum</td>
			<td style="width:133px;">E1045</td>
			<td>Stops enzyme reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">25530</td>
			<td>DNA resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">phenol:chloroform:isoamylalcohol&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">P2069</td>
			<td>Dissolve virion proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DNAse I</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M6101</td>
			<td>Degrade cellular DNA from extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">6B-100</td>
			<td>Virus DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Laboratory blender</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>58984-030</td>
			<td>Grind leaf samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">Floor model ultracentrifuge&#160; &#38;Ti70 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter, Irving TX&#160;</td>
			<td style="width:133px;">A94471</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:368px;">Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">369001</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">75876-022</td>
			<td>Mixing urea into samples overnight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Rubber policeman</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">470104-462</td>
			<td>Dissolve virus pellet</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">&#160;2100 bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:168px;">Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td>
			<td style="width:133px;">G2939BA</td>
			<td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td>
			<td></td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td>
			<td></td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">ND-2000</td>
			<td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plant total RNA isolation kit</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">STRN50-1KT</td>
			<td>Isolate RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>10128-514</td>
			<td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">RNA concentrator spin column</td>
			<td style="width:168px;">Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td style="width:133px;">R1013</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">rRNA removal kit</td>
			<td style="width:168px;">Illumina, San Diego, CA</td>
			<td style="width:133px;">MRZPL116</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">12321D</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">&#160;RNA&#160; enrichment system</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td style="width:133px;">7277300001</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">16500100</td>
			<td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">15585011</td>
			<td>Agarose gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pGEM-T +JM109 competent cells</td>
			<td style="width:168px;">Promega, Madison, WI</td>
			<td style="width:133px;">A3610</td>
			<td>Clone genome fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pFU Taq polymerase</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M7741</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dNTPs</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">U1511</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">PCR oligonucleotides</td>
			<td style="width:168px;">IDT, Coralvill, IA</td>
			<td style="width:133px;">Custom order</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Miniprep DNA purification kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A1330</td>
			<td style="width:440px;">Plasmid DNA purification prior to sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A9281</td>
			<td style="width:440px;">Prepare PCR products for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">pDRAW32 software</td>
			<td style="width:168px;">ACAClone</td>
			<td></td>
			<td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">MEGA6.0 software</td>
			<td style="width:168px;">MEGA</td>
			<td></td>
			<td>Molecular evolutionary genetics analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Primer 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Simgene.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT&#8482; RiboGreen&#8482; RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td>Fluorometric determination of RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior&#8482; pyrosequencing System</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5526337001</td>
			<td>Sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996520001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996490001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996538001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Oil &#38; Breaking Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996511001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996554001</td>
			<td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996619001</td>
			<td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IKA Turrax mixer</td>
			<td></td>
			<td>3646000</td>
			<td>Special mixer used with Turrax Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td>
			<td></td>
			<td>20003213</td>
			<td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Nebulizers Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5160570001</td>
			<td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior emPCR Bead Counter</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 635 001</td>
			<td>Library bead counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Bead Deposition Device</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 473 001</td>
			<td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Counterweight &#38; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 889 103 001</td>
			<td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Software</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 643 001</td>
			<td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Run Processor v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS De Novo Assembler v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Reference Mapper v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

גישה metagenome זו משמשת לזיהוי וירוסים עם הגנום DNA מעגלי וגיליון הציונים שלהם. צמח לעיתים קרובות וירוסים DNA מתרחשים titers נמוכה של המארח שלהם או לא יכול להיות מחוסן באופן מכני לארח עוד קשים להפיץ כדי להשיג עם כייל נוגדנים גדולה יותר של חומר זיהומיות. עלים נגועים הם הקרקע במאגר קלה עם pH אופטימלי והרכב יוניים מומלצת לטיהור רטרווירוסים ברוב של פארא bacilliform. אוריאה משמש כדי לשבור את גופות הכללה השמנה virions כדי להמיס את מרכיבי התא. צנטריפוגה דיפרנציאלית מספק יותר הפרדה בין virions של הצמח מזהמים. אז טיפול proteinase K מסיר את capsids. לאחר מכן ה-DNA הנגיפי הוא מרוכז, המשמש עבור הדור הבא רצפי (הגדרות). הגדרות הנתונים משמשים כדי להרכיב contigs אשר מוגשים ל NCBI-BLASTn לזיהוי תת-ערכה של וירוס רצפים ב- dataset שנוצר. צינור מקבילים, RNA הוא מבודד עלים נגועים בשיטה סטנדרטית מבוססי עמודה RNA החילוץ. ואז ריבוזום דלדול מבוצעת להעשיר של תת-קבוצות של תעתיקים mRNA ווירוסים. רצפים שהורכב נגזר RNA רצף (RNA-seq) הוגשו NCBI-BLASTn לזיהוי תת-ערכה של רצפי וירוס זה הנתונים (dataset). במחקר שלנו, זיהינו שני הגנום קשורים badnavirus באורך מלא ב- datasets שני. שיטה זו היא העדיף גישה נפוצה אחרת אשר מחלץ את האוכלוסייה צבירה של רצפי RNA קטנים כדי לשקם רצף גנומית של וירוס צמח. וירוס משחזרת צינור זה metagenomic האחרון הקשורים רצף זה תעתיק רטרו אלמנטים מוכנסים לתוך הגנום הצמח. זה הוא מצמידים מבחני ביוכימית או מולקולרית להבחין עוד יותר את פעיל מדבקים. הגישה שתועדו במחקר זה, משחזרת רצפים נציג של שכפול וירוסים צפויה להצביע על זיהום בנגיף פעיל.

שיטת טיהור זה וירוס ששונה מסופקים של העשרה של וירוס DNAs שימושית לצורך זיהוי שני מינים וירוס הגדרות, ביואינפורמטיקה. לאחר homogenate היה centrifuged-g 40,000 x עבור 2.5 h, היה גלולה ירוק בחלק התחתון של הצינור, גלולה לבנה לאורכו. בגדר ירוק היה resuspended לתוך שפופרת אחת microcentrifuge, בגדר לבן היה resuspended לתוך שני צינורות microcentrifuge. PCR בוצע באמצעות תקן ה-PCR CaYMV תחל אבחון, מוצרים אותרו בגדר לבן solubilized, לא בגדר ירוק (איור 1א'). מדגם של הכנת גס נבדק על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, הבחנו חלקיקים bacilliform מדידה 124-133 ננומטר אורך (איור 1B). זה במסגרת אורך מודאלי החזוי badnaviruses רוב. דנ א היה מופק כדורי לבן וירוק, resuspended בנפרד. איור 1C, שנעמיס 5 µL של ה-DNA שחולצו מן הירוק, הדגימה גלולה לבנה (1.6 µg של ה-DNA של השבר ירוק) ו- 3.1 µg של ה-DNA של השבר הלבן כדי 0.8% agarose ג'ל אלקטרופורזה וניתח את ה-DNA בעקבות אתידיום ברומיד מכתים. השבר ירוק הכיל משקל מולקולרי נמוך דנ א ואילו השבר הלבן הפיק שתי להקות של משקל מולקולרי גבוה יותר דנ א, כמו גם משקל מולקולרי נמוך דנ א (איור 1C). הג'ל המוצגים באיור 1C היה לרוץ במשך 40 דקות ב- 100 וולט ומציעה השמצות בנתיב 3 כי המתח ג'ל צריך להיגרע לייצר להקות יותר ברור. נתונים אלו מראים כי בגדר לבן היה מועשר עבור virions. הריכוז (0.6 µg/mL) ה-DNA שחולצו מן המדגם לבן היה נמוך, אבל נאותה המיתרים, אשר דורשת מינימום של 10 ng של ה-DNA כדי להמשיך. DNAs מפוצלים שימשו כדי להתכונן ספריה המיתרים.
במקביל, RNA שהופק מצמחים נגועים קאנה (איור 1D) עבור תפוקה גבוהה RNA-תת סעיף זרימת עבודה סטנדרטי בוצע עבור ספריית הכנה, המיתרים, יצירת contigs וזיהוי של רצפי גנום ויראלי (איור 1E). תוצאות הפלט באמצעות DNA ו- RNA כמו חומרי מוצא הושוו.
השגנו 188,626 קריאות ה-DNA raw על-ידי הגדרות באמצעות DNA מבודד הכנת וירוס גולמי. קריאות כונסו לתוך 13,269 contigs, BLASTn נעשה שימוש כדי לחפש את ערכת הנתונים NCBI של רצפי (באמצעות Viridplantae TaxID: 33090, וירוס TaxID: 10239 בשם המגביל האורגניזמים) (איור 1E). התוצאות NCBI-BLASTn גילה כי 93% contigs דה נובו התאספו היו הסלולר רצפים, 22% היו ידועות, 0.3% היו וירוס contigs (איור 2א). רוב contigs, מסווגות רצפים הסלולר אותרו גם מיטוכונדריאלי או כלורופלסט הדנ א. בתוך ערכת הנתונים של וירוס contigs, 32% של contigs וירוס היו קשורים לחברי Caulimoviridae (שלא היו רצפים Badnavirus) ו- 58% מאלה שהיו קשורים Badnavirus. של contigs וירוס, 29% היו מאוד דומות (e < 1 x 10-30) עם ג ' ין V17 ORF3 ולבודד CaYMV (EF189148.1), קנה סוכר bacilliform וירוס לבודד Batavia D, הגנום המלא (FJ439817.1), ושל בננה פס CA וירוס להשלים את הגנום ( KJ013511). בתוך אוכלוסייה זו, היו contigs רב כשהופיעה שני באורך מלא הגנום.
תפוקה גבוהה RNA-seq המיוצר 153,488 רצף בודדים נקי קריאות עם ממוצע לקרוא אורך < 500 bp. Contig הרכבה מופחת זה כדי 8,243 contigs. אלה הוגשו NCBI-BLASTn (באמצעות Viridplantae TaxID: 33090, וירוס TaxID: 10239 בשם המגביל האורגניזמים), ואת התוצרים יכניסו 76% contigs קטגוריה של רצפים תאי צמח, 23% היו ידועות. 0.1% היו כידידותיים וירוס contigs ( איור 2 B). בחינה מדוקדקת יותר של האוכלוסייה באוכלוסייה 0.1% של וירוס contigs נקבע כי 68% מאלו שהוזמנו Caulimoviridae (איור 2B). 3 contigs גדולות בתוך אוכלוסייה זו זוהו עם דמיון גבוה (e < 1 X 10-30) CaYMV לג'ין ולבודד V17 ORF3 (EF189148.1), קנה סוכר bacilliform וירוס לבודד Batavia D, הגנום המלא (FJ439817.1) ופס בננה וירוס CA הגנום המלא (KJ013511). בחינת contigs של שלוש, הצטרפנו ידנית שתיים כאלה כדי לייצר גנום הוירוס באורך מלא.
השווינו את contigs אורך הגנום של וירוס המיוצר על ידי רצף DNA ו- RNA בדומה לפיגום הדדית כדי לאשר הנוכחות של שני הגנום של וירוס באורך מלא. גנום הוירוס באורך מלא אחד של 6,966 bp באופן לא סופי בשם וירוס לנמר צהוב הקשורים Canna 1 (CaYMAV-1) (איור 3א). הגנום השני היה 7,385 bp ווריאציה של CaYMV הדבקה Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (איור 3א).
לבסוף, תחל PCR אשר נועדו שיבוט ~ 1,000 שבר bp של וירוס, שימשו באופן שונה לזהות שני הגנום בקרב אוכלוסיה של צמחים canna 227 המייצגים תשע זנים מסחריים. במקרים רבים נדבקו צמחים בודדים עם שני וירוסים. אנו מספקים דוגמא RT-PCR לזיהוי של CaYMAV-1 ו- CaYMV-Ap01 את הצמחים 12. שלושת אלה היו חיוביות רק עבור CaYMV-Ap01, 9 היו חיוביים שני וירוסים (איור 3ב).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> איור 1 : וירוס חומצת גרעין ההכנות של הגדרות זרימת העבודה. (א) Agarose (1.0%) ג'ל אלקטרופורזה של 565 bp PCR שברי הגנום CaYMV. שני מוצרים PCR התגלו דגימות שהוכנו בגדר לבן (מסלולים 1, 2) אך לא הדגימה צניפה ירוק (ליין 3). בקרה חיובית (+) מייצג את מוצר ה-PCR מוגבר מצמח נגוע דנ א זה הופרדה באמצעות שיטה אוטומטית מעורבים חלקיקים תאית פאראמגנטיים סטנדרטי. ליין L מכיל בסולם הדנ א המשמש כסטנדרט למדידת בגודל של להקות DNA ליניארי של נתיבים מדגם. (B) דוגמה חלקיקי וירוס להצגה על-ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים ב בגדר לבן לשחזר אותו באמצעות fractionation גסה של canna נגוע עלים. (ג) Agarose (0.8%) ג'ל אלקטרופורזה של דנ א התאוששה הירוק (ליין 1) ולבן (ליין 2). גללים זה חיובי שנבדקו על ידי ה-PCR בלוח א הנקודות אדום וצהוב ליד ליין 2 לזהות שתי להקות DNA משקל מולקולרי גבוה המתרחשים השבר הלבן. (ד) Agarose (1%) ג'ל אלקטרופורזה של RNA הכולל התאושש על ידי טיהור RNA מבוססי עמודה. ליין L מכיל בסולם הדנ א המשמש כסטנדרט למדידת הגודל של להקות ליניארית ב נתיבים מדגם. ליין 1-6 מכיל RNA מבודד canna נגוע עלים אשר היו איחדו מדגם יחיד עבור דלדול ribo ו- RNA-תת סעיף (E) צינור סכמטי של חומצת גרעין ומשום, ספריית הכנה, רצף, contig הרכבה גנום הוירוס גילוי. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> איור 2 : תרשימים כתר להמחיש את קטגוריות בטקסונומיה contigs. (א) התרשים על המופעים השמאלי שפע והפצה טקסונומי של contigs התכנסו from הכנת וירוס גולמי. התרשים הנכון מתארת את הפרופורציות של וירוס contigs הקשורים עם משפחת Caulimoviridae , Badnavirus סוג של שלושה מינים קרובים. (B) הלוח בצד השמאל מציג השפע של contigs נגזר RNA-seq בהתבסס על התפלגות בטקסונומיה שלהם. מימין נמצאת הגרף המתאר את השפע של contigs של contigs וירוס הקשורים עם משפחת Caulimoviridae , Badnavirus סוג של שלושה מינים קרובים בתוך האוכלוסייה. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> איור 3 . אפיון של הגנום CaYMAV-1 ו- CaYMV-Ap01. (א) Diagrammatic ייצוג של Canna צהוב לנמר לשייך וירוס 1 (CaYMAV) ו Canna לנמר צהוב וירוס דומה הגנום מבודד מן Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). נוקלאוטיד עמדות 1-10 מזוהה בתור ההתחלה של הגנום ומכיל tRNAפגש anticodon אתר אופייני של רוב הגנום badnavirus. העמדות להפסיק ולהתחיל לתרגום של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) 1 ו- 2 סמוכים. חלבונים אלה יש נודע פונקציות. ORF3 הוא polyprotein המכיל אבץ אצבע (ZnF), פרוטאז (Pro), רוורס טרנסקריפטאז (RT) ותחומים RNAse H. 3' poly(A) אות רצף כולו עבור שניהם הגנום של וירוס. (B) RT-PCR ניתוח בוצע בעזרת RNA מבודד מן העלים וירוס נגוע, תחל המאתרות CaYMAV ו- CaYMV-Ap01. באוכלוסייה זהה של 12 תחנות, שלושה היו נגועים CaYMV-Ap01 בלבד, ואילו שאר נדבקו בנגיף הן CaYMAV והן CaYMV-Ap01. (+) מצביע על בקרה חיובית (-) מציין שליטה שלילי. נתון זה לשכפל/השתנו מ. Wijayasekara et al. 24 בעלי הרשאה. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

כאן אנו מציגים גישה חדשה לזיהוי וירוסים עם כפול-גדיל DNA הגנום. אנו משתמשים בשיטות הרגילות כדי לחלץ DNA ו- RNA עלים נגועים ולבצע רצף הדור הבא. כלים Bioinformatic להרכיב רצפים לתוך contigs, לזהות contigs המייצג את הגנום של וירוס והקצה הגנום לקבוצות בטקסונומיה.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...