Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Antistofferne anvendes i denne undersøgelse blev leveret af BD Biosciences. Forfatterne vil gerne takke deres kollega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, fra den Molekylærbiologisk Institut, hæmatologi laboratory, University Hospital i Saint-Etienne, Frankrig, der fastsatte fortolkning af NGS data for andet ekspertise MDS sag. Forfatterne er taknemmelige for klinikeren Hematologer for deres interesse og engagement i denne undersøgelse og patienter og raske donorer for deres samtykke til at deltage i denne undersøgelse. Forfatterne vil også gerne takke "Les Amis de Rémi" fonden for økonomisk støtte til offentliggørelse.

Den protokol, der er anført nedenfor er blevet godkendt af den "Comité de Protection des Personnes" (uafhængige etiske komité) Sud-Est 1 fra University Hospital i Saint-Étienne i Frankrig.
1. forskellige indstillinger
Bemærk: Indstillingerne for forskellige blev udført efter Frankrig Flow anbefalinger, efter EuroFlow Procedure "EuroFlow Standard Operating protokol (SOP) for Instrument Setup og kompensation (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
<...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

Kvaliteten af BM aspirat kan indvirke på de endelige resultater. Blodfortynding af BM aspirat kan forvrænge fordelingen af celler i forskellige stadier af modning på grund af fravær af stamfaderen eller prækursorer celler. Sandsynligvis ansætte en bulk lysing metode kan hjælpe i normalisering af BM aspirates for blodfortynding i flow cytometric analyser. Derudover er de kritiske trin for evaluering af BM myeloide dysplasi ved flowcytometri prøve forarbejdning og farvning, dataopsamling og fortolkning<sup class="x...

I mangel af fænotypiske markører specifikke til de Dysplastiske forandringer i myeloide celler under MDS indledningen og progression, er en ny tilgang blevet foreslået i de seneste år baseret på en evaluering af modning veje (ændret udtryk for myeloid antigener under produktionen af modne myeloide celler) eller af unormale fordelingen af forskellige celletyper i knoglemarven (BM) celle rum1,2.
Denne artikel præsenterer en ny metode for standardiseret anvendelse af MFC for at afsløre Dysplastiske forandringer i BM myeloide celler rum relateret til myelodysplastisk syndrom (MDS) eller andre myeloide hematological sygdomme. Denne undersøgelse viser også nytten af benytter modning databaser for MFC dataanalyse.
Standardisering af eksempelprocedure forberedelse, dataopsamling og analyse ved hjælp af databaserne, der ville tillade identifikation af de mest relevante fænotypisk abnormiteter relateret til Dysplastiske forandringer i BM myeloide celler. Derfor, statistisk valgte delmængder baseret på godt mærket og velkendt formater (automatiske befolkning Separator (APS) diagrammer, histogrammer og dot parceller) er påkrævet for at udvikle en analyse-strategi, der kan bruges i efterfølgende analyse runder. Opdagelsen af robust fænotypisk abnormiteter i MDS ville lette diagnosen i tilfælde med eller uden minimal morfologiske dysplasi og uden cytogenetisk aberrancies. Identifikation af diskriminerende parametre giver mulighed for reduktion af immunophenotypic paneler kan forenkle de nuværende score2, tillader deres anvendelighed i klinisk patologi laboratorier.
Denne metode begrænser de subjektive fortolkninger af flowcytometri data, som har været signaleret i MDS diagnose3. Dette trin er en forudsætning for udviklingen af automatiserede værktøjer til behandling og analyse af flow data4.
MDS består af en heterogen gruppe af klonede hæmatopoietisk stamcelle (HSC) lidelser som spliceosome mutationer i samarbejde med specifikke epigenetiske modifikatorer at give MDS fænotype. Det er nu kendt, at sammen med HSC mutationer, andre mekanismer er involveret i MDS Patofysiologi, som afvigende immun-medieret betændelse og interaktioner mellem maligne HSCs og de stromale mikromiljø af BM. Disse mekanismer er dog stadig dårligt forstået. Bredt klinisk og biologiske heterogenitet af MDS gør diagnose og valg af den optimale behandling en udfordring. I det sidste årti, har flere undersøgelser vist, at MFC er ofte mere følsomme til at opdage dysplasi2 end morfologi, men tekniske og økonomiske begrænsninger gør denne teknik vanskeligt at standardisere, med resultater ofte afhængig af oplevelse af tolk3. Det er desuden uklart, hvordan MFC kan tippe balancen mod MDS i tilfælde med eller uden minimal morfologiske dysplasi og i mangel af cytogenetiske anomalier, eller i grænsetilfælde som hypocellular MDS, med en lav blast tælle, fra andre ikke-klonede BM lidelser såsom knoglemarv svigt (dvs., Aplastisk anæmi). Det er også fortsat vanskeligt at skelne grænsetilfælde af MDS med et overskud af Blaster fra akut myeloid leukæmi (AML). Af alle disse grunde integrerer de kliniske retningslinjer ikke MFC test i MDS endelige diagnose. I 2011 anbefalede den amerikanske nationale omfattende Cancer Network (NCCN) MFC til at anslå procentdelen af CD34 + celler, påvisning af paroxysmal natlige hemoglobinuria kloner, og tilstedeværelsen af cytotoksiske T-celler kloner i hypocellular MDS5. Disse to sidstnævnte situationer også indebære en terapeutiske mål for kliniske data har vist en god respons på disse patienter til immunsupprimerende behandling6. 2017 NCCN retningslinjer, med henvisning til de internationale arbejder gruppen (Kuwait) anbefalinger, opført afvigende Immunofænotypning påvisning af MFC blandt fælles kriterier for MDS diagnose, men uden at gøre nogen specifikationer6. Desuden, fastsætter den nyligt offentliggjorte WHO klassifikationen at MFC resultater alene ikke er tilstrækkelig til at fastslå en primære diagnose af MDS i mangel af afgørende morfologiske og/eller cytogenetisk data7. MFC kan dog bruges som en ekstra test viser dysregulering af myeloide celle modning mønstre og kvantificere "distance fra normal" for en patient på et bestemt tidspunkt i kurset sygdom.
Denne metode finder anvendelse på kliniske laboratorier interesseret i evalueringen af dysplasi i BM myeloide celler ved hjælp af MFC Immunofænotypning, for at finpudse diagnose i MDS eller andre myeloide sygdomme med dysplastiske abnormiteter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

En arbejdsgruppe, der er iværksat inden for den franske flowcytometri (AFC) blev udviklet for at harmonisere anvendelsen af multiparameter flowcytometri (MFC) for myeloid sygdom diagnose i Frankrig. Protokollen præsenteres her var aftalt og anvendt mellem September 2013 og November 2015 i seks franske diagnostiske laboratorier (universitetshospitaler i Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, og Lille og Institut Paoli-Calmettes i Marseille) og tilladt standardisering af knoglemarven prøve forberedelse og dataopsamling. Tre modning databaser blev udviklet til neutrofile, monocytic, og erythroid lineages med knoglemarv fra "sund" donor personer (personer uden nogen tegn på en hæmatopoietisk sygdom). En robust metode til analyse af hver myeloide lineage bør gælde for rutinemæssig diagnostisk brug. Nye tilfælde kan analyseres på samme måde og sammenlignet med de sædvanlige databaser. Således, kvantitative og kvalitative fænotypisk abnormiteter kan identificeres og dem over 2SD sammenlignet med data fra normal knoglemarv prøver skal betragtes som vejledende i patologi. Den store begrænsning er den højere variabilitet mellem de data, der opnås ved hjælp af monoklonale antistoffer fremstillet med metoder baseret på hybridom teknologier og i øjeblikket anvendes i kliniske diagnose. Fastsættes kriterier for teknisk validering af de data, der er erhvervet kan hjælpe med at forbedre nytten af MFC til MDS diagnostik. Opstillingen af disse kriterier kræver analyse mod en database. Reduktion af investigator subjektivitet i dataanalyse er en vigtig fordel ved denne metode.

54 BM prøverne høstet i K-EDTA antikoagulans indgik i undersøgelsen. MFC data blev analyseret i mangel af oplysninger om patienterne. Retrospektiv undersøgelse viste, at BM stikprøverne var fra 7 raske donorer (5 hanner og 2 hunner med en median alder af 47.4 [35-48], 11 personer med ingen tegn på en hæmatopoietisk sygdom (8 hanner og 3 hunner med en median alder af 57,9 [35-72]) og 36 tilfælde med forskellige patologiske betingelser: 1 kasse med anæmi og lavt kreatinin niveau, ...

Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

MDS diagnose er vanskeligt i mangel af morfologiske kriterier eller ikke-informativ cytogenetisk. MFC kunne bidrage til at forædle MDS diagnostiske proces. For at blive nyttige for klinisk praksis, MFC analysen skal være baseret på parametre med tilstrækkelig specificitet og sensitivitet, og oplysningerne skal være reproducerbare mellem forskellige operatører.

Database-styrede flowcytometri for evaluering af knoglemarven myeloide celle modning

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Denne metode kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål i diagnosticering af myeloid sygdomme såsom myelodysplasi syndromer eller andre hæmatologiske sygdomme, der udvikler sig med modning abnormiteter i myeloid celle slægter. Den største fordel ved denne teknik er, at det reducerer subjektivitet investigator i denne analyse og fortolkning. Denne metode kan give indsigt i, hvilke er de mest diskriminerende parametre for myelodysplasi.Det giver mulighed for kvantificering af forskellene fra normale myeloid celle populationer. Demonstration af proceduren vil være Tiphanie Picot, en post-ph.d.-stipendiat fra vores laboratorium. Begynd med at blande 600 mikroliter af primærcelleprøven med 10 ml vaskepude i et konisk rør på 15 milliliter til to centrifugeringer og 10 milliliter frisk vaskepude pr. vask.Efter den anden vask suspenderes pellet igen i 400 mikroliter af frisk vaskebuffer, og 350 mikroliter af cellesuspensionen overføres til et fem milliliter polypropylen FACS-rør, der indeholder hele panelet af rygbensantistoffer. Efter grundig blanding af cellerne pipetters lige store mængder af celleantistofopløsningen i tre nye polypropylenrør, og det endelige volumen i hvert rør bringes op til 200 mikroliter med frisk vaskebuffer efter behov. Dernæst tilsættes passende mængde antistoffer mod celleoverfladen markører af interesse med blanding, for en 30-minutters inkubation ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.Ved inkubationens afslutning tilsættes to milliliter lysopløsning med blanding i en 10-minutters inkubation ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Opsaml de lysede celler ved centrifugering, og kassér alle, men de sidste 50 mikroliter af supernatant i hvert rør, uden at forstyrre pellet. Re-suspendere pellets i den resterende supernatant, med blid blanding, og tilsæt to milliliter frisk vask buffer til hver prøve.Efter den anden vask kasseres supernatanten, så der efterlades ca. 50 mikroliters resterende volumen i hvert rør uden at forstyrre pellet. Re-suspendere pellet i 200 mikroliter af PBS med blanding, til øjeblikkelig analyse. Hvis du vil læse eksemplerne på et flowcytometer, skal du først åbne et nyt eksperiment i flowcytometersoftwaren og omdøbe eksperimentet i henhold til navnet, prøvetypen og datoen.Opret en ny prøve til tre rør, og angiv de antistoffer, der anvendes i hvert rør i eksperimentlayoutet. Åbn cytometerindstillingerne, og vælg programindstillinger for at anvende de værdier, der er opnået i den månedlige opsætning. Åbn et nyt globalt regneark, og opret de relevante dotplots til gating af singletcellerne samt til populationerne granulocyt, monocyt, blast og lymfocyt.Opret et nyt globalt regneark til kompensationskontrolelementerne. Derefter erhverve 500, 000 begivenheder fra hvert rør, på en medium erhvervelse sats, eksportere data som FCS 3,0 filer, efter deres tekniske validering. Før du starter en ny analyse, skal du downloade cyt filer, der indeholder de normale knoglemarv data, for neutrofil, monocytiske, og nucleated røde slægter, og analysefilerne i inp-format.Gem derefter dataene på skrivebordet. For at gemme neutrofilmodning til databasen skal du først åbne Infinicyt-softwaren og derefter åbne den cytfil, der svarer til neutrofilmodningsdataene. Tegn modningsvejen på APS-grafen, og gem neutrofilens modningsvej til databasen.Åbn fcs-filen for den neutrofil afstamningmodning, der skal analyseres. Overfør inp-filen til neutrofil fra fanen Profiler. Analysen for denne slægt er opdelt i tre trin.Start med udvælgelse af CD34 positive, neutrofil-engagerede blaster. Til dette formål skal du bruge et skæringspunkt på syv porte, for at tillade udvælgelse af CD34 positive, CD117 positive, HLADR lav, CD10 negativ, CD13 positive, CD11 b-negative begivenheder. Fortsæt analysen med udvælgelsen af CD117 positive, CD34 negative neutrofilprækursorer.Fortsæt analysen med udvælgelsen af mere modne neutrofilceller. Dernæst viser analysen af monocytiske afstamning celler. Tegn modningsvejen på APS-grafen.Kontroller, at pilen, der angiver modningssansen, er orienteret fra umodne, monocytiske celler, CD14 negativ, IREM2 negativ, til de modne monocytter, CD14 positiv, IREM2 positiv. Gem modningsvejen for monocytisk afstamning i databasen. Åbn fcs-filen for monocytisk afstamningmodning, der skal analyseres.Upload profilen til monocytisk afstamning analyse. For at identificere de monocytiske afstamning celler, bruge et skæringspunkt mellem fire porte, der giver mulighed for udvælgelse af CD64 positive høj, CD117 positive, CD117 negative, HLADR positive begivenheder. Tildel disse hændelser til den monocytiske fane i populationshierarkitræet.Åbn den NRC-cytfil, der skal gemmes i NRC-databasen. Tegn modningsvejen på APS-grafen, og gem den nukleerede modnede cellevej til databasen. Åbn den fcs-fil, der skal analyseres.Upload fra profilerne analyseskabelonen for nuklede røde blodlegemer. Analysen for denne slægt er opdelt i to trin. Begyndende med udvælgelsen af CD34 positive, erythroid begået blaster.Her skal du bruge et skæringspunkt mellem syv porte til at tillade valg af CD34 positive, CD117 positive, HLADR lav, CD105 positiv, CD33 negativ, CD36 positive, CD71 positive begivenheder. Tildel disse hændelser til fanen NRC i befolkningshierarkiet. Fjern cd34 positive erythroid begået blaster fra synlighed.For at identificere mere modne erythroid celler, bruge et skæringspunkt mellem fire porte, der tillader forskelsbehandling af CD45 negative og CD45 positive lav, side-scatter lav, CD36 positiv høj, og CD71 positiv høj. Fjern derefter CD36-højsidespletterne lave blodplader fra de nuklede røde blodlegemer, og tildel denne population til fanen NRC. For at vurdere myeloid modning i knoglemarvsrummet skal du åbne cytfilen, der svarer til den afstamning af interesse fra det tilfælde, der skal evalueres.Hold kun de hændelser, der er tildelt neutrofilerne i populationshierarkiet, synlige. Tegn modningsvejen på APS-grafen, og indlæs databasen, der svarer til neutrofilens modning i normal knoglemarv, og sammenlign data. Hvis dataene i det mindste er delvist kompatible, opretter softwaren et normaliseret modningsdybediagram og et parameterbånd for at visualisere modningsforskellene.Hvis du vil sammenligne monocyttermodningen i knoglemarvsrummet, skal du åbne den cytfil, der svarer til den monocytiske cellestiv, for et nyt tilfælde med data fra normale knoglemarv, herunder i monocytdatabasen. Hold kun de hændelser, der er tildelt monocytunderfanen i populationerhierarkiet, synlige, og tegn modningsvejen på APS-grafen. Indlæs den database, der svarer til monocyttermodningen i normale knoglemarvser, og sammenlign data.For at sammenligne den nucleated røde blodlegemer modning i knoglemarvsrummet, for et nyt tilfælde, med data fra de normale knoglemarve, der indgår i NRC-databasen, skal du åbne cytfilen svarende til NRC's afstamning. Hold kun de hændelser, der er tildelt fanen NRC i befolkningshierarkitræet, synlige. Og tegne modning vej på APS grafen.Indlæs den database, der svarer til NRC-modningen, i normale knoglemarvser, og sammenlign data. Klik derefter på normaliserede modningsforskelle og zoom for at visualisere betydningen af forskellene mellem den nye fil og de data, der er inkluderet i databasen. Husk, at metoder, der bruger de hierarkiske klassificeringsalgoritmer i flowcytometrisk dataanalyse, er meget subjektive og i sagens natur unøjagtige, fordi de ikke tæller for cellepopulationoverlapning.Vurderingen af nye tilfælde af cytopeni, der mistænkes for at være MDS i forhold til de normale modningsdatabaser for myeloider, gør det muligt at identificere unormalt udtrykte modningsantigener af neutrofil, monocyt og NRC-slægter, selv i tilfælde uden cytologiske eller cytogeniske abnormiteter. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at erhverve flow cytometriske data, i standardiseret måde, at udføre månedlige cytometer indstilling setup, daglige kontroller, at pipette strengt antistoffet før brug, og at respektere farvning gange. Efter denne procedure, en anden metoder som kompas, kan udføres for at sammenligne de forskellige gruppe af sager, og til at besvare yderligere spørgsmål, såsom hvad er den endelige typiske aftryk for en bestemt gruppe af sager.Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for de forskere interesseret i at udforske myeloid celle modning mønstre, i tilfælde af klonale hæmatopoies af ubestemt potentiale til at identificere de endelige typiske ændringer pålideligt relateret til dysplastisk proces. Bemærk, at opdatering af databasen med et øget antal data fra raske donorer kan forbedre analysens robusthed.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Fremstilling af myeloide afledte suppressorceller (MDSC) fra naive og pancreas Tumorbærende mus under anvendelse af flowcytometri, og Automatiseret magnetisk aktiveret cellesortering (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

High Throughput Sekventiel ELISA for Validering af biomarkører for akut graft-versus-host-sygdom

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Præklinisk evaluering af tyrosinkinasehæmmere for Behandling af akut leukæmi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af antistoffer til N-methyl-D-aspartat-receptor eller dopamin-2-receptoren i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Tilpasning af halvautomatiseret Cirkulerende Tumor Cell (CTC) analyser til kliniske og prækliniske forskning applikationer

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Femoral knoglemarv Aspiration i levende mus

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- og flowcytometri-baserede Analyse af Cell holdning og Cell Cycle i 3D Melanom Sfæroider

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Kombinere volumetriske Capnography og barometer Plethysmography for at måle lunge struktur-funktion relationer

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Flow Cytometri Analyse af immuncelledelmængder i Murine Milten, Knoglemarv, Lymfeknuder og synovialvæv i en osteokhritis model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolation og dyrkning af mandibular knoglemarv mesenchymale stamceller hos rotter

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...