Name: combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Исследование финансировалось Оклахома центр для развития науки и технологии применения исследований программы этапа II AR 132-053-2; и Оклахома Департамента сельского хозяйства специальность культур исследования Грант программы. Мы благодарим д-р HongJin Хван и ОГУ биоинформатики основного объекта, который был поддержан грантов от NSF (EOS-0132534) и низ (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 и 5P20RR15564-03).

Авторы не имеют ничего сообщать.

В последние годы различные методы были использованы для изучения вируса биоразнообразия растений в природных средах, которые включают обогащает вирусоподобных частиц (VLP) или вирусом конкретных ДНК или РНК2,3,44, 45,46 . Эти методы следуют NGS и bioinformatic анализа. Целью данного исследования было найти возбудителя широко распространенным заболеванием в культивируемых растений. Заболевание было сообщено в результате неизвестного вируса, который имеет не охватило бацилловидные частиц, и для которых только фрагмент 565 bp был клонированных47. Эта информация была достаточной для предварительного исследователей назначить гипотетически вирус в род Badnavirus в семье Caulimoviridae. В то время как предыдущие доклады предположил, что Канна крапчатости болезни в Канна лилии был результатом одного badnavirus, используя метагеномики подход, изложенный в этом исследовании, мы определили, что болезнь была вызвана двумя предварительное badnavirus видов24. Таким образом, сила с использованием подхода metagenome обнаружить возбудителя болезни является, что мы теперь можем определить ситуации там, где может быть более чем одной причиной.
Наш подход, сочетая ДНК и РНК последовательности данных является тщательное и также показывает, что результаты, с использованием двух подходов приносят устойчивые результаты и подтвердили наличие двух смежных вирусов. Мы заняты измененная процедура для изоляции caulimoviruses и подготовил образец, который был обогащен для связанных вирус нуклеиновых кислот и которые были защищены в рамках капсид вирус. Служба лаборатории был заключен контракт для секвенирования ДНК. Основные концепции для секвенирования de novo является ДНК-полимеразы включает люминесцентные, помечаются нуклеотидов в ДНК шаблон нити во время последовательных циклов синтеза ДНК. Сахалинской собрал следуют NGS были представлены в производство несколько Сахалинской, которые были определены как вирус Сахалинской bioinformatic рабочий процесс. Дальнейшее подтверждение двух вирусных геномов10,24,48,49,50 был получен путем анализа bioinformatic РНК seq данных, полученных от обедненного Рибо РНК препаратов. Один из интересных результатов состоял в том, чтобы узнать, что населения последовательностей восстановления, ДНК и РНК последовательности представили аналогичные дистрибутивов-вирусных и вирусных нуклеиновых кислот. Для секвенирования ДНК и РНК, < 0,5% последовательностей были происхождения вируса. В рамках населения вируса последовательности 78-82% принадлежал семье Caulimoviridae. Сравнивая Сахалинской собрал вирус от ДНК и РНК последовательности, мы подтвердили, произошедшую два сборных геномов в обоих наборах данных.
Проблемой использования только секвенирования ДНК для идентификации новых вирусных геномов, что геном badnavirus является открытым циркуляр ДНК. Мы предположили, что перекрытия несплошностей в геном последовательности может представлять препятствия для Ассамблеи генома от Сахалинской. Первоначальный анализ результатов секвенирования ДНК выявили два аналогичных геномов вируса. Мы предположили, что эти геномы либо представлены генетическое разнообразие видов, которые не были изучены, или представлены два вида совместно заражение же завод24. Таким образом анализ коллективных bioinformatic наборов данных, полученных NGS ДНК и РНК последовательности, позволил подтверждение наличия двух полнометражных геномов.
Есть еще один доклад, который разработал альтернативный метод для извлечения VLP и нуклеиновые кислоты из растений гомогенатах для метагеномных исследований, на основе процедур для восстановления ДНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV; caulimovirus)3. Этот подход, обозначенный Роман РНК и ДНК вируса последовательностей в-культивируемых растений. Действия, производные от процедуры изоляции caulimovirus, используемые в данном исследовании для обнаружения возбудителя болезни культивируемых растений являются в отличие от шагов, полученных для извлечения VLP естественно зараженных растений24. Успех обеих модифицированных методов свидетельствует о том, что рамки процедуры для caulimovirus изоляции может быть ценной отправной точкой для исследования метагеномных вирусов растений в целом.

Возникающие болезни растений диск исследователям развивать новые инструменты для определения правильного причинной агент(ы). Первоначальные сообщения о новых или повторяющиеся вирусных заболеваний основаны на часто встречающиеся симптомы, такие как мозаика и пороки развития листьев, очистка вен, карликовость, увядание, поражения, некроз, или другие симптомы. Стандарт для представления новый вирус возбудителя болезни заключается в том, чтобы отделить его от других загрязняющих патогенов, распространить его в подходящий хост и воспроизвести заболевание, прививки в здоровых растений видов исходного узла. Ограничение этого подхода является, что многие родов вирусов растений зависит от насекомых или других векторов для передачи подходящей принимающей или вернуться к оригинальной видов хост. В этом случае поиск соответствующий вектор может быть продлен, могут возникнуть трудности для создания колонии лаборатории вектора, и необходимы дальнейшие усилия для разработки протокола для экспериментальной передачи. Если условия для успешной передачи лабораторных не может быть достигнута, то работа отстает от стандарт для представления новых вирусных заболеваний. Для вирусов, которые происходят в их естественной хостов на очень низкие титры исследователи должны определить альтернативные хосты для распространения поддерживать достаточные запасы инфекционных для проведения научных исследований. Для видов вирус заражает только несколько растений это также может быть препятствием для выращивания запасов культур1.
В последние годы ученые все чаще применяют NGS высокой пропускной способности и метагеномных подходы для выявления вируса последовательностей, которые присутствуют в окружающей среде, которые могут существовать отношения к известной болезни, но может быть назначен таксономических видов и родов 2 , 3 , 4. такие подходы к открытию и категоризации генетических материалов в различных условиях предоставляют способ описать разнообразие вируса в природе или их присутствие в определенные экосистемы, но не обязательно подтвердить основы для определения причинных агентов для явно заболеваний.
Род Badnavirus принадлежит к семейству Caulimoviridae pararetroviruses. Эти вирусы являются бацилловидные в форме с круговой двойной нити ДНК геномов около 7 до 9 КБ. Все pararetroviruses реплицировать через промежуточное РНК. Pararetroviruses существуют как episomes и реплицировать независимо от завода хромосомной ДНК5,6. Полевые исследования вируса населения указывают, что эти популяции вируса генетически сложны. Кроме того информация, полученная по широкому геномах растений путем sequencing высокой пропускной способности обнаружили многочисленные примеры фрагментов генома badnavirus вставлены события незаконной интеграции в геномов растений. Эти эндогенные badnavirus последовательности не обязательно связаны с инфекцией7,8,9,10,11. Впоследствии использование NGS для идентификации новых badnaviruses в качестве возбудителя заболевания осложняется субпопуляция разнообразия episomal геномов, а также появление эндогенных последовательности12,13.
Хотя есть не один оптимальный конвейер для открытия Роман pararetrovirus геномов, есть два общих подхода к идентифицировать эти вирусы как причинных агентов для болезни. Одним из методов является обогатить для малых РНК последовательности из зараженных листьев и затем собрать эти последовательности для воссоздания вирус genome(s)14,,1516,17. Другой подход — подвижного круга амплификации (RCA) для того чтобы усилить круговой ДНК вируса геномов18. Успех RCA зависит от возраста листа и титр вируса в выбранной ткани. RCA продукты подвергаются пищеварение ограничения и клонирования в плазмиды для прямого секвенирования19,,2021.
Канна желтый крапчатости вирус (CaYMV) является badnavirus и описывается как этиологической причиной заболевания желтой пятнистости в Канны, хотя только 565 bp фрагмент генома был ранее изолированные от зараженных Каннас22. Современные исследования выявлены CaYMV в purpurata Альпиния (цветение имбиря; CaYMV-Ap)23. Целью данного исследования было восстановить полный badnavirus последовательностей генома от зараженных Канна лилии. Мы описать протокол для очистки вируса от завода загрязнений и затем изолировать вирусной ДНК от этого препарата и подготовить библиотеки ДНК для использования в NGS. Этот подход устраняет необходимость в промежуточных молекулярной амплификации шаги. Мы также изолировать mRNA от инфицированных растений для РНК след NGS, которая включает в себя РНК seq осуществлялась с помощью подготовки каждого нуклеиновых кислот. Собрал Сахалинской были найдены относиться к Badnavirus таксонов в обоих наборах данных, с помощью национального центра для биотехнологии и информации (NCBI) основные местные выравнивание инструмент для поиска нуклеиновые кислоты (BLASTn). Мы определили геном badnavirus двух видов24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:368px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich St. Louis MO</td>
			<td style="width:133px;">S5976</td>
			<td style="width:440px;">Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">S0751</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:368px;">Na2SO3</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher Waltham, MA</td>
			<td style="width:133px;">28790</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">urea</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">PB169-212</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">X-100</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:168px;">VWR Radnor, PA</td>
			<td>21910-107</td>
			<td>Filter homogenate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP152-5</td>
			<td>Pellet resuspension&#38; DNA resuspension buffers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">MgCl2</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum, Gardena, CA</td>
			<td style="width:133px;">M1035</td>
			<td>Pellet resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum</td>
			<td style="width:133px;">E1045</td>
			<td>Stops enzyme reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">25530</td>
			<td>DNA resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">phenol:chloroform:isoamylalcohol&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">P2069</td>
			<td>Dissolve virion proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DNAse I</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M6101</td>
			<td>Degrade cellular DNA from extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">6B-100</td>
			<td>Virus DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Laboratory blender</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>58984-030</td>
			<td>Grind leaf samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">Floor model ultracentrifuge&#160; &#38;Ti70 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter, Irving TX&#160;</td>
			<td style="width:133px;">A94471</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:368px;">Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">369001</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">75876-022</td>
			<td>Mixing urea into samples overnight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Rubber policeman</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">470104-462</td>
			<td>Dissolve virus pellet</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">&#160;2100 bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:168px;">Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td>
			<td style="width:133px;">G2939BA</td>
			<td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td>
			<td></td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td>
			<td></td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">ND-2000</td>
			<td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plant total RNA isolation kit</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">STRN50-1KT</td>
			<td>Isolate RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>10128-514</td>
			<td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">RNA concentrator spin column</td>
			<td style="width:168px;">Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td style="width:133px;">R1013</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">rRNA removal kit</td>
			<td style="width:168px;">Illumina, San Diego, CA</td>
			<td style="width:133px;">MRZPL116</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">12321D</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">&#160;RNA&#160; enrichment system</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td style="width:133px;">7277300001</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">16500100</td>
			<td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">15585011</td>
			<td>Agarose gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pGEM-T +JM109 competent cells</td>
			<td style="width:168px;">Promega, Madison, WI</td>
			<td style="width:133px;">A3610</td>
			<td>Clone genome fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pFU Taq polymerase</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M7741</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dNTPs</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">U1511</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">PCR oligonucleotides</td>
			<td style="width:168px;">IDT, Coralvill, IA</td>
			<td style="width:133px;">Custom order</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Miniprep DNA purification kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A1330</td>
			<td style="width:440px;">Plasmid DNA purification prior to sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A9281</td>
			<td style="width:440px;">Prepare PCR products for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">pDRAW32 software</td>
			<td style="width:168px;">ACAClone</td>
			<td></td>
			<td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">MEGA6.0 software</td>
			<td style="width:168px;">MEGA</td>
			<td></td>
			<td>Molecular evolutionary genetics analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Primer 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Simgene.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT&#8482; RiboGreen&#8482; RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td>Fluorometric determination of RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior&#8482; pyrosequencing System</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5526337001</td>
			<td>Sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996520001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996490001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996538001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Oil &#38; Breaking Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996511001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996554001</td>
			<td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996619001</td>
			<td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IKA Turrax mixer</td>
			<td></td>
			<td>3646000</td>
			<td>Special mixer used with Turrax Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td>
			<td></td>
			<td>20003213</td>
			<td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Nebulizers Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5160570001</td>
			<td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior emPCR Bead Counter</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 635 001</td>
			<td>Library bead counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Bead Deposition Device</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 473 001</td>
			<td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Counterweight &#38; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 889 103 001</td>
			<td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Software</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 643 001</td>
			<td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Run Processor v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS De Novo Assembler v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Reference Mapper v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

Этот подход metagenome используется для идентификации вирусов растений с круговой геномов ДНК и их стенограммы. Часто завод ДНК вирусов, которые происходят в низкие титры в принимающих их или не может быть механически привиты на другой хост трудно распространить достижения большей титра инфекционного материала. Зараженные листья шлифуются в мягкий буфера с оптимальным pH и ионный состав рекомендуется для очистки большинства бацилловидные пункт ретровирусы. Карбамид используется сломать вверх включения органов, которые ловушку вирионов и распустить клеточных компонентов. Дифференциального центрифугирования обеспечивает дальнейшее разделение вирионы от загрязнений завод. Затем лечение протеиназы K удаляет capsids. Затем вирусной ДНК сконцентрировано и используется для виртуализации нового поколения (НГС). NGS данные используются для сборки Сахалинской, которые принимаются в NCBI-BLASTn определить подмножество вирус последовательностей в созданном наборе данных. В параллельных конвейера РНК изолирован от зараженных листьев с использованием стандартного метода извлечения РНК на основе столбцов. Затем рибосома истощения осуществляется для обогащения для подмножества мРНК и вирус стенограмм. Собрал последовательности, производные от РНК последовательности (РНК seq) были представлены NCBI-BLASTn определить подмножество вирус последовательностей в этом наборе данных. В нашем исследовании мы определили два смежных полнометражные badnavirus геномов в двух наборах данных. Этот метод является предпочтительным для другой распространенный подход, который извлекает совокупного населения малых РНК последовательности для воссоздания растений вирус genomic последовательностей. Этот вирус восстанавливает последний метагеномных конвейера связанных последовательностей, ретро переписывание элементы вставляются в геном растений. Это сочетается в биохимических и молекулярных анализов для дальнейшего различить активно инфекционных агентов. Подход, задокументированы в данном исследовании, восстанавливает последовательности представитель репликацию вирусов, которые вероятно указывают активной вирусной инфекции.

Этот метод очистки измененных вирусов предусмотрено обогащение вируса ННО полезно для выявления двух видов вируса NGS и биоинформатики. После огневки был центрифугируется на 40000 x g для 2,5 ч, там был зеленый Пелле в нижней части трубки и белые гранулы по длине. Зеленые гранулы был высокомобильна в одну трубу microcentrifuge и белые гранулы был высокомобильна в две пробирки microcentrifuge. ПЦР была проведена с использованием стандартных диагностических праймеры CaYMV PCR, и продукты были обнаружены в растворимых гранул белого и не зеленые гранулы (рис. 1А). Образец подготовки нефти был осмотрен просвечивающей электронной микроскопии и мы наблюдали бацилловидные частиц измерения 124-133 Нм в длину (рис. 1Б). Это в пределах предсказал модальной длины большинства badnaviruses. ДНК было извлечено из белых и зеленых гранул и высокомобильна отдельно. Рисунок 1Cмы загрузили 5 мкл ДНК, извлеченные из зеленого и белые гранулы образца (1,6 мкг ДНК для зеленых фракции) и 3,1 мкг ДНК для белых фракция 0,8% агарозном электрофорез геля и анализ ДНК, после бромид ethidium пятнать. Зеленая часть содержащихся низкомолекулярных ДНК в то время как белая часть производства две полосы выше молекулярный вес ДНК, а также нижней молекулярный вес ДНК (рис. 1C). Гель, представлены на рисунке 1C был 40 мин на 100 V и мазок в переулок 3 свидетельствует о том, что гель напряжения должен быть понижен для получения четкого полос. Эти данные позволяют предположить, что белые гранулы был обогащен для вирионов. Концентрация (0,6 мкг/мл) ДНК, извлеченные из белого образца была низкой, но достаточный для NGS, который требует минимум 10 нг ДНК, чтобы продолжить. Фрагментированные ННУ были использованы для подготовки библиотека для NGS.
Параллельно РНК было извлечено от зараженных Канна растений (рис. 1D) для высокой пропускной способности РНК seq. Стандартный рабочий процесс был проведен для библиотеки подготовки, NGS, создавая Сахалинской и выявления вирусного генома последовательности (рис. 1E). Сравнивались результаты от использования ДНК и РНК в качестве исходных материалов.
Мы получили 188,626 сырье читает ДНК, NGS с помощью ДНК, изолированные от подготовки сырой вирус. Чтений были собраны в 13,269 Сахалинской и BLASTn был использован для поиска набора данных NCBI нуклеотидных последовательностей (с помощью Viridplantae TaxID: 33090 и вируса TaxID: 10239 как ограничивающие организмов) (рис. 1E). Результаты NCBI-BLASTn показало, что 93% de novo собрал Сахалинской были клеточных последовательностей, 22% были неизвестны, и 0,3% были вирус Сахалинской (рисA). Большинство из Сахалинской классифицированы как клеточных последовательностей были определены как митохондриальных или хлоропласта ДНК. В пределах набора данных вируса Сахалинской, 32% вирус Сахалинской были связаны с членами Caulimoviridae (которые были не Badnavirus последовательности) и 58% из них были связаны с Badnavirus. Вирус Сахалинской 29% были очень похожие (е < 1 x 10-30) к CaYMV, изолировать V17 ORF3 генов (EF189148.1), тростниковый сахар бацилловидные вирус изолировать Батавии D, полный геном (FJ439817.1), и банан полоска CA вирус полный геном ( KJ013511). В рамках этой группы населения были длинные Сахалинской, которая напоминала два полнометражных геномов.
Высок объём РНК seq производится 153,488 уборка отдельных последовательностей читает в среднем читать Длина < 500 bp. Contig Ассамблеи сократить это до 8,243 Сахалинской. Они были представлены NCBI-BLASTn (с помощью Viridplantae TaxID: 33090 и вируса TaxID: 10239 как ограничивающие организмов) и выходы включены 76% Сахалинской в категорию растений клеточных последовательностей, 23% были неизвестны, и 0.1% были классифицированы как вирус Сахалинской ( Рисунок 2 B). более внимательное изучение населения 0,1% населения Сахалинской вирус определено, что 68% из них были назначены в Caulimoviridae (рис. 2B). Три больших Сахалинской внутри этой группы населения были определены с высоким подобия (е < 1 X 10-30) чтобы изолировать V17 ORF3 гена CaYMV (EF189148.1), тростниковый сахар бацилловидные вирус изолировать Batavia D, полный геном (FJ439817.1) и банан полоска CA вирус полный геном (KJ013511). Изучение трех Сахалинской, мы вручную присоединились два из них производят полнометражного вирус генома.
Мы сравнили Сахалинской длины генома вируса, производимые ДНК и РНК последовательности как взаимной эшафот чтобы подтвердить наличие двух полнометражных вирус геномов. Один полнометражный вирус геном 6,966 bp предварительно был назван Canna желтый крапчатости связанных вирус 1 (CaYMAV-1) (рис. 3А). Геном второй был 7,385 bp и вариант CaYMV, заражая Альпиния purpurata (CaYMV-Ap01) (рис. 3А).
Наконец праймеры PCR, которые были разработаны для клон ~ 1000 bp фрагмент каждого вируса, были использованы для дифференциально обнаружить оба геномов в популяции 227 Канна растений, представляющих девять коммерческих сортов. Во многих случаях отдельные растения были инфицированы обоих вирусов. Мы предоставляем пример обнаружения ПЦР-CaYMAV-1 и CaYMV-Ap01 в 12 растений. Три из них были положительными только для CaYMV-Ap01 и девять были позитивными для обоих вирусов (рис. 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Рисунок 1 : Подготовка нуклеиновой кислоты вируса и NGS рабочего процесса. Электрофорез 565 bp ПЦР фрагментов CaYMV геномов геля агарозы (A) (1,0%). Два продукты PCR были обнаружены в пробах, приготовленный из белых гранул (дорожки 1, 2), но не в образце зеленой Пелле (пер. 3). Положительный контроль (+) представляет собой продукт PCR, усиливается от зараженных растений ДНК, который был изолирован с помощью автоматизированных метода с участием стандартных парамагнитных целлюлозы частиц. Лейн L содержит лестница ДНК, используется в качестве стандарта для измерения размера полос линейной ДНК в образце полос. (B) пример частицы вируса, осмотрено просвечивающей электронной микроскопии в белые гранулы оправился от сырой фракционирование зараженных Канна листьев. (C) агарозы (0,8%) гель-электрофореза ДНК, оправился от зеленого (полоса 1) и белый (полоса 2) гранул что проверенные позитивные методом ПЦР в группе A. Красные и желтые точки рядом с пер 2 определить две полосы ДНК высокой молекулярной массой, которые происходят в белом фракции. Электрофорез всего РНК, восстановлены на основе столбцов РНК очищение геля агарозы (D) (1%). Лейн L содержит лестница ДНК, используется в качестве стандарта для измерения размера линейной полос в образце полос. Переулок 1-6 содержит РНК, изолированных от зараженных Канна листья, которые были объединены в один образец Рибо истощение и РНК след (E) схема конвейера изоляции нуклеиновых кислот, Библиотека подготовки, последовательности, contig Ассамблеи и геном вируса Открытие. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Рисунок 2 : Крона графики визуализации таксономических категорий Сахалинской. (A) диаграммы на слева показывает, изобилия и таксономические распределение Сахалинской, собранный из сырой вирус подготовки. Правый график изображает пропорции вирус Сахалинской, связанные с семьей Caulimoviridae , род Badnavirus и трех тесно связанных между собой видов. (B) на левой панели показывает, что обилие Сахалинской, производный от РНК seq на основе их таксономических распределения. Справа — граф, изображающие обилие Сахалинской населения Сахалинской вирус, связанные с семьей Caulimoviridae , род Badnavirus и трех тесно связанных между собой видов. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Рисунок 3 . Характеристика CaYMAV-1 и CaYMV-Ap01 геномов. (A) схематическое представление Canna желтый крапчатости связать вирус 1 (CaYMAV) и Канна желтый крапчатости вирус похож на геном, изолированный от Альпиния purpurata (CaYMV-Ap01). Нуклеотидной позиции 1-10 идентифицируется как начало генома и содержит типичные большинства badnavirus геномов сайт антикодонвстретил тРНК. Остановка и запуск позиции для перевода открытой чтении кадра (ORF) 1 и 2 являются смежными. Эти белки имеют неизвестные функции. ORF3 является polyprotein, содержащие цинковый палец (ZnF), протеазы (Pro), обратной транскриптазы (RT) и H РНКазы доменов. 3' poly(A) последовательность сигнала сохраняется для обоих геномов вируса. (B) ПЦР-анализ был проведен с использованием РНК, изолированный от инфицированных вирусом листья и грунтовки, которые обнаружить CaYMAV и CaYMV-Ap01. В том же населения 12 растений три были заражены CaYMV-Ap01 только, тогда как остальные были заражены CaYMAV и CaYMV-Ap01. (+) указывает положительный контроль и (-) указывает на отрицательный контроль. Эта цифра, воспроизводится/изменение от Wijayasekara и др. 24 с разрешения. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Объединяя анализ ДНК в добыче сырой вириона с анализом РНК от зараженных листьев, чтобы обнаружить новый вирус геномов

Здесь мы представляем новый подход для выявления вирусов растений с двойной нити ДНК геномов. Мы используем стандартные методы для извлечения ДНК и РНК из зараженных листьев и осуществлять секвенирование нового поколения. Инструменты bioinformatic собрать последовательности в Сахалинской, определить Сахалинской, представляющих геном вируса и назначить геномов таксономических групп.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Выделение и анализ генома Единого Вирионы использованием &quot;Единое геномики Вирус&quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-инфицированных мышей

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Новые методы для расширения регуляторных Т-клеток от ВИЧ-1-инфицированных

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Быстрое Анализ хромосомных аберраций в Mouse-лимфоцитов на PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Фенотипическая и функционального анализа активированных регуляторных Т-клеток, выделенных из хронического лимфоцитарного хореоменингита инфицированных вирусом мышей

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...