Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

本研究中使用的抗体由 bd 生物科学提供。作者感谢他们的同事, 来自法国圣艾蒂安大学医院分子生物学系血液学实验室的 pascale flandrin-gresta 博士, 他为解释 ngs 数据提供了专门知识。mds 案例。作者感谢临床医生血液学家对这项研究的兴趣和参与, 并感谢患者和健康捐献者同意参与这项研究。作者还要感谢 "les amis de rémi" 基金会为出版提供的财政支持。

以下议定书已得到法国圣艾蒂安大学医院 "独立道德委员会" (独立道德委员会) 的批准。
1. 细胞仪设置
注: 细胞仪设置是根据法国流量建议, 根据欧洲流程序 "欧洲流标准操作协议 (sop) 的仪器设置和补偿 (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php)。
<ol><li>每月仪器设置
	<ol><li>打开细胞仪。确保所有液体水平都是适当的, 并打开 diva 6.1.3。执行流体启...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

bm 吸气的质量可能会对最终结果产生影响。bm 吸气的血液稀释会由于没有祖细胞或前体细胞而扭曲不同成熟阶段细胞的分布。在流式细胞仪分析中, 采用大容量裂解法可能有助于 bm 吸气液的正常化, 用于血液稀释。此外, 流动细胞学评价 bm 骨髓发育不良的关键步骤是样品处理和染色、数据采集和解释2,3。在 bm 收获后, 样品处理和染色应进行至72小时。数?...

在 mds 启动和进展过程中, 没有特定于骨髓细胞增生异常变化的表型标记的情况下, 近年来在评估成熟途径 (表达改变) 的基础上, 提出了一种新的方法。在生产成熟髓细胞的过程中, 或在骨髓 (bm) 细胞隔间 1,2内不同细胞类型的异常分布的髓抗原.
本文提出了一种新的方法, 标准化应用 mfc, 以检测与骨髓增生异常综合征 (mds) 或其他骨髓血液学疾病有关的 bm 骨髓细胞隔间的增生异常变化。本研究还显示了使用成熟数据库进行 mfc 数据分析的效用。
样品制备程序的标准化、数据采集和使用数据库进行分析, 将有助于识别与 bm 骨髓细胞增生异常变化有关的最相关的表型异常。因此, 在开发可用于后续分析的分析策略时, 需要基于标记良好且公认的格式 (自动人口分离器 (aps) 图、直方图和点图) 进行统计选择的子集轮。mds 中强健表型异常的发现将在有或没有最小形态发育不良和没有细胞遗传学异常的病例中缓解诊断。识别允许减少免疫表型面板的歧视性参数可以简化目前的分数2, 使其在临床病理实验室的适用性。
这种方法限制了细胞学数据的主观解释, 正如 mds 诊断3中所表明的那样。此步骤是开发用于处理和分析流数据的自动化工具的先决条件 4。
mds 包括一组异质性克隆造血干细胞 (hsc) 疾病, 其中牙代突变与特定的表观修饰语结合生成 mds 苯型。现在人们知道, 随着 hsc 突变, 其他机制也参与了 mds 病理生理学, 如异常免疫介导的炎症和恶性 hsc 与 bm 基质微环境之间的相互作用。然而, 对这些机制的了解仍然很少。mds 广泛的临床和生物学异质性使得诊断和选择最佳治疗方法成为一个挑战。在过去的十年里, 多项研究表明, mfc 在检测发育不良2方面往往比形态学更敏感, 但技术和经济上的限制使这一技术难以标准化, 其结果往往取决于口译人员的经验3。此外, 目前尚不清楚 mfc 如何在有或没有最小形态发育不良的情况下, 在没有细胞遗传学异常的情况下, 或在其他非克隆 bm 的低爆炸计数的低细胞 mds 等边缘病例中, 将天平向 mds 倾斜骨髓衰竭 (即再生障碍性贫血) 等疾病。在爆炸过多的情况下, 也很难区分 mds 的边缘病例和急性髓系白血病 (aml)。由于所有这些原因, 临床指南没有将 mfc 测试集成到 mds 最终诊断中。2011年, 美国国家综合癌症网络 (nccn) 推荐 mfc 用于估计 cd34+ 细胞的百分比, 检测阵发性夜间血红蛋白尿克隆, 以及细胞下 mds 5 中是否存在细胞毒性 t 细胞克隆.这两种情况后两种情况也涉及治疗目标, 因为临床数据显示, 这些患者对免疫抑制治疗有很好的反应.2017年 nccn 指南引用了国际工作组 (iwg) 的建议, 将 mfc 异常免疫表型检测列为 mds 诊断的共同标准, 但没有制定任何规格6。此外, 最近公布的世卫组织分类规定, 仅有 mfc 发现不足以在没有结论性形态和/或细胞遗传学数据的情况下确定 mds 的初步诊断7。然而, mfc 可以作为一个额外的测试, 显示骨髓细胞成熟模式的失调, 并量化患者在疾病过程中的特定时间 "与正常的距离"。
该方法适用于有兴趣用 mfc 免疫表型评估 bm 骨髓细胞发育不良的临床实验室, 以完善 mds 或其他骨髓异常异常疾病的诊断。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

在法国细胞术协会 (afc) 内成立了一个工作组, 以协调多参数流式细胞术 (mfc) 在法国骨髓疾病诊断中的应用。这里介绍的议定书是在2013年9月至2015年11月期间在六个法国诊断实验室 (圣艾蒂安、格雷诺布尔、克莱蒙-费朗、尼斯、里尔和保利-卡尔特斯研究所) 商定并应用的。马赛), 并允许骨髓样品制备和数据采集的标准化。三个成熟数据库被开发了中性粒细胞, 单核细胞和红血球系与骨髓从 "健康" 捐献者 (个人没有任何证据的造血疾病)。对于每个髓系的可靠分析方法应该适用于常规诊断使用。可以以相同的方式分析新案例, 并与通常的数据库进行比较。因此, 定量和定性表型异常可以被确定, 那些超过2sd 的人相比, 正常骨髓样本的数据应被视为指示病理。主要的局限性是使用基于杂交瘤技术的方法获得的单克隆抗体获得的数据与目前用于临床诊断的数据之间的差异较高。为所获得的数据设置技术验证标准可能有助于提高 mfc 在 mds 诊断中的效用。制定这些标准需要对数据库进行分析。减少数据分析中的研究者主体性是该方法的一个重要优点。

研究包括在 k-edta 抗凝剂中采集的 54个 bm 样品。在没有任何患者信息的情况下, 对 mfc 数据进行了分析。回顾性研究显示, bm 样本来自7个健康捐献者 (5名男性和2名女性, 中位年龄为 47.4 [35-48], 11 人没有造血疾病的证据 (8名男性和3名女性, 中位年龄为 57.9 [35-72]) 和36例。 病理情况: 贫血和肌酐水平低1例, 贫血3例, 肌酐水平高, 贫血8例, 维生素 b12 缺乏引起贫血1例, 贫血4例, 贫血...

Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

mds 诊断是困难的, 在没有形态学标准或非信息细胞遗传学。mfc 可以帮助优化 mds 诊断过程。为了对临床实践有用, mfc 分析必须基于具有足够特异性和敏感性的参数, 数据应在不同的操作人员之间重现。

数据库引导流式细胞术评价骨髓细胞成熟

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

这种方法可以帮助回答骨髓疾病诊断中的关键问题，如骨髓发育不良综合征或其他血液疾病，这些疾病在骨髓细胞系的成熟异常下进化。这种技术的主要优点是，它降低了调查员在分析和解释中的主观性。这种方法可以提供洞察哪些是骨髓发育最歧视性的参数。它允许定量与正常骨髓细胞群的差异。演示这个程序的将是蒂普哈尼·皮科特，一个来自我们实验室的博士后研究员。首先将600微升的原细胞样品与10毫升的洗涤缓冲液混合在15毫升锥形管中，用于两次离心和每次洗涤10毫升新鲜洗涤缓冲液。第二次洗涤后，将颗粒重新悬浮在400微升的新鲜洗涤缓冲液中，将350微升的细胞悬浮液转移到5毫升聚丙烯FACS管中，内含整个骨干抗体面板。彻底混合细胞后，移液器等量的细胞抗体溶液放入三个新的聚丙烯管中，并必要时将每个管中的最终体积与新鲜洗涤缓冲液一起带到200微升。接下来，将适当体积的抗体添加到感兴趣的细胞表面标记物上，混合，在室温下孵育30分钟，防止光线。在孵育结束时，加入两毫升的解液混合，在室温下孵育10分钟，防止光线。通过离心收集开液细胞，并丢弃每个管中除了最后50微升的上经剂，而不干扰颗粒。用温和的混合将颗粒重新悬浮在剩余的上清液中，并在每个样品中加入两毫升的新鲜洗涤缓冲液。第二次洗涤后，丢弃上经剂，在每个管中留下大约50微升的剩余体积，而不会干扰颗粒。将颗粒重新悬浮在 200 微升 PBS 中，并混合，立即进行分析。要读取流式圆环仪上的样本，请首先在流式测速仪软件中打开一个新的实验，然后根据名称、样本类型和日期重命名实验。为三根管创建新的试样，并指定实验布局中每个管中使用的抗体。打开圆度计设置，然后选择应用程序设置，以应用在每月设置中获得的值。打开一个新的全局工作表，并创建适当的点图，用于对单细胞以及粒细胞、单细胞、爆炸和淋巴细胞群进行浇注。为薪酬控件创建新的全局工作表。然后，以中等采集速率从每个管获取 500，000 个事件，在技术验证后将数据导出为 fcs 3.0 文件。在开始新的分析之前，请下载包含正常骨髓数据的细胞文件，用于嗜中性粒细胞、单细胞和核化红色血统，以及 inp 格式的分析文件。然后，将数据保存到桌面上。为了将嗜中性粒细胞成熟保存到数据库，首先打开英菲尼科特软件，然后打开与中性粒细胞成熟度数据对应的细胞文件。在 APS 图上绘制成熟路径，将嗜中性粒细胞的成熟路径保存到数据库。打开必须分析的嗜中性粒细胞血统成熟度的 fcs 文件。从配置文件选项卡上传嗜中性粒细胞成熟度 inp 文件。此血统的分析分为三个步骤。从选择 CD34 阳性、中性粒细胞承诺的爆炸开始。为此，使用七个门的交点，允许选择CD34阳性、CD117阳性、HLADR低、CD10负、CD13阳性、CD11 b阴性事件。继续分析，选择CD117阳性，CD34阴性中性粒细胞前体。继续分析，选择更成熟的嗜中性粒细胞。接下来，显示单细胞血统细胞的分析。在 APS 图上绘制成熟路径。验证指示成熟感的箭头是否从不成熟的单细胞、CD14 阴性、IREM2 阴性方向定向到成熟单核细胞、CD14 阳性、IREM2 阳性。将单核血统的成熟路径保存到数据库。打开必须分析的单核血统成熟度的 fcs 文件。上传轮廓进行单核血统分析。要识别单核血统细胞，请使用四个门的交点，允许选择 CD64 正高、CD117 阳性、CD117 阴性、HLADR 阳性事件。将这些事件分配给总体层次结构树中的单核选项卡。打开必须保存在 NRC 数据库中的 NRC cyt 文件。在 APS 图上绘制成熟路径，将成核红细胞成熟路径保存到数据库。打开必须分析的 fcs 文件。从配置文件上传成核红细胞的分析模板。此血统的分析分为两个步骤。从选择CD34阳性，红机器人承诺爆炸开始。在这里，使用七个门的交点，允许选择CD34正、CD117阳性、HLADR低、CD105阳性、CD33负、CD36阳性、CD71阳性事件。将这些事件分配给总体层次结构中的 NRC 选项卡。从可见性中去除 CD34 正红环形机器人承诺的爆炸。要识别更成熟的红体细胞，请使用四个门的交点，允许识别CD45阴性和低，侧散低，CD36正高，和CD71正高。然后，从核红细胞中去除 CD36 高侧散射低血小板，并将此总体分配给 NRC 选项卡。要评估骨髓室中的骨髓成熟，请打开与必须评估的案例中感兴趣的血统对应的细胞文件。在总体层次结构树中，仅对分配给中性粒细胞选项卡的事件保持可见。在 APS 图上绘制成熟路径，并加载与中性粒细胞在正常骨髓中成熟对应的数据库，并比较数据。如果数据至少部分兼容，软件将创建一个规范化的成熟度差异图和一个参数带，以可视化成熟度差异。要比较骨髓室中的单核成熟度，对于来自正常骨髓的新病例，包括单核细胞数据库中的数据，打开与单核细胞系对应的细胞文件。仅保持在人口层次结构树中分配给单核子选项卡的事件可见，并在 APS 图上绘制成熟路径。加载与正常骨髓中单细胞成熟对应的数据库，并比较数据。要比较骨髓室中成核红细胞成熟，对于新病例，使用 NRC 数据库中包括的正常骨髓数据，打开与 NRC 血统对应的细胞文件。仅使总体层次结构树中分配给 NRC 选项卡的事件可见。并在 APS 图上绘制成熟路径。加载与正常骨髓中 NRC 成熟度对应的数据库，并比较数据。然后，要可视化新文件和数据库中包含的数据之间的差异的重要性，请单击规范化的成熟差异并缩放。请记住，在流式细胞学数据分析中使用分层分类算法的方法具有高度主观性，本质上是不准确的，因为它们不计算细胞总体重叠。对疑似为MDS的新病例的评估，可对骨髓正常成熟数据库进行鉴定，以便识别中性粒细胞、单细胞和NRC血统的异常表达成熟抗原，即使在没有细胞学或细胞学异常的情况下。在尝试此程序时，重要的是要记住以标准化的方式获取流式细胞测量数据，执行每月细胞计设置、每日检查、使用前严格移液抗体以及尊重染色时间。按照此过程，可以执行其他方法（如指南针）来比较不同组的情况，并回答其他问题，例如特定案例组的最终类型印记是什么。在开发后，这项技术为有兴趣探索骨髓细胞成熟模式的研究人员铺平了道路，在克隆造血体具有不确定潜力的情况下，可以确定最终的细胞变化，这些变化与消化不良过程可靠相关。请注意，使用健康捐赠者的数据数量增加来更新数据库可能会提高分析的稳健性。

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

制备髓源性抑制细胞从幼稚和胰腺癌荷瘤小鼠，用流式细胞仪和自动磁性细胞分选（AutoMACS）（MDSC）

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

科研

医学

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

高通量顺序酶联免疫吸附试验的急性移植物抗宿主病的生物标志物的验证

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

酪氨酸激酶抑制剂的临床前评价急性白血病的治疗

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

高通量流式细胞仪检测细胞为基础的试验检测抗体，以N-甲基-D-天冬氨酸受体或多巴胺2受体在人血清

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

半自动适应循环肿瘤细胞（CTC）分析临床和临床前研究中的应用

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

股骨骨髓的愿望在活体小鼠

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

单元位置的Imaging-和流式细胞仪为基础的分析和3D球体黑色素瘤细胞周期

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

体积摄影与气压面学相结合测量肺结构-功能关系

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

骨关节炎模型中骨髓、骨髓、淋巴结和合成组织内免疫细胞子集的流动细胞测量分析

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

大鼠骨髓骨髓的隔离和培养

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...