Name: combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Forskningen har finansierats av Oklahoma Center för befordran av vetenskap och teknik tillämpad forskning Program fas II AR 132-053-2; och av Oklahoma Institutionen för jordbruk specialitet grödor forskning Grant Program. Vi tackar Dr. HongJin Hwang och OSU bioinformatik Core Facility som stöddes av bidrag från NSF (EOS-0132534) och NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 och 5P20RR15564-03).

Författarna har något att avslöja.

Under de senaste åren en mängd metoder har använts för att studera växt virus biologisk mångfald i naturliga miljöer som omfattar berikande för virusliknande partiklar (VLP) eller virus specifika RNA eller DNA2,3,44, 45,46 . Dessa metoder följs av NGS och bioinformatisk analys. Målet med denna studie var att hitta kausala agenten av en vanlig sjukdom i en odlad växt. Sjukdomen uppgavs vara resultatet av ett okänt virus som har icke-höljebärande bacilliform partiklar, och som endast ett 565 bp fragment har varit klonade47. Denna information var tillräckligt för tidigare forskare hypotetiskt tilldela viruset till släktet Badnavirus i familjen Caulimoviridae. Medan tidigare rapporter hypotesen att canna mottle sjukdom i canna liljorna var resultatet av en enda badnavirus, använder det metagenomik synsätt som beskrivs i denna studie var vi fast beslutna att sjukdomen orsakades av två trevande badnavirus arter24. Styrka med en metagenome metod för att upptäcka kausala agenten av en sjukdom är således, att vi nu kan identifiera situationer där det kan finnas mer än en orsak.
Vår strategi som kombinerar DNA och RNA-sekvensering data är grundlig och visar också att resultaten med hjälp av två metoder gav konsekvent resultat och bekräftat förekomsten av två relaterade virus. Vi anställda ett modifierat förfarande för isolering av caulimoviruses och producerat ett prov som var berikad för virus associerade nukleinsyror och som skyddades inom virus kapsid. En service laboratory kontrakterades för att genomföra DNA-sekvensering. Det grundläggande konceptet för de novo sekvensering är att DNA-polymeras inlemmar den fluorescerande märkt nukleotider i en DNA mall strand under sekventiell cykler av DNA-syntes. Contigs monterade följt av NGS lämnades in till ett bioinformatiska arbetsflöde producerar några contigs som identifierades som virus contigs. Ytterligare bekräftelse av två virus genomen10,24,48,49,50 erhölls genom bioinformatiska analyser av RNA-seq uppgifter som erhållits från ribo-utarmat RNA preparat. Ett intressant resultat var att lära sig att populationerna av sekvenser återkrävas av DNA och RNA-sekvensering föreskrivs liknande distributioner av icke-virala och viral nukleinsyra. För DNA och RNA-sekvensering var < 0.5% av sekvenser av virus ursprung. Inom befolkningen av virus sekvenser 78-82% tillhörde familjen Caulimoviridae. Genom att jämföra den monterade virus contigs från DNA och RNA-sekvensering, bekräftade vi att två monterade genomen inträffade i både datamängder.
Ett bekymmer med att använda endast DNA-sekvensering för att identifiera nya virus genomen är att badnavirus genomet är en öppen cirkulär DNA. Vi anade att sekvenser överlappande diskontinuiteter i genomet kan utgöra hinder för genomet montering från contigs. Första undersökning av DNA sekvensering resultatet visade två liknande virus arvsmassa. Vi hade en hypotes att dessa genomen antingen representerade genetiska mångfalden av arter som inte har studerats, eller representerade två arter Co infektera samma växt24. Därför, den kollektiva bioinformatiska analysen av datamängder som erhålls genom NGS DNA och RNA-sekvensering, aktiverat bekräftelse av förekomsten av två fullängds genomer.
Det finns en annan rapport som utvecklat en alternativ metod för att extrahera VLP och nukleinsyra från växten homogenates för gjorts studier, utifrån rutiner att återvinna DNA från blomkålsmosaikviruset (CaMV; en caulimovirus)3. Denna strategi identifieras roman RNA och DNA-virus sekvenser i icke-odlade växter. De steg som härrör från förfarandet caulimovirus isolering används i denna studie för att upptäcka kausala agenten en sjukdom av kulturväxter är till skillnad från stegen härrör för att extrahera VLP från naturligt infekterade plantor24. Framgången för båda ändrade metoderna föreslår att förfarandet för caulimovirus isolering kan vara en värdefull utgångspunkt för gjorts studier av växten virus i allmänhet.

Framväxande växtsjukdomar kör forskare att utveckla nya verktyg för att identifiera den rätta kausala medel. Första rapporterna om nya eller återkommande virussjukdomar baseras på vanligt förekommande symtom såsom mosaik och missbildningar av leaf, ven clearing, dvärgväxt, vissnande, lesioner, nekros, eller andra symtom. Standarden för rapportering ett nytt virus som kausala agenten för en sjukdom är att skilja det från andra kontaminerande patogener, sprida det i lämplig värd och återskapa sjukdomen genom ympning till friska plantor av den ursprungliga värd-arten. Begränsningen i denna strategi är att många släkten växt virus är beroende av en insekt eller andra vektorer för överföring till en lämplig värd eller tillbaka till den ursprungliga värdart. I detta fall sökandet efter lämplig vektorn kan förlängas, det kan finnas svårigheter att fastställa laboratorium kolonier av vektorn och ytterligare ansträngningar är nödvändiga för att utarbeta ett protokoll för experimentell överföring. Om förutsättningarna för framgångsrik laboratoriestudier överföring inte kan uppnås, då underskrider arbetet standarden för rapportering en ny virus-sjukdom. För virus som förekommer i deras naturliga värdar på mycket låga titrar, måste forskarna identifiera alternativa värdar för förökning för att upprätthålla tillräckliga smittsamma lager för att bedriva forskning. Detta kan också vara ett hinder för växande lager kulturer1för virus arter som infekterar endast några växter.
Under senare år har anställer forskare oftare hög genomströmning NGS och gjorts metoder för att upptäcka virus sekvenser som finns i miljön, som kan finnas orelaterade till en känd sjukdom, men kan tilldelas taxonomiska arter och släkten 2 , 3 , 4. sådana strategier för upptäckten och kategorisering av genetiskt material i en distinkt miljö ger ett sätt att beskriva virus mångfald i naturen eller deras närvaro i vissa ekosystem men inte nödvändigtvis bekräftar att en ram för att fastställa kausala agenter för en uppenbar sjukdom.
Släktet Badnavirus tillhör familjen Caulimoviridae av pararetroviruses. Dessa virus är bacilliform i form med cirkulär double strand DNA genomen hos cirka 7 till 9 kb. Alla pararetroviruses replikera genom intermediär RNA. Pararetroviruses finns som episomes och replikera oberoende av växten kromosomala DNA5,6. Fältstudier av virus populationer indikerar att dessa virus populationer är genetiskt komplexa. Dessutom har uppgifter som erhållits inom ett spektrum av anläggningen genom hög genomströmning sekvensering upptäckt många exempel på badnavirus genomet fragment infogas av oäkta integration händelser i anläggningen genomen. Dessa endogena badnavirus sekvenser är inte nödvändigtvis förknippade med infektion7,8,9,10,11. Därefter, användning av NGS att identifiera nya badnaviruses som kausala agenten av sjukdom kompliceras av delpopulationer mångfalden av episomal genom samt förekomsten av endogena sekvenser12,13.
Medan det finns inte en optimal pipeline för upptäckten av Roman pararetrovirus genomen, finns det två vanliga metoder att identifiera dessa virus som causal agenter för sjukdom. En metod är att berika för små RNA-sekvenser från infekterade blad och sedan montera dessa sekvenser för att rekonstruera den virus genome(s)14,15,16,17. En annan metod är rullande cirkel förstärkning (RCA) för att förstärka cirkulär DNA-virus genomen18. Framgången för RCA beror på åldern av bladet och virus titern i valda vävnaden. RCA-produkterna utsätts för begränsning matsmältningen och klonade in plasmider för direkt sekvensering19,20,21.
Canna gul mottle virus (CaYMV) är en badnavirus och beskrivs som etiologiska orsaken gul mottle sjukdomen i canna, även om endast ett 565 bp fragment av genomet har tidigare isolerats från infekterade cannas22. En internationell studie identifierat CaYMV i Alpinia purpurata (blommande ingefära; CaYMV-Ap)23. Målet med denna studie var att återfå fullständig badnavirus genomet sekvenser från infekterade canna liljorna. Vi beskriver ett protokoll för rening av virus från växten föroreningar, och sedan isolera virus-DNA från denna beredning och förbereda ett DNA-bibliotek för användning i NGS. Denna strategi eliminerar behovet av mellanliggande molekylär förstärkning steg. Vi isolerar också mRNA från infekterade plantor för RNA-följande punkter NGS, vilket inkluderar RNA-seq utfördes med tillredningen nukleinsyra. Monterade contigs konstaterades för att relatera till det Badnavirus taxonet i både datamängder med nationellt centrum för bioteknik och Information (NCBI) grundläggande lokal justering sökverktyg för nukleinsyror (BLASTn). Vi identifierat genomen hos två badnavirus arter24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:368px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich St. Louis MO</td>
			<td style="width:133px;">S5976</td>
			<td style="width:440px;">Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">S0751</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:368px;">Na2SO3</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher Waltham, MA</td>
			<td style="width:133px;">28790</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">urea</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">PB169-212</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">X-100</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:168px;">VWR Radnor, PA</td>
			<td>21910-107</td>
			<td>Filter homogenate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP152-5</td>
			<td>Pellet resuspension&#38; DNA resuspension buffers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">MgCl2</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum, Gardena, CA</td>
			<td style="width:133px;">M1035</td>
			<td>Pellet resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum</td>
			<td style="width:133px;">E1045</td>
			<td>Stops enzyme reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">25530</td>
			<td>DNA resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">phenol:chloroform:isoamylalcohol&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">P2069</td>
			<td>Dissolve virion proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DNAse I</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M6101</td>
			<td>Degrade cellular DNA from extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">6B-100</td>
			<td>Virus DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Laboratory blender</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>58984-030</td>
			<td>Grind leaf samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">Floor model ultracentrifuge&#160; &#38;Ti70 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter, Irving TX&#160;</td>
			<td style="width:133px;">A94471</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:368px;">Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">369001</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">75876-022</td>
			<td>Mixing urea into samples overnight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Rubber policeman</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">470104-462</td>
			<td>Dissolve virus pellet</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">&#160;2100 bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:168px;">Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td>
			<td style="width:133px;">G2939BA</td>
			<td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td>
			<td></td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td>
			<td></td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">ND-2000</td>
			<td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plant total RNA isolation kit</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">STRN50-1KT</td>
			<td>Isolate RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>10128-514</td>
			<td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">RNA concentrator spin column</td>
			<td style="width:168px;">Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td style="width:133px;">R1013</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">rRNA removal kit</td>
			<td style="width:168px;">Illumina, San Diego, CA</td>
			<td style="width:133px;">MRZPL116</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">12321D</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">&#160;RNA&#160; enrichment system</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td style="width:133px;">7277300001</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">16500100</td>
			<td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">15585011</td>
			<td>Agarose gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pGEM-T +JM109 competent cells</td>
			<td style="width:168px;">Promega, Madison, WI</td>
			<td style="width:133px;">A3610</td>
			<td>Clone genome fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pFU Taq polymerase</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M7741</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dNTPs</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">U1511</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">PCR oligonucleotides</td>
			<td style="width:168px;">IDT, Coralvill, IA</td>
			<td style="width:133px;">Custom order</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Miniprep DNA purification kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A1330</td>
			<td style="width:440px;">Plasmid DNA purification prior to sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A9281</td>
			<td style="width:440px;">Prepare PCR products for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">pDRAW32 software</td>
			<td style="width:168px;">ACAClone</td>
			<td></td>
			<td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">MEGA6.0 software</td>
			<td style="width:168px;">MEGA</td>
			<td></td>
			<td>Molecular evolutionary genetics analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Primer 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Simgene.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT&#8482; RiboGreen&#8482; RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td>Fluorometric determination of RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior&#8482; pyrosequencing System</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5526337001</td>
			<td>Sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996520001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996490001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996538001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Oil &#38; Breaking Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996511001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996554001</td>
			<td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996619001</td>
			<td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IKA Turrax mixer</td>
			<td></td>
			<td>3646000</td>
			<td>Special mixer used with Turrax Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td>
			<td></td>
			<td>20003213</td>
			<td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Nebulizers Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5160570001</td>
			<td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior emPCR Bead Counter</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 635 001</td>
			<td>Library bead counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Bead Deposition Device</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 473 001</td>
			<td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Counterweight &#38; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 889 103 001</td>
			<td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Software</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 643 001</td>
			<td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Run Processor v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS De Novo Assembler v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Reference Mapper v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

Detta metagenome tillvägagångssätt används för att identifiera bildregistreringar och växt virus med cirkulära DNA-genomet. Ofta växt DNA virus som förekommer i låga titrar i deras mottagande eller inte ympas mekaniskt till en annan värd är svåra att propagera för att uppnå en större titer av smittsamt material. Infekterade bladen mals i en mild buffert med optimalt pH och Joniska sammansättning rekommenderas för rening av de flesta bacilliform Para retrovirus. Urea används för att bryta upp organ i inkludering som fälla virioner och att upplösa cellulära komponenter. Differentiell centrifugering ger ytterligare separation av virioner från växten föroreningar. Sedan avlägsnar proteinas K behandling förhoppningsvis. Sedan är den virala DNA koncentrerad och används för nästa generations sekvensering (NGS). NGS data används för att montera contigs som lämnas till NCBI-BLASTn att identifiera en delmängd av virus sekvenser i genererade datamängden. I en parallell rörledning är RNA isolerade från infekterade blad med en standard kolumnbaserade RNA extraktion metod. Sedan utförs Ribosomen utarmning för att berika för en delmängd av mRNA och virus avskrifter. Monterade sekvenser härrör från RNA sekvensering (RNA-seq) överlämnades till NCBI-BLASTn att identifiera en delmängd av virus sekvenser i den här datauppsättningen. I vår studie har identifierat vi två relaterade fullängds badnavirus genomen i två datamängder. Denna metod är att föredra en annan gemensam strategi som extraherar den sammanlagda befolkningen av små RNA-sekvenser för att rekonstituera växt virus genomsekvenser. Denna sistnämnda gjorts pipeline återvinner virus relaterade nummerserier som är retro-transkribera element infogas i växten genomet. Detta är kopplat till biokemiska eller molekylära analyser att ytterligare urskilja de aktivt smittämnen. Den strategi som dokumenteras i denna studie, återvinner sekvenser representant replikera virus som sannolikt visar aktiv virusinfektion.

Denna modifierade viruset reningsmetod som tillhandahålls en anrikning av virus DNAs användbara för att identifiera två virus arter av NGS och bioinformatik. Efter Homogenatet var centrifugeras vid 40 000 x g för 2,5 h, fanns det en grön pellets på botten av röret och en vit pellet längs längden. Den gröna pelleten var resuspended i en mikrocentrifug rör och vita pelleten var resuspended i två mikrocentrifugrör. PCR utfördes med hjälp av standard CaYMV PCR diagnostiska primers och produkter upptäcktes i solubilized vita pelleten och inte gröna pelleten (figur 1A). Ett prov av rå preparatet undersöktes av transmissionselektronmikroskopi och vi observerade bacilliform partiklar mäta 124-133 nm i längd (figur 1B). Detta är inom förutsedda modala längden på de flesta badnaviruses. DNA var utvinns ur de vita och gröna pelletarna och resuspended separat. I figur 1C, vi lastade 5 µL av DNA extraheras från gröna och vita pellet prov (1,6 µg av DNA för den gröna delen) och 3,1 µg DNA för den vita fraktionen till 0,8% agaros gel elektrofores och analyserat DNA efter etidiumbromid färgning. Den gröna delen innehöll låg molekylvikt DNA medan den vita fraktionen producerat två band av högre molekylvikt DNA, samt den lägre molekylvikten DNA (figur 1C). Den gel som presenteras i figur 1C kördes för 40 min vid 100 V och utstryket i lane 3 föreslår att gel spänningen sänkas till producera tydligare band. Dessa data tyder på att den vita pelleten berikas för virioner. DNA (0,6 µg/mL) koncentrationen utvinns ur vita provet var låg, men tillräcklig för NGS, som kräver ett minimum av 10 ng DNA att gå vidare. Fragmenterade DNAs användes för att förbereda ett bibliotek för NGS.
Parallellt extraherades RNA från infekterade canna växter (figur 1D) för hög genomströmning RNA-följande punkter Ett standardarbetsflöde genomfördes för bibliotek förberedelse, NGS, skapa contigs och identifierar virusgenom sekvenser (figur 1E). Utdata resultaten från med hjälp av DNA och RNA som utgångsmaterial jämfördes.
Vi fick 188,626 raw DNA-läsningar av NGS använder DNA isolerade från rå virus förberedelse. Läsningar monterades i 13,269 contigs och BLASTn användes för att söka NCBI datamängden av nukleotidsekvenser (med Viridplantae TaxID: 33090 och Virus TaxID: 10239 som de begränsande organismerna) (figur 1E). NCBI-BLASTn resultaten avslöjade att 93% av de novo monteras contigs var cellulära sekvenser, 22% var okända, och 0,3% var virus contigs (figur 2A). Majoriteten av contigs kategoriseras som cellulära sekvenser identifierades som mitokondrie eller kloroplast DNA. Inom datamängden av virus contigs, 32% av de virus contigs var relaterade till medlemmar i Caulimoviridae (som inte var Badnavirus sekvenser) och 58% av dessa var relaterade till Badnavirus. Av de virus contigs, 29% var mycket liknande (e < 1 x 10-30) till CaYMV isolera V17 ORF3 gen (EF189148.1), sockerrör bacilliform virus isolera Batavia D, komplett genomet (FJ439817.1), och Banana strimma CA virus slutföra genomet ( KJ013511). Inom denna population fanns det långa contigs som liknade två fullängds genomer.
Hög genomströmning RNA-seq producerade 153,488 rengjorda enskilda sekvens läser med i genomsnitt läsa < 500 bp. Contig montering längd minskas detta till 8,243 contigs. Dessa överlämnades till NCBI-BLASTn (använder Viridplantae TaxID: 33090 och Virus TaxID: 10239 som de begränsande organismerna) och utgångarna placerats 76% av contigs i en kategori av växten cellulära sekvenser, 23% var okänd, och 0,1% var Kategoriserad som virus contigs ( Figur 2 B). närmare granskning av befolkningen av 0,1% befolkningen av viruset contigs fastställs att 68% av dessa tilldelades till Caulimoviridae (bild 2B). Tre stora contigs inom denna population identifierades med hög likheten (e < 1 X 10-30) till CaYMV isolera V17 ORF3 gen (EF189148.1), sockerrör bacilliform virus isolera Batavia D, komplett genomet (FJ439817.1) och Banana strimma CA-virus komplett genomet (KJ013511). Att granska de tre contigs gick vi manuellt två av dessa att producera en fullängds virusgenom.
Vi jämförde den virus arvsmassa längd contigs producerad av DNA och RNA-sekvensering som en ömsesidig byggnadsställning till förekomsten av två fullängds virus arvsmassa. Ena hellångt virusgenom av 6 966 bp hette preliminärt Canna gul mottle associerade virus 1 (CaYMAV-1) (figur 3A). Det andra genomet var 7.385 bp och en variant av CaYMV som infekterar Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (figur 3A).
Slutligen användes PCR primers som var avsedda att klon ~ 1000 bp fragment av varje virus differentially upptäcka båda arvsmassan i en population av 227 canna växter som representerar nio kommersiella sorter. I många fall var enskilda växter infekterade med båda virusen. Vi ger ett exempel på RT-PCR-detektion av CaYMAV-1 och CaYMV-Ap01 i 12 växter. Tre av dessa var positiva endast för CaYMV-Ap01 och nio var positiva för både virus (figur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Figur 1 : Virus nukleinsyra preparat och NGS arbetsflödet. (A) agaros (1,0%) gel elektrofores av 565 bp PCR-fragmenten av CaYMV genom. Två PCR produkter upptäcktes i prover beredd från vita pelleten (körfält 1, 2) men inte i gröna pellet provet (lane 3). Positiv kontroll (+) representerar en PCR produkt amplifierats från smittade anläggningen DNA som isolerades med hjälp av en automatisk metod som inbegriper standard paramagnetiska cellulosa partiklar. Lane L innehåller DNA stege används som standard för att mäta storleken på linjära DNA band i provet körfält. (B) exempel på virus partikel ses av transmissionselektronmikroskopi i vit pelleten återkrävas av rå fraktionering av infekterade canna blad. (C) agaros (0,8%) gel elektrofores av DNA som återhämtat sig från gröna (lane 1) och vit (lane 2) pellets som testat positivt med PCR i panelen A. Röda och gula prickar bredvid lane 2 identifiera två hög molekylvikt DNA band som uppstår i det vita bråket. (D) agaros (1%) gel elektrofores av total-RNA återvinns genom kolumnbaserade RNA rening. Lane L innehåller DNA stege används som standard för att mäta storleken på linjär band i provet körfält. Lane 1-6 innehåller RNA isoleras från infekterade canna blad som var samman till ett enda prov för ribo- och RNA-följande punkter (E) Schematisk pipeline av nukleinsyra isoleringar, bibliotek förberedelse, sekvensering, contig församling och virusgenom upptäckten. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Figur 2 : Kronan diagram visualisera de taxonomiska grupper av contigs. (A) diagrammet till vänster visas på överflöd och taxonomiska distribution av contigs monteras från rå virus förberedelse. Rätt diagramtyp skildrar proportionerna av viruset contigs associerade med familjen Caulimoviridae , Badnavirus släkte och tre nära besläktade arter. (B) panelen till vänster visar överflödet av contigs härrör från RNA-seq baserat på deras taxonomiska fördelning. Till höger är grafen som skildrar överflödet av contigs inom befolkningen av viruset contigs associerade med familjen Caulimoviridae , Badnavirus släkte och tre nära besläktade arter. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Figur 3 . Karakterisering av CaYMAV-1 och CaYMV-Ap01 genomen. (A) schematisk representation av Canna gul mottle associera virus 1 (CaYMAV) och Canna gul mottle virus liknar genomet isolerade från Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nukleotid positioner 1-10 identifieras som början av genomet och innehåller en tRNAuppfyllda anticodon webbplats typiska för de flesta badnavirus genomen. Stopp och start positionerna för översättning av öppen läsning ram (ORF) 1 och 2 är intilliggande. Dessa proteiner har okända funktioner. ORF3 är ett polyprotein innehållande zink finger (ZnF), proteashämmare (Pro), omvänt transkriptas (RT) och RNAse H domäner. En 3' poly(A) signal sekvens är bevarad för båda virus arvsmassa. (B) RT-PCR-analys utfördes med RNA isoleras från virus infekterade blad och primers som upptäcker CaYMAV och CaYMV-Ap01. I samma population av 12 växter, var tre infekterade med CaYMV-Ap01 endast, medan resterande var infekterade med både CaYMAV och CaYMV-Ap01. (+) indikerar positiv kontroll och (-) anger negativ kontroll. Denna siffra är reproduceras/modifierat från Wijayasekara et al. 24 med tillstånd. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Att kombinera analys av DNA i en rå Virion extraktion med analysen av RNA från infekterade blad att upptäcka nya Virus arvsmassa

Här presenterar vi en ny metod för att identifiera växten virus med dubbel-strand DNA genomen. Vi använder standardiserade metoder att extrahera DNA och RNA från infekterade blad och genomföra nästa generations sekvensering. Bioinformatiska verktyg montera sekvenser i contigs, identifiera contigs som representerar virus arvsmassa och tilldela genomen taxonomiska grupper.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolering och Genome Analys av Single Virioner använder &quot;enda virus Genomics &#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolering och analys av Brain-binds Leukocyter från<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infekterade möss

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nya verktyg för att expandera reglerande T-celler från HIV-1-infekterade individer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Snabb analys av kromosomavvikelser hos mus B lymfocyter från PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotypisk och funktionell analys av aktiverade regulatoriska T-celler isolerade från kronisk lymfatisk koriomeningitvirus-infekterade möss

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...