Name: fluorescence live-cell imaging of the complete vegetative cell cycle of the slow-growing social bacterium myxococcus xanthus
Uploaded: 2018-06-20T14:45:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הגרמנית למחקר המועצה (DFG) במסגרת Transregio 174 "ייתכן הדינמיקה של תאים חיידקיים", חברת מקס פלנק.

<ol>
	<li>Shapiro, L., McAdams, H. H., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+and+how+bacteria+localize+proteins.">Why and how bacteria localize proteins.</a> Science. 326 (5957), 1225-1228 (2009).</li><li>Treuner-Lange, A., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+polarity+in+bacteria.">Regulation of cell polarity in bacteria.</a> J Cell Biol. 206 (1), 7-17 (2014).</li><li>Laloux, G., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+PopZ+localization+through+cell+cycle-coupled+multimerization.">Spatiotemporal control of PopZ localization through cell cycle-coupled multimerization.</a> J Cell Biol. 201, 827-841 (2013).</li><li>Rudner, D. Z., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+subcellular+localization+in+bacteria.">Protein subcellular localization in bacteria.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (4), 000307 (2010).</li><li>Badrinarayanan, A., Le, T. B. K., Laub, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromosome+organization+and+segregation.">Bacterial chromosome organization and segregation.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 31 (1), 171-199 (2015).</li><li>Munoz-Dorado, J., Marcos-Torres, F. J., Garcia-Bravo, E., Moraleda-Munoz, A., Perez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxobacteria:+Moving,+Killing,+Feeding,+and+Surviving+Together.">Myxobacteria: Moving, Killing, Feeding, and Surviving Together.</a> Front Microbiol. 7, 781 (2016).</li><li>Berleman, J. E., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+hunting+strategy+of+a+bacterial+wolfpack.">Deciphering the hunting strategy of a bacterial wolfpack.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (5), 942-957 (2009).</li><li>Konovalova, A., Petters, T., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+biology+of+Myxococcus+xanthus.">Extracellular biology of Myxococcus xanthus.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 89-106 (2010).</li><li>Nudleman, E., Wall, D., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+bacterial+outer+membrane+lipoproteins.">Cell-to-cell transfer of bacterial outer membrane lipoproteins.</a> Science. 309, 125-127 (2005).</li><li>Vassallo, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+polymorphic+toxins+delivered+by+outer+membrane+exchange+discriminate+kin+in+myxobacteria.">Infectious polymorphic toxins delivered by outer membrane exchange discriminate kin in myxobacteria.</a> eLife. 6, 29397 (2017).</li><li>Vassallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rejuvenation+and+social+behaviors+promoted+by+LPS+exchange+in+myxobacteria.">Cell rejuvenation and social behaviors promoted by LPS exchange in myxobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (22), 2939-2946 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharides+mediate+pilus+retraction+during+social+motility+of+Myxococcus+xanthus.">Extracellular polysaccharides mediate pilus retraction during social motility of Myxococcus xanthus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5443-5448 (2003).</li><li>Kim, S. K., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+alignment+required+in+differentiation+of+Myxococcus+xanthus.">Cell alignment required in differentiation of Myxococcus xanthus.</a> Science. 249, 926-928 (1990).</li><li>Lobedanz, S., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+C-signal,+a+contact+dependent+morphogen+coordinating+multiple+developmental+responses+in+Myxococcus+xanthus.">Identification of the C-signal, a contact dependent morphogen coordinating multiple developmental responses in Myxococcus xanthus.</a> Genes Dev. 17, 2151-2161 (2003).</li><li>Schumacher, D., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+polarity+in+motility+and+cell+division+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of cell polarity in motility and cell division in Myxococcus xanthus.</a> Annu Rev Microbiol. 71 (1), 61-78 (2017).</li><li>Schumacher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PomXYZ+proteins+self-organize+on+the+bacterial+nucleoid+to+stimulate+cell+division.">The PomXYZ proteins self-organize on the bacterial nucleoid to stimulate cell division.</a> Dev Cell. 41 (3), 299-314 (2017).</li><li>Treuner-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PomZ,+a+ParA-like+protein,+regulates+Z-ring+formation+and+cell+division+in+Myxococcus+xanthus.">PomZ, a ParA-like protein, regulates Z-ring formation and cell division in Myxococcus xanthus.</a> Mol Microbiol. 87 (2), 235-253 (2013).</li><li>Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+for+conditional+gene+expression+in+Myxococcus+xanthus+inducible+by+isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside+or+vanillate.">Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate.</a> J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).</li><li>Harms, A., Treuner-Lange, A., Schumacher, D., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+chromosome+and+replisome+dynamics+in+Myxococcus+xanthus.+reveals+a+novel+chromosome+arrangement.">Tracking of chromosome and replisome dynamics in Myxococcus xanthus. reveals a novel chromosome arrangement.</a> PLoS Genet. 9 (9), 1003802 (2013).</li><li>Iniesta, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParABS+system+in+chromosome+partitioning+in+the+bacterium+Myxococcus+xanthus.">ParABS system in chromosome partitioning in the bacterium Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 9 (1), 86897 (2014).</li><li>Lin, L., Osorio Valeriano, M., Harms, A., S&#248;gaard-Andersen, L., Thanbichler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactofilin-mediated+organization+of+the+ParABS+chromosome+segregation+system+in+Myxococcus+xanthus.">Bactofilin-mediated organization of the ParABS chromosome segregation system in Myxococcus xanthus.</a> Nat Commun. 8 (1), 1817 (2017).</li><li>Hodgkin, J., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+stimulation+of+movement+in+nonmotile+mutants+of+Myxococcus.">Cell-to-cell stimulation of movement in nonmotile mutants of Myxococcus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (7), 2938-2942 (1977).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+gliding+is+correlated+with+the+presence+of+pili+in+Myxococcus+xanthus.">Social gliding is correlated with the presence of pili in Myxococcus xanthus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (11), 5952-5956 (1979).</li><li>Miertzschke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+the+Ras-like+G+protein+MglA+and+its+cognate+GAP+MglB+and+implications+for+bacterial+polarity.">Structural analysis of the Ras-like G protein MglA and its cognate GAP MglB and implications for bacterial polarity.</a> EMBO J. 30 (20), 4185-4197 (2011).</li><li>Hodgkin, J., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+gliding+motility+in+Myxococcus+xanthus.+(Myxobacterales):+Two+gene+systems+control+movement.">Genetics of gliding motility in Myxococcus xanthus. (Myxobacterales): Two gene systems control movement.</a> Mol Gen Genet. 171, 177-191 (1979).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+and+experimental+analysis+of+proteins+of+two-component+systems+in+Myxococcus+xanthus.">Bioinformatics and experimental analysis of proteins of two-component systems in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 190 (2), 613-624 (2008).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354 (6349), 161-164 (1991).</li><li>Lutkenhaus, J., Pichoff, S., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cytokinesis:+From+Z+ring+to+divisome.">Bacterial cytokinesis: From Z ring to divisome.</a> Cytoskeleton. 69 (10), 778-790 (2012).</li><li>McLoon, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MglC,+a+Paralog+of+Myxococcus+xanthus+GTPase-Activating+Protein+MglB,+Plays+a+Divergent+Role+in+Motility+Regulation.">MglC, a Paralog of Myxococcus xanthus GTPase-Activating Protein MglB, Plays a Divergent Role in Motility Regulation.</a> J Bacteriol. 198 (3), 510-520 (2015).</li><li>Gomez-Santos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+set+of+integrative+plasmid+vectors+for+copper-inducible+gene+expression+in+Myxococcus+xanthus.">Comprehensive set of integrative plasmid vectors for copper-inducible gene expression in Myxococcus xanthus.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (8), 2515-2521 (2012).</li><li>Treuner-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+G-protein+MglA+connects+to+the+MreB+actin+cytoskeleton+at+bacterial+focal+adhesions.">The small G-protein MglA connects to the MreB actin cytoskeleton at bacterial focal adhesions.</a> J Cell Biol. 210 (2), 243-256 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

הדמיה לחיות תאים פלורסצנטיות הפך להיות כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה ייתכן של תאים חיידקיים. זריחה זמן לשגות מיקרוסקופיה של חיידקים הגדלים לאט ובטוח תאי כגון מ xanthus, עם זאת, כבר מאתגר, בוצעה רק עבור משך זמן קצר. כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשימוש וחזק עבור הדמיה לחיות תאים של מ xanthus על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ. שיטה זו מאפשרת למשתמש לעקוב אחר תאים וחלבונים fluorescently עם תוויות עבור מספר מחזורים של מחזור התא ברזולוציה של תא בודד.
מספר תנאים מוקדמים המשפיעים על ההצלחה של הדמיה לחיות תאים של גידול איטי מ xanthus תאים כולל: 1) משטח יציב עבור התא מצורף; 2) הזמינות של חומרים מזינים וחמצן; 3) קבוע חום ולחות; . ו-4) אופטימיזציה של תנאים ניסיוני כגון תדירות רכישת התמונה וזמן החשיפה.
ב הגדרת הניסוי שלנו, אנו משתמשים agarose עבה רפידות בתוספת חומרים מזינים. באמצעות רפידות עבה agarose לעומת microfluidic התקנים כדי לעקוב אחר תאים בודדים יש כמה יתרונות בסיסיים אבל גם מספר חסרונות. ראשית, משטח agarose לא רק מספק משטח עבור מ xanthus תא המצורף, תנועה אך גם מספיק חומרים מזינים לצמיחה לפחות 24 שעות. שנית, הצמד ירה ניתוח נפוץ ללמוד תאיים לוקליזציה של חלבונים fluorescently שכותרתו נעשה בעבר על אותו סוג של agarose רפידות16,17,29. לכן, הנתונים מניתוחי ירו snap ניתן ישירות להשוות נתונים שהושגו עם השיטה המתוארת כאן. שלישית, רפידות agarose ניתן בקלות לשנות, בתוספת אנטיביוטיקה או תוספי מזון אחרים כגון CuSO4 , vanillate זה משמשות עבור ג'ין ביטוי אינדוקציה18,30. בסופו של דבר, כי תאים מותר טופס microcolonies במהלך ניסוי, זה גם מאפשר ללמוד את השפעת האינטראקציות תאים תאים ישירה על הפרמטר מסוים שעוברים ניתוח. היבט זה חשוב במיוחד במקרה של מ xanthus בגלל חיידק זה מציג מספר האינטראקציות תלויי-הקשר. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא כי התנאים ניסיוני מוגדרות מראש לתקופת ניסוי. לעומת זאת, התקני microfluidic בדרך כלל מאפשרים שינוי התנאים ניסיוני במהלך ניסוי על-ידי הוספת למשל אנטיביוטיקה31.
חבילות תוכנה חופשית (למשל, MicrobeJ, Oufti) זמינים באופן אוטומטי לנתח את הצמיחה של תאים בודדים ולוקליזציה חלבון בתוך תאים בודדים. עם זאת, תוכנות אלה הן רק מתאים היטב הניתוח של תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים. לכן, זה נשאר אתגר לנתח באופן אוטומטי את הנתונים שהופקו עבור הקלטות 24 שעות המתוארים כאן.
לסיכום, אנו המתואר פרוטוקול קל לשימוש, לשחזור כדי לבצע הדמיה לחיות תאים עם איטי הגוברת מ xanthus חיידקים. אנו מראים כי רפידות agarose בתוספת חומרי מזון פשוטים מספיקים לקיים צמיחה לפחות 24 שעות וגם מאפשרים התבוננות וניתוח חלבון לוקליזציה צמיחה ברזולוציה של תא בודד לאורך כמה דורות.

תאים חיידקיים מאורגנים במרחב מאוד עם הרבה חלבונים לוקליזציה בצורה א-סימטרית בתוך תאים סלולריים1,2,3,4. לוקליזציה הזה הוא לעתים קרובות מאוד דינמי ומשתנה לאורך זמן בתגובה מחזור התא רמזים או אותות חיצוניים. באותה מידה, כרומוזום חיידקי במרחב מאוד מאורגן עם לוקוסים בודדים מיקומו למיקומים ספציפיים subcellular לפני ובמהלך תהליך ההפרדה5. ארגון מרחבי דינמי זה חשוב עבור הצמיחה, חלוקה, ברגולציה מחזור התא, בידול, תנועתיות, אותות וכן כרומוזום הארגון ושל הפרדה; לפיכך, הוא משפיע למעשה בכל ההיבטים של הפונקציה חיידקי.
ייתכן הדינמיקה של תהליכים תאיים אלה נבחנים במגוון מינים חיידקים שונים עם Escherichia coli, Bacillus subtilis, ויבריו choleraeו Caulobacter crescentus המגישה חשוב מודל אורגניזמים. עם זאת, אלו ארבעת המינים לכסות רק קשת קטנה של חיידקים המגוון העצום, אולי באופן לא מפתיע בהתחשב המרחק פילוגנטי גדולים בין המינים הללו, המנגנונים התאיים הארגון, קיטוב הם שונים אלה חיידקים. זה מעלה את הצורך ללמוד מינים חיידקים נוספים תוכל לחלץ בסופו של דבר את עקרונות כלליים שבבסיס ייתכן הדינמיקה של תאים חיידקיים.
גראם שליליים הדלתא-proteobacterium מ xanthus הוא אורגניזם מודל במחקר של התנהגויות חברתיות ושיתוף הפעולה חיידקים6. מ xanthus אובליגטורי קפדנית, בנוכחות חומרים מזינים, טפסים המושבות שבו תאים להפיץ ממכסה ב מתואמת מאוד, שורצים אופנה, הטרף על מיקרואורגניזמים אחרים7. בתגובה לרעב מזין, תאים ליזום תוכנית התפתחותית גורמת להיווצרות של גופים fruiting המורכב אלפי תאים, בתוך אשר, תאי תאי מוט בצורת להבדיל כדורית עד8נבגים דיפלואידי. שני סוגי התנהגויות, קרי, שורצים ו fruiting הגוף והמבנה, מתבצעות רק על ידי תאים המונחים על משטח יציב. יתר על כן, תחת שני תנאים מזין, תאים לעסוק בתהליכים המערבות אנשי הקשר ישיר תאים תאים כולל חילופי lipoproteins הממברנה החיצונית עשויה לעורר את תנועתיות או לתפקד כמו רעלים ב הנמען9,10 , חילופי LPS11, גירוי של תנועתיות מאת exopolysaccharides על השכנה תאים12והמערכת איתות בתא השטח-מעוגן איתות חלבון13,14.
לאחרונה, מ xanthus הפכה גם אורגניזם מודל לומד המנגנונים תנועתיות, את תקנה15, חלוקת התא16,17,18, וארגון כרומוזום19 20, ,21. קריטית נכנס מ xanthus מחזור התא יש נותחו בפירוט על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באמצעות תמונות ירו snap- או קצר הקלטות בצילום מואץ על זנים נושא רלוונטי חלבונים שכותרתו fluorescently16, 17,18,19,20. באופן אידיאלי, תאים רבים צריך להיות אחריו עם רזולוציה תא בודד על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא חי הדמיה עבור מחזור התא מלא אחד לפחות לקבל נתונים כמותיים על מחזור התא בפרמטרים. עם זאת, זהו אתגר במקרה של מ xanthus בשל הזמן שלה הדור ארוכות יחסית של 4-6 h בתנאי מעבדה סטנדרטיים, בשל photobleaching של fluorophores ו phototoxicity במהלך ייבוא תמונות.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעקוב מ xanthus תאים עם רזולוציה תא בודד על-ידי קרינה פלואורסצנטית לחיות תאים הדמיה לפחות 24 שעות וכיסוי תא כמה מחזורים. חשוב, במהלך פרוטוקול כולו, תאים נשמרים על רכיב pad אגר, להתקרב קשר המאפשר פעילות תלויי-הקשר חיוני סגנון החיים החברתיים של מ xanthus. הפרוטוקול גם מאפשר למשתמשים צג צורה, גודל, חטיבות של הגששים פלורסנט ברזולוציה הטמפורלית גבוהה ועם רזולוציה תא בודד, לפיכך, מאפשר כימות של השתנות לתא מתאמים אירועי מחזור התא.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1135px;" width="1134">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">DMI6000B with AFC</td>
			<td style="width:135px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:119px;">11888945</td>
			<td style="width:563px;">Automated inverted widefield fluorescence microscope with adaptive focus control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">Universal mounting frame</td>
			<td style="width:135px;">Leica microsystems</td>
			<td>11532338</td>
			<td>Stage holder for different sample sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3</td>
			<td style="width:135px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:119px;">11506197</td>
			<td>Phase contrast objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Orca Flash 4.0 camera</td>
			<td style="width:135px;">Hamamatsu</td>
			<td>11532952</td>
			<td>4.0 megapixel sCMOS camera for picture aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">Filter set TXR ET, k</td>
			<td style="width:135px;">Leica microsystems</td>
			<td>11504170</td>
			<td>Fluorescence filter set, Ex: 560/40 Em: 645/75</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">Filter set L5 ET, k</td>
			<td style="width:135px;">Leica microsystems</td>
			<td>11504166</td>
			<td>Fluorescence filter set, Ex: 480/40 Em: 527/30</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">Filter set YFP ET, k</td>
			<td style="width:135px;">Leica microsystems</td>
			<td>11504165</td>
			<td>Fluorescence filter set, Ex: 500/20 Em: 535/30</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProScan III&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Prior</td>
			<td style="width:119px;">H117N1, V31XYZEF, PS3J100</td>
			<td>Microscope automation controller with interactive control center</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">EL 6000 light source</td>
			<td style="width:135px;">Leica microsystems</td>
			<td>11504115</td>
			<td>External fluorescence light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Incubator BLX Black</td>
			<td style="width:135px;">Pecon</td>
			<td>11532830</td>
			<td>Black incubation chamber surrounding the microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">Tempcontrol 37-2 digital</td>
			<td style="width:135px;">Leica microsystems</td>
			<td>11521719</td>
			<td>Automated temperature control for incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentmycin sulphate</td>
			<td style="width:135px;">Carl Roth</td>
			<td>0233.4</td>
			<td>Gentamycin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxytetracylin dihydrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>201-212-8</td>
			<td>Oxytetracyclin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulphate</td>
			<td style="width:135px;">Carl Roth</td>
			<td>T832.3</td>
			<td>Kanamycin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Filtropur BT25 0.2 bottle top filter</td>
			<td style="width:135px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">831,822,101</td>
			<td>Bottle top filter for sterilization of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deckgl&#228;ser</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>630-1592</td>
			<td>Glass cover slip (60 x 22 mm, thickness: 0.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seakem LE agarose</td>
			<td style="width:135px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50004</td>
			<td>Agarose for microscopy slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Metamorph AF</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>11640901</td>
			<td>Microscope control software and software for picture analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetraspeck Microsperes, 0.5 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">T7281</td>
			<td>Fluorescent microspheres</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">688102</td>
			<td>120 mm x 120 mm x 17 mm squared petri dish for agarose pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Bacto Casitone</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">225930</td>
			<td>Casitone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">291-1213</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">AE15.2</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">P027.2</td>
			<td>Magnesium sulphate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate p.a.</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">3904.1</td>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:319px;">1% CTT medium: 1 % (w/v) BD Bacto&#8482; casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Cultivation medium for M.xanthus</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:319px;">TPM buffer: 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Buffer for preparation of microscopy slides for M.xanthus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence live-cell imaging of the complete vegetative cell cycle of the slow-growing social bacterium myxococcus xanthus

קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים תאים חיידקיים היא שיטה מפתח בניתוח הדינמיקה יכולות של חלבונים ו כרומוזומים שבבסיס אירועים מרכזי מחזור התא. עם זאת, הדמיה של מולקולות אלה במייצג חיידקים הגדלים לאט אתגר בשל photobleaching של fluorophores ו phototoxicity במהלך ייבוא תמונות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוט כדי לעקוף את מגבלות אלה במקרה של Myxococcus xanthus (אשר זמן דור של 4-6 שעות). למטרה זו, מ xanthus התאים גדלים על משטח אגר מזין המכיל עבה סביבה לחים טמפרטורה מבוקרת. בתנאים אלה, אנחנו לקבוע את זמן הכפלה של תאים בודדים על-ידי ביצוע את הצמיחה של תאים בודדים. יתר על כן, סלולרי מפתח תהליכים כגון כרומוזום סגרגציה, חלוקת התא יכול לדימות על-ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים תאים המכילים חלבונים סמן fluorescently שכותרתו רלוונטיים כגון ParB-YFP FtsZ-GFP, mCherry-PomX מעל מרובות תא מחזורים. לאחר מכן, הדימויים רכשה מעובדים ליצירת montages ו/או סרטים.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus at JoVE.com

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

תאים חיידקיים במרחב מאוד מאורגנים. כדי לבצע את הארגון הזה לאורך זמן בתאים Myxococcus xanthus גדל לאט, פותחה מלכודת קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים עם רזולוציה גבוהה ייתכן במשך מספר דורות. באמצעות שיטה זו, ייתכן הדינמיקה של חלבונים חשובים על כרומוזום סגרגציה ועל חלוקת התא יכול להיקבע.

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

קונבנציונלי BODIPY מעלה שערים עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ומעקב יחיד מולקולה

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...