Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

De antilichamen die gebruikt in deze studie werden verstrekt door BD Biosciences. De auteurs bedank hun collega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, van het Department of Molecular Biology, laboratorium hematologie, Universiteit ziekenhuis van Saint-Etienne (Frankrijk), die deskundigheid voor interpretatie voor NGS data voor de tweede MDS geval. De auteurs zijn dankbaar voor de clinicus Haematogen voor hun belangstelling en betrokkenheid in deze studie en voor de patiënten en gezonde donoren voor hun toestemming om deel te nemen in deze studie. De auteurs ook bedank de "Les Amis de Rémi" Stichting voor financiële steun voor publicatie.

Het onderstaande protocol is goedgekeurd door het "Comité de bescherming des Personnes" (onafhankelijk ethisch comité) Sud-Est 1 from University Hospital van Saint-Etienne, Frankrijk.
1. Cytometer instellingen
Opmerking: De cytometer-instellingen werden uitgevoerd volgens Frankrijk stroom aanbevelingen, EuroFlow procedure "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) voor Instrument Setup en compensatie (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
<ol><li><st...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

De kwaliteit van BM aspirate kan gevolgen hebben voor de eindresultaten. De hemodilution van de BM-aspirate kan de verdeling van de cellen in verschillende stadia van rijping te wijten aan de afwezigheid van de progenitoren of precursoren cellen verstoren. Waarschijnlijk een bulk lysing methode in dienst kan helpen bij de normalisering van BM aangeblazen voor hemodilution in stroom cytometrische analyses. Daarnaast zijn de kritische stappen voor de evaluatie van BM myeloïde dysplasie van stroom cytometry de monster verw...

Bij gebrek aan fenotypische markeringen specifiek voor de dysplastische veranderingen in myeloïde cellen tijdens de initiatie van de MDS en progressie, is een nieuwe aanpak voorgesteld in de afgelopen jaren op basis van de evaluatie van de rijping trajecten (gewijzigde uitdrukking van myeloïde antigenen tijdens de productie van volwassen myeloïde cellen) of van de abnormale verdeling van de verschillende soorten cellen in het beenmerg (BM) cel compartimenten1,2.
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor gestandaardiseerde toepassing van MFC oog op de opsporing van dysplastische veranderingen in BM myeloïde cel compartimenten betrekking hebben op myelodysplastisch syndromen (MDS) of andere myeloïde hematologische ziekten. Deze studie toont ook het nut van het gebruik van rijping databases voor MFC data-analyse.
Standaardisatie van de voorbereiding voorbeeldprocedure, data-acquisitie en analyse met behulp van de databases zou de identificatie van de meest relevante fenotypische afwijkingen die verband houden met dysplastische veranderingen in BM myeloïde cellen. Daarom zijn statistisch geselecteerde deelverzamelingen gebaseerd op goed gelabeld en goed erkende formaten (automatische bevolking scheidingsteken (APS) diagrammen, histogrammen, en dot plots) vereist voor de ontwikkeling van een analyse-strategie die kan worden gebruikt in latere analyse rondes. De ontdekking van robuuste fenotypische afwijkingen in MDS zou verlichten de diagnose in gevallen met of zonder minimale morfologische dysplasie en zonder cytogenetische aberrancies. Identificatie van discriminerende parameters rekening houdend met de vermindering van de immunophenotypic panelen kan vereenvoudigen de huidige scores2, toe te staan hun toepasbaarheid in de laboratoria van de klinische pathologie.
Deze methode beperkt de subjectieve interpretaties van cytometry gegevens, zoals in MDS diagnose3hebben zijn gesignaleerd. Deze stap is een voorwaarde voor de ontwikkeling van de geautomatiseerde hulpmiddelen voor het verwerken en analyseren van stroom gegevens4.
MDS bestaat uit een heterogene groep van aandoeningen van de klonen hematopoietische stamcellen (HSC) waarin het spliceosoom mutaties met specifieke epigenetische modifiers werken opleveren van het fenotype van de MDS. Het is nu bekend dat, samen met HSC mutaties, andere mechanismen zijn betrokken bij MDS pathofysiologie, zoals abnormale immuun-gemedieerde ontsteking en interacties tussen kwaadaardige HSCs en de stromale communicatie van de BM. Deze mechanismen blijven echter slecht begrepen. De brede klinische en biologische heterogeniteit van MDS maakt de diagnose en de selectie van de optimale therapie een uitdaging. In het laatste decennium, in meerdere studies hebben aangetoond dat MFC vaak meer is gevoelig voor het opsporen van dysplasie2 dan morfologie, maar technische en economische beperkingen deze techniek moeilijk maken om te standaardiseren, met resultaten vaak afhankelijk van de ervaring van de tolk3. Bovendien, is het onduidelijk hoe MFC de balans naar MDS in gevallen met of zonder minimale morfologische dysplasie en bij gebrek aan cytogenetische afwijkingen of in grensgevallen zoals hypocellular MDS, met een lage blast tellen, kan tip van andere niet-klonen BM stoornissen zoals beenmerg mislukking (dwz., aplastic bloedarmoede). Ook blijft het moeilijk om te onderscheiden grensgevallen van MDS met een overmaat van ontploffingen van acute myeloïde leukemie (AML). Om al deze redenen opnemen de klinische richtsnoeren niet MFC testen in de uiteindelijke diagnose van MDS. In 2011, heeft de Amerikaanse nationale uitgebreide kanker netwerk (NCCN) voor de schatting van het percentage CD34 + cellen, detectie van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie klonen en aanwezigheid van cytotoxische T-cel-klonen in hypocellular MDS5MFC aanbevolen. Deze twee laatste gevallen ook betrekking hebben op een therapeutisch doel omdat klinische gegevens hebben aangetoond een goede reactie van deze patiënten op immunosuppressieve therapie6. De 2017 NCCN richtsnoeren, onder vermelding van de aanbevelingen van de International Working Group (IWG) vermeld afwijkende immunophenotyping detectie door MFC behoort tot de co criteria voor de diagnose van de MDS, maar zonder eventuele specificaties6. Bovendien, bepaalt de onlangs gepubliceerde WHO-indeling dat MFC bevindingen alleen volstaan niet om een primaire diagnose van MDS bij gebrek aan afdoende morfologische en/of cytogenetische gegevens7. MFC kan echter worden gebruikt als een aanvullende proef tonen de disregulatie van myeloïde cel rijping patronen en kwantificeren van de "afstand van normale" voor een patiënt op een bepaald tijdstip in de loop van de ziekte.
Deze methode is van toepassing op klinische laboratoria ook geïnteresseerd in de evaluatie van dysplasie in BM myeloïde cellen met behulp van MFC immunophenotyping, ter verfijning van de diagnose in MDS of andere myeloïde aandoeningen met dysplastische afwijkingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

Een werkgroep gestart binnen de Franse Cytometry Association (AFC) werd ontwikkeld om het harmoniseren van de toepassing van multiparameter stroom cytometry (MFC) voor myeloïde ziekte diagnose in Frankrijk. Het hier gepresenteerde protocol was overeengekomen en toegepaste tussen September 2013 en November 2015 in zes Franse diagnostische laboratoria (universitaire ziekenhuizen van Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, en Lille en Institut Paoli-Calmettes in Marseille) en de standaardisatie van het beenmerg monster voorbereiding en gegevens overname toegestaan. Drie rijping databases werden ontwikkeld voor neutrofiele, monocytic, en erythroid lineages met beenmerg van "gezonde" donor personen (individuen zonder enig bewijs van een hematopoietische ziekte). Een robuuste analysemethode voor elke myeloïde lineage moet gelden voor routinematige diagnostische gebruik. Nieuwe gevallen kunnen worden op dezelfde manier geanalyseerd en vergeleken met de gebruikelijke databases. Dus, kwantitatieve en kwalitatieve fenotypische afwijkingen kunnen worden geïdentificeerd en personen boven 2SD vergeleken met gegevens van normale beenmerg monsters moeten worden beschouwd als indicatieve van pathologie. De belangrijkste beperking is de hogere variabiliteit tussen de gegevens die zijn bereikt met de monoklonale antilichamen verkregen met de methoden op basis van hybridoma technologieën en momenteel gebruikt in de klinische diagnose. Vaststelling van de criteria voor de technische validering van de verkregen gegevens kan helpen verbeteren van het nut van MFC voor MDS diagnostiek. De vaststelling van deze criteria vereist analyse tegen een database. De vermindering van de onderzoeker subjectiviteit in data-analyse is een belangrijk voordeel van deze methode.

De 54 BM monsters in K-EDTA antistollingsmiddel geoogst werden opgenomen in de studie. De MFC-gegevens werden geanalyseerd in het ontbreken van informatie over de patiënten. Retrospectieve studie toonde aan dat de BM monsters van 7 gezonde donoren (5 mannetjes en 2 vrouwtjes met een gemiddelde leeftijd van 47.4 [35-48], 11 personen met geen bewijs van een hematopoietische ziekte (8 reutjes en 3 teefjes met een gemiddelde leeftijd van 57,9 [35-72]) en 36 gevallen met verschillende waren ...

Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

De MDS-diagnose is moeilijk in de afwezigheid van morfologische criteria of niet-informatieve cytogenetica. MFC kan helpen verfijnen van het diagnostisch proces van MDS. Om te worden nuttig zijn voor de klinische praktijk, de MFC analyse moet worden gebaseerd op parameters met voldoende gevoeligheid en specificiteit en gegevens moeten worden gereproduceerd tussen verschillende exploitanten.

Database-geleide Flow-cytometry voor evaluatie van het beenmerg myeloïde cel rijping

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden bij de diagnose van myeloïde ziekten zoals myelodysplasiesyndromen of andere hematologische ziekten die evolueren met rijpingsafwijkingen in myeloïde celstamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de subjectiviteit van de onderzoeker in die analyse en interpretatie vermindert. Deze methode kan inzicht geven in welke de meest discriminerende parameters voor myelodysplasie zijn.Het maakt kwantificering van de verschillen van normale myeloïde cel populaties. Het aantonen van de procedure zal Tiphanie Picot, een post-doctorale collega van ons laboratorium. Begin met het mengen van 600 microliter van het primaire celmonster met 10 milliliter wasbuffer in een conische buis van 15 milliliter voor twee centrifugaties en 10 milliliter verse wasbuffer per wasmachine.Na de tweede wasbeurt, opnieuw opschorten de pellet in 400 microliter verse wasbuffer, en breng 350 microliter van de cel suspensie in een vijf milliliter polypropyleen FACS buis, met het hele paneel van backbone antilichamen. Na het grondig mengen van de cellen, pipet gelijke volumes van de cel antilichaam oplossing in drie nieuwe polypropyleen buizen, en breng het uiteindelijke volume in elke buis tot 200 microliters met verse wasbuffer indien nodig. Voeg vervolgens het juiste volume antilichamen toe tegen de celoppervlakmarkers die van belang zijn bij het mengen, voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.Voeg aan het einde van de incubatie twee milliliter lysingoplossing toe met het mengen, voor een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Verzamel de gelyseerde cellen door centrifugatie, en gooi alle, behalve de laatste 50 microliter van supernatant in elke buis, zonder verstoring van de pellet. Schort de pellets opnieuw op in de resterende supernatant, met zachte menging, en voeg twee milliliter verse wasbuffer toe aan elk monster.Gooi na de tweede wasbeurt de supernatant weg, waardoor er ongeveer 50 microliter restvolume in elke buis achterblijft, zonder de pellet te storen. Schort de pellet opnieuw op in 200 microliter PBS met mengen, voor onmiddellijke analyse. Als u de monsters op een stroomcytometer wilt lezen, opent u eerst een nieuw experiment in de stroomcytometersoftware en wijzigt u het experiment op basis van de naam, het type monster en de datum.Maak een nieuw exemplaar voor drie buizen en geef de antilichamen op die in elke buis worden gebruikt in de indeling van het experiment. Open de cytometer-instellingen en selecteer toepassingsinstellingen om de waarden toe te passen die zijn verkregen in de maandelijkse installatie. Open een nieuw globaal werkblad en maak de juiste stipplospunten voor het gating van de singletcellen, evenals voor de granulocyten-, monocyten-, ontploffings- en lymfocytenpopulaties.Maak een nieuw globaal werkblad voor de compensatiebesturingselementen. Dan, verwerven 500,000 gebeurtenissen van elke buis, op een gemiddelde overname tarief, het exporteren van de gegevens als fcs 3.0 bestanden, na hun technische validatie. Voordat u een nieuwe analyse start, downloadt u de cyt-bestanden met de normale beenmerggegevens, voor neutrofiele, monocytische en nucleated rode afstammingen en de analysebestanden in inp-formaat.Sla de gegevens vervolgens op op uw bureaublad. Om de neutrofiele rijping op te slaan in de databank, opent u eerst de Infinicyt-software en opent u vervolgens het cytbestand dat overeenkomt met de neutrofiele rijpingsgegevens. Teken het rijpingstraject op de APS-grafiek en sla het rijpingstraject van de neutrophil op naar de database.Open het fcs-bestand voor de neutrofiele afstamming die geanalyseerd moet worden. Upload het neutrofiele rijpingsinp-bestand vanaf het tabblad profielen. De analyse voor deze afstamming is verdeeld in drie stappen.Begin met de selectie van CD34 positieve, neutrofiele-gepleegde ontploffingen. Gebruik hiervoor een kruising van zeven poorten, om de selectie van de CD34 positieve, CD117 positieve, HLADR laag, CD10 negatief, CD13 positieve, CD11 b-negatieve gebeurtenissen mogelijk te maken. Vervolg de analyse met de selectie van de CD117 positieve, CD34 negatieve neutrofiele precursoren.Zet de analyse voort met de selectie van meer volwassen neutrofiele cellen. Toon vervolgens de analyse van monocytische afstammingcellen. Teken het rijpingstraject op de APS-grafiek.Controleer of de pijl die het gevoel van rijping aangeeft is gericht van onrijpe, monocytische cellen, CD14 negatief, IREM2 negatief, op de volwassen monocyten, CD14 positief, IREM2 positief. Bewaar de rijpingsroute voor monocytische afstamming in de database. Open het fcs-bestand voor monocytische afstamming rijping die moet worden geanalyseerd.Upload het profiel voor monocytische afstamminganalyse. Om de monocytische lijncellen te identificeren, gebruikt u een kruising van vier poorten waarmee de selectie van CD64 positieve hoog, CD117 positief, CD117 negatief, HLADR positieve gebeurtenissen mogelijk maakt. Wijs deze gebeurtenissen toe aan het monocytische tabblad in de structuur van de bevolkingshiërarchie.Open het NRC-cytbestand dat opgeslagen moet worden in de NRC-database. Teken het rijpingstraject op de APS-grafiek en sla de nucleated rode cellen rijpingsroute naar de database op. Open het fcs-bestand dat geanalyseerd moet worden.Upload vanuit de profielen de sjabloon van analyse voor nucleated rode cellen. De analyse voor deze afstamming is verdeeld in twee stappen. Te beginnen met de selectie van de CD34 positieve, erythroid gepleegd ontploffing.Gebruik hier een kruispunt van zeven poorten om de selectie van de CD34 positieve, CD117 positieve, HLADR laag, CD105 positief, CD33 negatief, CD36 positieve, CD71 positieve gebeurtenissen mogelijk te maken. Wijs deze gebeurtenissen toe aan het tabblad NRC in de bevolkingshiërarchie. Verwijder de CD34 positieve erythroroid gepleegd ontploffing van het zicht.Om meer volwassen erythroid cellen te identificeren, gebruik maken van een kruising van vier poorten die discriminatie van CD45 negatief en CD45 positieve laag, side-scatter laag, CD36 positief hoog, en CD71 positief hoog mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de CD36 high side scatter lage bloedplaatjes uit de nucleated rode cellen en wijs deze populatie toe aan het tabblad NRC. Open het cyt-bestand dat overeenkomt met de afstamming van de belangstelling van de zaak die moet worden geëvalueerd om de myeloïde rijping in het beenmergcompartiment te beoordelen.Houd alleen de gebeurtenissen die zijn toegewezen aan het tabblad van de neutrophil in de structuur van de bevolkingshiërarchie zichtbaar. Teken het rijpingstraject op de APS-grafiek en laad de database die overeenkomt met de rijping van de neutrophil in normaal beenmerg en vergelijk gegevens. Als de gegevens ten minste gedeeltelijk compatibel zijn, maakt de software een diagram voor genormaliseerde rijpingsverschillen en een parameterband om de rijpingsverschillen te visualiseren.Om de rijping van monocyten in het beenmergcompartiment te vergelijken, voor een nieuw geval met gegevens van normale beenmerg, ook in de monocytendatabase, opent u het cytbestand dat overeenkomt met de monocytische cellijn. Houd alleen de gebeurtenissen die zijn toegewezen aan het tabblad monocyten in de hiërarchiestructuur van de populaties zichtbaar en teken het rijpingspad in de APS-grafiek. Laad de database die overeenkomt met de rijping van de monocyten in normale beenmerg en vergelijk gegevens.Om de nucleated rode cellen rijping in het beenmergcompartiment te vergelijken, voor een nieuw geval, met gegevens van de normale beenmerg, opgenomen in de NRC-database, open het cytbestand dat overeenkomt met de afstamming van de NRC. Houd alleen de gebeurtenissen die zijn toegewezen aan het tabblad NRC in de structuur van de bevolkingshiërarchie zichtbaar. En teken de rijpingsroute op de APS grafiek.Laad de database die overeenkomt met de NRC-rijping in normale beenmerg en vergelijk gegevens. Klik vervolgens op genormaliseerde rijpingsverschillen en zoom op genormaliseerde rijpingsverschillen om de betekenis van de verschillen tussen het nieuwe bestand en de gegevens in de database te visualiseren. Vergeet niet dat methoden die de hiërarchische classificatiealgoritmen in de stroomcytometrische gegevensanalyse gebruiken, zeer subjectief en inherent onjuist zijn, omdat ze niet meetellen voor overlapping van celpopulaties.De evaluatie van nieuwe gevallen van cytopenie, waarvan wordt vermoed dat ze MDS zijn tegen de myeloïde normale rijpingsdatabanken, maken het mogelijk om abnormaal uitgedrukte rijpingsantigen van neutrofiele, monocyten en NRC-geslachten te identificeren, zelfs in gevallen zonder cytologische of cytogene afwijkingen. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de stroom cytometrische gegevens te verwerven, op gestandaardiseerde manier, om maandelijkse cytometer instelling setup uit te voeren, dagelijkse controles, om het antilichaam voor gebruik grondig pipette, en om de kleuring tijden te respecteren. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals kompas worden uitgevoerd om de verschillende groep gevallen te vergelijken en om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de uiteindelijke typische afdruk is voor een bepaalde groep gevallen.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor de onderzoekers die geïnteresseerd waren in het verkennen van myeloïde celrijpingspatronen, in gevallen van kloonhematopoiesis met onbepaald potentieel om de uiteindelijke veranderingen te identificeren die betrouwbaar gerelateerd zijn aan dysplastisch proces. Houd er rekening mee dat het bijwerken van de database met een verhoogd aantal gegevens van gezonde donoren de robuustheid van de analyse kan verbeteren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

High Throughput Sequentiële ELISA voor de validatie van biomarkers van acute graft-versus-Host ziekte

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Pre-klinische evaluatie van tyrosinekinaseremmers voor de behandeling van acute leukemie

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Aanpassing van semiautomated doorgeven Tumor Cell (CTC) Testen voor Klinisch en preklinisch onderzoek naar toepassingen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Femorale beenmergaspiratie in levende muizen

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Combineren volumetrische Capnography en barometrische Plethysmography voor het meten van de Long structuur-functie relatie

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Flow Cytometrie Analyse van immune cell subsets binnen de Murine Milt, Beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel in een artrose model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolatie en teelt van mandibulaire beenmerg mesenchymale stamcellen bij ratten

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...