Name: combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Araştırma bilim ilerleme ve teknoloji uygulanan araştırma programı faz II AR 132-053-2 için Oklahoma Merkezi tarafından finanse edildi; ve tarım özel bitkileri Oklahoma departmanı tarafından hibe programı araştırma. Biz Dr HongJin Hwang ve OSU Biyoinformatik çekirdek tesisi olan NSF (EOS-0132534) ve NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 ve 5P20RR15564 / 03) gelen hibe tarafından desteklenen teşekkür ederim.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Son yıllarda çeşitli yöntemler istihdam bitki virüs biyoçeşitlilik virüs benzeri parçacıklar (VIP) ya da virüs belirli RNA veya DNA2,3,44için zenginleştirici içeren doğal ortamlarda çalışmaya, 45,46 . Bu yöntemler NGS ve bioinformatic analiz tarafından takip edilmektedir. Bu çalışmanın amacı ekili fabrikasında ortak bir hastalık nedensel Ajan bulmaktı. Hastalık bu sigara zarflı bacilliform parçacıklar vardır ve yalnızca bir 565 bp parçası klonlanmış47olduğu bilinmeyen bir virüs sonucu olduğu bildirildi. Bu bilgi kuramsal olarak Caulimoviridaeaile içinde cins Badnavirus virüs atamak önceden araştırmacılar için yeterli oldu. Önceki raporlar canna lilyum canna mottle hastalığında bu çalışmada, özetlenen metagenomics yaklaşımı kullanarak tek bir badnavirus sonucuydu onaylanmadığına karar ise hastalık iki geçici badnavirus türler24tarafından neden olduğu belirledi. Böylece, biz şimdi durumlar belirleyebilir bir hastalık nedensel Ajan keşfetmek için bir metagenome yaklaşımı kullanmanın gücü olduğunu yerde birden fazla nedeni olabilir.
DNA ve RNA sıralama veri birleştirerek yaklaşımımız kapsamlı olduğunu ve ayrıca iki yaklaşım kullanarak sonuçları tutarlı sonuçlar vermiştir ve iki ilgili virüs varlığını doğruladı. Biz caulimoviruses yalıtım için değiştirilmiş bir yordam istihdam ve bu ilişkili virüs nükleik asitler için zenginleştirilmiş ve bu virüs kapsid içinde korunan bir örnek üretti. Bir hizmet laboratuar DNA sıralama dışarı taşımak için sözleşme imzalamıştı. Temel de novo sıralama için bu DNA polimeraz nükleotit bir DNA şablon iplik DNA sentezi sıralı döngüsü sırasında etiketli floresan içerir bir kavramdır. Contigs monte takip NGS tarafından virüs contigs tespit edilmiştir birkaç contigs üreten bir bioinformatic iş akışı içine sunuldu. Doğrulanmadı iki virüs genleri10,24,48,49,50 bioinformatic Analizi ribo tükenmiş RNA ürünleri alınan RNA-seq veri ile elde edildi. Bir ilginç sonuç dizileri nüfus DNA ve RNA sıralama tarafından kurtarılan öğrenmek için çıktı bu benzer viral sigara ve viral nükleik asitleri dağılımları sağlanan. DNA ve RNA sıralama için < %0,5 sıralarının virüs kökenli idi. Virüs dizileri 78-%82 Caulimoviridaeailesine ait nüfus içinde. DNA ve RNA sıralama üzerinden birleştirilmiş virüs contigs karşılaştırarak, iki monte genleri her iki veri kümelerini meydana geldiğini doğruladı.
Yeni virüs genleri tanımlamak için tek DNA sıralama kullanarak bir endişe badnavirus genom açık bir dairesel DNA olmasıdır. Süreksizliklerin genom içinde üst üste dizileri contigs genom derleme için engel mevcut olabilir tahmin edebilmiş. DNA sıralama sonuçlarının ilk sınav iki benzer virüs genleri ortaya koydu. Biz bu genleri de değil okudu bir türün genetik çeşitlilik temsil olan veya24aynı ortak bulaşmasını temsil iki tür bitki. Bu nedenle, toplu bioinformatic analiz NGS DNA ve RNA sıralamanın, tarafından elde edilen veri kümeleri iki tam uzunlukta genomları varlığı teyit etkin.
VIP ve nükleik asitler bitki homogenates metagenomic araştırmalar, DNA dan karnabahar mozaik virüsü (CaMV; bir caulimovirus)3kurtarmak için yordamlar dayalı çıkarma için alternatif bir Yöntem geliştiren başka bir rapordur. Bu yaklaşım Roman RNA ve DNA virüs olmayan ekili bitkiler serilerinde tespit edilmiştir. Doğal olarak enfekte bitkiler24VIP ayıklamak için türetilmiş adımları aksine bir hastalık ekili bitkiler nedensel Ajan keşfetmek için bu çalışmada kullanılan caulimovirus yalıtım yordamla elde adımlar vardır. Değiştirilmiş her iki yöntem başarısı caulimovirus yalıtım framework yordamı genel bitki virüs metagenomic çalışmalar için değerli bir başlangıç noktası olabileceğini düşündürmektedir.

Ortaya çıkan bitki hastalıklarının araştırmacılar doğru nedensel temsilcisi tanımlamak için yeni araçlar geliştirmek için sürücü. Yeni veya yinelenen virüs hastalıklarının başlangıç raporlarını mozaik ve yaprak, takas ven, cücelik, solan, lezyonlar, nekroz malformasyonlar gibi yaygın olarak karşılaşılan belirtiler veya diğer belirtiler üzerinde temel alır. Diğer bulaşıcı patojenler ayırmak için bir hastalık için nedensel ajan olduğu gibi yeni bir virüs raporlama için standart uygun konukçuda yaymak ve özgün ana bilgisayar türlerinin sağlıklı bitkiler aşı hastalık ürerler. Bu yaklaşımda bitki virüslerin birçok cins bir böcek ya da diğer vektörleri iletim uygun bir ana bilgisayar veya yeniden özgün ana türler için üzerine bağlıdır kısıtlamadır. Bu durumda, uygun vektör için arama uzun, Yöneyin laboratuar koloniler kurmak için zorluklar olabilir ve daha fazla çabaları bir protokol deneysel iletimi için hazırlamak gereklidir. Eğer başarılı laboratuar iletim çalışmaları için koşullar elde çalışma yeni bir virüs hastalık raporlama için standart kısa düşüyor. Çok düşük titreleri doğal onların ana oluşan virüs olarak araştırmacılar araştırma taşımak için yeterli bulaşıcı hisse senetleri korumak için alternatif hosts yayma için tanımlamanız gerekir. Sadece bir kaç bitki bulaştırmak virüs türler için bu da hisse senedi kültürler1büyüyen için bir engel olabilir.
Son yıllarda, bilim adamları daha sık yüksek üretilen iş NGS ve metagenomic yaklaşımlar için bilinen bir hastalık ilgisiz bulunabilir, ancak taksonomik tür ve cins atanabilir çevre, mevcut virüs dizileri ortaya çıkarmak için istihdam olduğunu 2 , 3 , 4. bulma ve ayrı bir ortamda genetik materyallerin sınıflandırılması böyle yaklaşımlar virüs çeşitlilik doğanın ya da varlığı belirli bir ekosistem tanımlamak için bir yol sağlar, ancak mutlaka tanımlamak için bir çerçeve için onaylamak değil nedensel maddeleri için belirgin bir hastalık.
Badnavirus cins Caulimoviridae pararetroviruses ailesine ait. Bu virüsler bacilliform şekli ile dairesel Çift Kişilik iplikçik DNA genleri yaklaşık 7-9 KB vardır. Tüm pararetroviruses bir RNA orta yineler. Pararetroviruses episomes mevcut ve bitki kromozom DNA5,6bağımsız çoğaltmak. Saha çalışmaları virüs nüfusun bu virüs nüfus genetiği karmaşık olduğunu gösteriyor. Buna ek olarak, bir bitki genom aralığında yüksek işlem hacmi sıralama tarafından elde edilen bilgileri gayri meşru tümleştirme olaylar tarafından bitki genleri eklenen badnavirus genom parçaları sayısız örnekleri ortaya. Bu endojen badnavirus dizilere mutlaka enfeksiyon7,8,9,10,11ile ilişkili değildir. Daha sonra yeni badnaviruses hastalığı nedensel ajan olarak tanımlamak için NGS kullanımı episomal genleri subpopulation çeşitliliği yanı sıra endojen dizileri12,13oluşumunu karmaşıktır.
Roman pararetrovirus genleri keşfi için değil bir en uygun potansiyel varken, bu virüs hastalığı için nedensel ajanı olarak tanımlamak için iki genel yaklaşım vardır. Virüslü yaprakları küçük RNA sıralarının zenginleştirmek ve virüs genome(s)14,15,16,17yeniden oluşturmak için bu dizilere araya bir yöntemdir. Çalışırken daire amplifikasyon (RCA) dairesel DNA virüs genleri18yükseltmek için başka bir yaklaşımdır. RCA başarısı yaş yaprak ve virüs titresi seçilen doku bağlıdır. RCA ürünleri kısıtlama sindirim için tabi ve plazmidler için19,20,21sıralama doğrudan içine klonlanmış.
Canna sarı mottle virüs (CaYMV) bir badnavirus olduğunu ve sadece bir 565 bp parçası genom virüslü cannas22daha önce izole olmasına rağmen canna, sarı mottle hastalığının etyolojik neden olarak tanımlanıyor. Çağdaş bir çalışma Alpinia purpurata (çiçekli zencefil; CaYMV tespit CaYMV-Ap)23. Bu çalışmanın amacı tam badnavirus genom dizileri virüslü canna lilyum kurtarmak için oldu. Biz virüs--dan bitki kirletici arındırıcı ve bu hazırlık üzerinden viral DNA izole eden bir protokol tanımlamak ve DNA kitaplığa NGS kullanmak için hazırlamak. Bu yaklaşım ara moleküler amplifikasyon adımları gereksinimini ortadan kaldırır. Biz de RNA-seq. NGS için virüslü bitkilerden mRNA izole olan RNA-seq içerir her nükleik asit hazırlık kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Monte contigs Badnavirus takson nükleik asit (BLASTn) için Biyoteknoloji ve bilgi (NCBI) temel yerel hizalama arama aracı için Ulusal Merkezi kullanarak her iki DataSet'lerdeki ile arasında bir ilişki bulunamadı. Biz iki badnavirus türler24genleri tespit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:368px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich St. Louis MO</td>
			<td style="width:133px;">S5976</td>
			<td style="width:440px;">Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">S0751</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:368px;">Na2SO3</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher Waltham, MA</td>
			<td style="width:133px;">28790</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">urea</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">PB169-212</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">X-100</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:168px;">VWR Radnor, PA</td>
			<td>21910-107</td>
			<td>Filter homogenate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP152-5</td>
			<td>Pellet resuspension&#38; DNA resuspension buffers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">MgCl2</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum, Gardena, CA</td>
			<td style="width:133px;">M1035</td>
			<td>Pellet resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum</td>
			<td style="width:133px;">E1045</td>
			<td>Stops enzyme reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">25530</td>
			<td>DNA resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">phenol:chloroform:isoamylalcohol&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">P2069</td>
			<td>Dissolve virion proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DNAse I</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M6101</td>
			<td>Degrade cellular DNA from extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">6B-100</td>
			<td>Virus DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Laboratory blender</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>58984-030</td>
			<td>Grind leaf samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">Floor model ultracentrifuge&#160; &#38;Ti70 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter, Irving TX&#160;</td>
			<td style="width:133px;">A94471</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:368px;">Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">369001</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">75876-022</td>
			<td>Mixing urea into samples overnight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Rubber policeman</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">470104-462</td>
			<td>Dissolve virus pellet</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">&#160;2100 bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:168px;">Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td>
			<td style="width:133px;">G2939BA</td>
			<td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td>
			<td></td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td>
			<td></td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">ND-2000</td>
			<td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plant total RNA isolation kit</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">STRN50-1KT</td>
			<td>Isolate RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>10128-514</td>
			<td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">RNA concentrator spin column</td>
			<td style="width:168px;">Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td style="width:133px;">R1013</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">rRNA removal kit</td>
			<td style="width:168px;">Illumina, San Diego, CA</td>
			<td style="width:133px;">MRZPL116</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">12321D</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">&#160;RNA&#160; enrichment system</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td style="width:133px;">7277300001</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">16500100</td>
			<td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">15585011</td>
			<td>Agarose gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pGEM-T +JM109 competent cells</td>
			<td style="width:168px;">Promega, Madison, WI</td>
			<td style="width:133px;">A3610</td>
			<td>Clone genome fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pFU Taq polymerase</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M7741</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dNTPs</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">U1511</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">PCR oligonucleotides</td>
			<td style="width:168px;">IDT, Coralvill, IA</td>
			<td style="width:133px;">Custom order</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Miniprep DNA purification kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A1330</td>
			<td style="width:440px;">Plasmid DNA purification prior to sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A9281</td>
			<td style="width:440px;">Prepare PCR products for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">pDRAW32 software</td>
			<td style="width:168px;">ACAClone</td>
			<td></td>
			<td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">MEGA6.0 software</td>
			<td style="width:168px;">MEGA</td>
			<td></td>
			<td>Molecular evolutionary genetics analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Primer 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Simgene.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT&#8482; RiboGreen&#8482; RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td>Fluorometric determination of RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior&#8482; pyrosequencing System</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5526337001</td>
			<td>Sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996520001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996490001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996538001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Oil &#38; Breaking Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996511001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996554001</td>
			<td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996619001</td>
			<td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IKA Turrax mixer</td>
			<td></td>
			<td>3646000</td>
			<td>Special mixer used with Turrax Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td>
			<td></td>
			<td>20003213</td>
			<td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Nebulizers Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5160570001</td>
			<td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior emPCR Bead Counter</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 635 001</td>
			<td>Library bead counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Bead Deposition Device</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 473 001</td>
			<td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Counterweight &#38; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 889 103 001</td>
			<td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Software</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 643 001</td>
			<td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Run Processor v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS De Novo Assembler v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Reference Mapper v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

Bu metagenome yaklaşım dairesel DNA genleri ile bitki virüs ve onların transkript tanımlamak için kullanılır. Ev sahibi olarak düşük titreleri meydana veya mekanik olarak başka bir ana bilgisayara aşılamak değil sık sık bitki DNA virüsler bulaşıcı malzeme büyük bir titresi elde etmek için yaymak zordur. En uygun pH ve çoğu bacilliform Para retrovirüsler arıtma için önerilen iyonik bileşimi ile hafif bir tampon toprağa virüslü yapraklar. Üre virions tuzak dahil cesetleri kırmaya ve hücresel bileşenleri dağıtmak için kullanılır. Fark Santrifüjü daha fazla virions ayrılması bitki kirletici üzerinden sağlar. Sonra İndinavir K tedavi capsids kaldırır. Sonra viral DNA konsantre ve yeni nesil sıralama (NGS) için kullanılır. NGS veri virüs dizileri oluşturulan veri kümesi kümesini tanımlamak için NCBI-BLASTn için hangi gönderilmektedir contigs birleştirmek için kullanılır. Paralel bir boru hattı, RNA bir standart sütunlara göre RNA ayıklama yöntemi kullanarak enfekte yapraklarından izole edilmiştir. MRNA ve virüs tutanaklar bir alt için zenginleştirmek için ribozom tükenmesi sonra gerçekleştirilir. Birleştirilmiş dizileri (RNA-seq) sıralama RNA türetilmiş virüs serilerinde bu veri kümesi kümesini tanımlamak için NCBI-BLASTn için sunuldu. Bizim çalışmada, iki veri kümeleri içinde iki ilgili tam uzunlukta badnavirus genleri tespit edilmiştir. Bu yöntem bitki virüs genom dizileri reconstitute için toplam nüfusun küçük RNA dizilerinin ayıklayan başka bir ortak yaklaşım tercih edilir. Bu ikinci metagenomic boru hattı kurtarır virüs ile ilgili diziler bu retro transkripsiyonu öğeleri bitki genom eklenir. Bu daha da aktif enfeksiyöz ajanlar ayırt etmek biyokimyasal veya moleküler deneyleri için birleştirilmiştir. Bu çalışmada, belgelenen yaklaşım dizileri büyük olasılıkla etkin virüs enfeksiyonu gösteren virüsler çoğaltılıyor temsilcisi kurtarır.

Bu değiştirilmiş virüs arıtma yöntemi virüs DNA'lar NGS ve Biyoinformatik iki virüs türü tanımlamak için yararlı bir zenginleştirme sağlanan. Homogenate 40.000 x g 2,5 h için de centrifuged sonra tüp altındaki yeşil bir pelet ve uzunluğu boyunca beyaz bir Pelet vardı. Yeşil Pelet bir microcentrifuge tüp içine resuspended ve beyaz Pelet iki microcentrifuge tüpler içine resuspended. PCR standart CaYMV PCR tanılama primerler kullanılarak gerçekleştirildiği ve ürünleri solubilized beyaz Pelet ve değil yeşil Pelet (Şekil 1A) tespit edildi. Ham hazırlama örneği transmisyon elektron mikroskobu tarafından incelenmiş ve 124-133 nm uzunluğundadır (Şekil 1B) ölçme bacilliform partikülleri görülmektedir. Çoğu badnaviruses öngörülen kalıcı uzunluğu içinde bu. DNA beyaz ve yeşil çökeltilerini çıkarılan ve ayrı ayrı resuspended. Şekil 1C, biz 5 µL yeşil çıkarılan DNA'ın yüklü ve beyaz Pelet örnek (yeşil kısmı için DNA'ın 1.6 µg) ve DNA 3,1 µg beyaz kısmı için % 0,8 özel Elektroforez jel ve etidyum bromür takip DNA analiz boyama. Beyaz kesir daha yüksek molekül ağırlıklı DNA, hem de daha düşük moleküler ağırlıklı DNA (Şekil 1C) iki grup üretilen ise yeşil kesir düşük moleküler ağırlıklı DNA içerdiği. Şekil 1' deC sunulan jel 100 V 40 min için çalıştırıldı ve jel gerilim daha net bantları üretmek için düşürülmelidir şeritte 3 smear öneriyor. Bu verileri beyaz Pelet virions için zenginleştirilmiş göstermektedir. Beyaz örneğinden çıkarılan DNA (0.6 µg/mL) konsantrasyonu düşük ama yeterli için en az 10 gerektirir NGS ng devam etmek için DNA'ın. Parçalanmış DNA'lar bir kütüphane NGS için hazırlamak için kullanıldı.
Buna paralel olarak, RNA virüslü canna bitkilerden (Şekil 1D) yüksek üretilen iş RNA-devamı için ayıklandı Standart bir iş akışı için Kütüphane hazırlık, contigs oluşturma ve viral genom dizileri (Şekil 1E) tanımlayan NGS yapılmıştır. DNA ve RNA malzemeleri başlangıç olarak kullanarak çıkış sonuçları karşılaştırıldı.
Biz 188,626 ham DNA okuma NGS tarafından ham virüs hazırlık izole DNA'yı kullanarak elde. Okuma 13,269 contigs monte ve BLASTn NCBI veri kümesi nükleotit dizileri aramak için kullanılan (Viridplantae TaxID kullanarak: 33090 ve virüs TaxID: 10239 sınırlayıcı organizmalar olarak) (resim 1E). NCBI-BLASTn sonuçları monte de novo contigs % 93 hücresel dizileri vardı, % 22 bilinmeyen ve virüs contigs (resim 2A) % 0,3 olduğunu ortaya koydu. Contigs hücresel dizileri olarak mitokondriyal tespit edilmiştir olarak kategorize veya kloroplast DNA çoğunluğu. Virüs contigs veri kümesi içinde virüs contigs % 32 (yani Badnavirus dizileri edilmiştir), üyelerine Caulimoviridae ilgili olduğunu ve bunların % 58'i için ile ilgili Badnavirus. Virüs contigs, % 29 yaşına geldiğinde son derece benzer (e < 1 x 10-30)'e CaYMV izole V17 ORF3 gen (EF189148.1), şeker kamışı bacilliform virüs izole Batavia D, komple genom (FJ439817.1), ve muz çizgi CA virüs genomu (tamamlamak KJ013511). Bu nüfus içinde iki tam uzunlukta genleri andıran uzun contigs vardı.
Yüksek üretilen iş RNA-seq üretilen 153,488 temizlenmiş bireysel sıra okuma okuma < 500 bp. dokunma derleme uzunluğu ortalama ile bu 8,243 contigs için azaltılmış. Bunlar NCBI-BLASTn için sunuldu (Viridplantae TaxID kullanarak: 33090 ve virüs TaxID: 10239 sınırlayıcı organizmalar olarak) contigs % 76'bitki hücre dizileri, % 23 kategoride yer çıkışlarını bilinmeyen ve % 0.1 virüs contigs () kategorize Resim 2 B). virüs contigs % 0.1 nüfusunun nüfusun daha yakından incelendiğinde belirlenen bunlar % 68'i Caulimoviridae için (Şekil 2B) ayrıldı. Bu nüfus içinde üç büyük contigs yüksek benzerliği ile tespit edildi (e < 1 X 10-30) CaYMV ayrı tut moduyla V17 ORF3 gen için (EF189148.1), şeker kamışı bacilliform virüs izole Batavia D, komple genom (FJ439817.1) ve muz çizgi CA virüs komple genom (KJ013511). Üç contigs incelenmesi, biz el ile bu bir tam uzunlukta virüs genomu üretmek için iki katıldı.
Biz iki tam uzunlukta virüs genleri varlığını doğrulamak için karşılıklı bir iskele olarak DNA ve RNA sıralama tarafından üretilen virüs genomu uzunluğu contigs göre. 6,966 bir tam uzunlukta virüs genomu bp Canna sarı mottle ilişkili virüs 1 (CaYMAV-1) (Şekil 3A) geçici olarak seçildi. İkinci genom 7,385 yapıldı bp ve Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Şekil 3A) hastalık CaYMV bir türevi.
Son olarak, her virüs klon ~ 1000 bp parçası için tasarlanmış PCR astar differentially nüfusu 9 ticari türü temsil eden 227 canna bitkiler her iki genleri tespit etmek için kullanılmıştır. Birçok durumda bireysel bitkiler ile her iki virüs bulaşmış. Biz 12 bitkilerde CaYMAV-1 ve CaYMV-Ap01 RT-PCR tespiti için bir örnek sağlar. Bunlardan üçüydü sadece CaYMV-Ap01 için olumlu ve dokuz her iki virüs (Şekil 3B) olumlu idi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Resim 1 : Virüs nükleik asit ürünleri ve NGS iş akışı. (A)özel (% 1.0) Jel Elektroforez, 565 bp PCR parçacıkları CaYMV genleri. İki PCR ürünleri Beyaz Pelet (şerit 1, 2) hazırlanan örnekleri ama yeşil Pelet örnek (lane 3) tespit edildi. Pozitif kontrol (+) virüslü bitki standart paramagnetic selüloz parçacıkları içeren otomatik bir yöntem kullanarak izole DNA güçlendirilmiş bir PCR ürünü temsil eder. Lane L örnek yolları doğrusal DNA bantlarında boyutunu ölçmek için standart olarak kullanılan DNA merdiven içerir. (B) örneği virüs parçacık transmisyon elektron mikroskobu içinde virüslü canna yaprakları ham ayırma tarafından kurtarılan beyaz pelet tarafından görüldü. (C) özel (% 0.8) yeşil (lane 1) kurtarılan DNA'ın Elektroforez jel ve beyaz (lane 2) A. panelinde o test pozitif-PCR tarafından granül Lane 2 yanındaki kırmızı ve sarı nokta beyaz kesir ortaya iki yüksek molekül ağırlıklı DNA grup tanımlayın. (D) özel (% 1) jel elektroforez toplam RNA sütunlara göre RNA arıtma tarafından kurtarıldı. Lane L örnek Lanes doğrusal bantları boyutunu ölçmek için standart olarak kullanılan DNA merdiven içerir. Lane 1-6 dan havuza alınmış ribo tükenmesi ve nükleik asit izolasyonları, Kütüphane hazırlık, sıralama, dokunma derleme ve virüs genomu RNA-devamı (E) şematik boru hattı için tek bir örnek için virüslü canna yaprakları izole RNA içerir bir keşif. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Resim 2 : Contigs taksonomik kategorilerini görselleştirme Kronu grafikler. (A) grafik üzerinde bereket ve contigs taksonomik dağıtımı ham virüs hazırlık monte sol gösterir. Doğru grafik Caulimoviridae Aile, Badnavirus cins ve üç yakından ilişkili tür ile ilişkili virüs contigs oranlarını gösteriyor. (B) sol panelde RNA-seq türetilmiş contigs bolluk taksonomik dağılımı üzerinde merkezli gösterir. Sağ tarafta contigs Caulimoviridae Aile, Badnavirus cins ve üç yakından ilişkili tür ile ilişkili virüs contigs nüfusu içinde bolluk gösteren grafiktir. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Şekil 3 . CaYMAV-1 ve CaYMV-Ap01 genleri karakterizasyonu. Canna sarı mottle ilişkilendirmek virüs 1 (CaYMAV) ve Canna sarı mottle virüs --dan izole genom benzer grafiksel gösterimi(a) Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nükleotit konumları 1-10 genom başlangıç olarak tanımlanır ve bir tRNAtanışmadan antikodon sitesi en badnavirus genleri tipik içerir. Açık okuma çerçevesi (ORF) 1 ve 2 çeviri için durdurma ve başlangıç pozisyonları bitişiktir. Bu proteinler bilinmeyen var işlevleri. ORF3 çinko parmak (ZnF), proteaz (Pro), ters transkriptaz (RT) ve RNAse H etki alanlarını içeren bir polyprotein var. 3' Poli(a) sinyal sıra her iki virüs genleri için korunmuş. (B) RT-PCR analiz virüs bulaşmış yaprakları ve CaYMAV ve CaYMV-Ap01 tespit astar izole RNA kullanılarak gerçekleştirildi. Kalan enfekte ise CaYMAV ve CaYMV-Ap01 ile 12 bitkiler aynı topluluk içinde CaYMV-Ap01 ile üç sadece, bulaşmış. (+) pozitif kontrol gösterir ve (-) negatif kontrol gösterir. Bu rakam çoğaltılamaz/değiştirilmiş Wijayasekara vd. 24 iznine sahip. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...