Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
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Les anticorps utilisés dans cette étude ont été fournies par BD Biosciences. Les auteurs tiennent à remercier leur collègue, Dr Pascale Flandrin-Gresta, du département de biologie moléculaire, laboratoire d’hématologie, University Hospital de Saint-Etienne, France, qui a fourni l’expertise pour l’interprétation des données d’end pendant la seconde Cas MDS. Les auteurs sont reconnaissants pour les hématologues clinicien pour leur intérêt et leur participation à cette étude et pour les patients et les donneurs sains pour leur accord pour participer à cette étude. Les auteurs tiens également à remercier la Fondation « Les Amis de Rémi » aide financière pour la publication.

Le protocole ci-dessous a été approuvé par le « Comité de Protection des Personnes » (Comité d’éthique indépendant) 1 sud-est de University Hospital de Saint-Etienne, France.
1. paramètres du cytomètre en
Remarque : Les paramètres cytomètre ont été réalisés selon les recommandations découlent de la France, conformément à la EuroFlow procédure « protocole d’exploitation EuroFlow Standard (SOP) pour le réglage de l’Instrument et l’inde...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

La qualité de l’aspiration de la BM pourrait avoir une incidence sur le résultat final. L’hémodilution de l’aspiration de la BM pourrait fausser la distribution des cellules dans les différents stades de maturation en raison de l’absence de cellules souches ou cellules précurseurs. Probablement employant un vrac lyse méthode peut-être contribuer à la normalisation de la ponction de la BM pour l’hémodilution dans les analyses de cytométrie en flux. En outre, les étapes essentielles pour l’évaluatio...

En l’absence de marqueurs phénotypiques spécifiques aux changements dysplasiques se produisant dans les cellules myéloïdes pendant l’initiation MDS et la progression, une nouvelle approche a été proposée ces dernières années, basée sur l’évaluation des voies de maturation (expression altérée de les antigènes myéloïdes durant la production de cellules myéloïdes matures) ou de la distribution anormale des différents types de cellules dans la moelle osseuse (BM) cellule compartiments1,2.
Cet article présente une nouvelle méthode d’application normalisée des MFC afin de détecter les changements dysplasiques dans les compartiments de la cellule myéloïde BM associés à des syndromes myélodysplasiques (SMD) ou d’autres maladies hématologiques myéloïdes. Cette étude montre également l’utilité d’utiliser des bases de données de maturation pour l’analyse de données MFC.
Normalisation de la procédure de préparation d’échantillon, d’acquisition de données et analyse en utilisant les bases de données permettrait l’identification des anomalies phénotypiques plus pertinentes liées aux changements dysplasiques dans les cellules myéloïdes BM. Par conséquent, les sous-ensembles statistiquement sélectionnés selon des formats bien étiquetés et reconnus (séparateur de Population automatique (APS) diagrammes, histogrammes et parcelles de dot) sont requis pour développer une stratégie d’analyse qui peut être utilisée dans une analyse ultérieure arrondit. La découverte d’anomalies phénotypiques robustes MDS faciliterait le diagnostic dans les cas avec ou sans dysplasie morphologique minime et sans aberrancies cytogénétiques. Identification des paramètres discriminatoires permettant la réduction des panneaux immunophénotypiques peut simplifier l’actuel scores2, permettant leur applicabilité dans les laboratoires de pathologie clinique.
Cette méthode limite les interprétations subjectives de cytométrie de flux de données, comme ont été signalé en MDS diagnostic3. Cette étape est un préalable à l’élaboration d’outils automatisés pour le traitement et l’analyse des flux de données4.
MDS comprend un groupe hétérogène d’affections clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dont les mutations du splicéosome coopèrent avec des modificateurs spécifiques épigénétiques de céder le phénotype MDS. On sait maintenant que, ainsi que des mutations de HSC, autres mécanismes sont impliqués dans la physiopathologie MDS, telles que l’inflammation d’origine immunitaire aberrante et interactions entre autorenouveler maligne et le micro-environnement stromal de la BM. Toutefois, ces mécanismes restent mal compris. L’hétérogénéité large clinique et biologique de MDS rend le diagnostic et le choix de la pharmacothérapie optimale par un défi. Au cours de la dernière décennie, plusieurs études ont montré que les MFC est souvent plus sensible dans la détection de la dysplasie2 que la morphologie, mais les contraintes techniques et économiques rendent cette technique difficile à normaliser, avec des résultats souvent selon le le expérience de l' interprète3. En outre, on ne sait pas comment MFC peut faire pencher la balance vers MDS dans les cas avec ou sans dysplasie morphologique minime et en l’absence d’anomalies cytogénétiques ou dans des cas limites telles que hypocellular MDS, avec un nombre faible souffle, d’autre non clonale BM des troubles tels que l’insuffisance médullaire (i.e., anémie aplasique). Aussi, il reste difficile de différencier les cas limites de MDS avec un excès de blastes de leucémie myéloïde aiguë (LMA). Pour toutes ces raisons, le Guide de pratique clinique ne s’intègrent pas MFC testing dans le diagnostic final de MDS. En 2011, l’US National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recommandé MFC permettant d’estimer le pourcentage de cellules CD34 +, détection des clones de l’hémoglobinurie paroxystique nocturne et la présence de clones de lymphocytes T cytotoxiques dans hypocellular MDS5. Ces deux derniers cas impliquent également un objectif thérapeutique parce que les données cliniques ont montré une bonne réponse de ces patients à un traitement immunosuppresseur6. Les lignes directrices NCCN 2017, citant les recommandations du groupe de travail International (GTI), énumérés immunophénotypage aberrant de détection par MFC parmi les critères Co pour MDS diagnostic, mais sans faire aucune fiche6. En outre, la classification de l’OMS publiée récemment stipule que les constatations MFC seules ne suffisent pas établir un diagnostic primaire de MDS en l’absence de données morphologiques et/ou cytogénétique concluantes7. Toutefois, les MFC peut servir comme un essai supplémentaire montrant le dérèglement des cellules myéloïdes patrons de maturation et de quantifier la « distance de la normale » pour un patient à un moment précis de l’évolution de la maladie.
Cette méthode est applicable aux laboratoires cliniques intéressés par l’évaluation de dysplasie dans les cellules myéloïdes BM à l’aide de MFC immunophénotypage, afin d’affiner le diagnostic en MDS ou d’autres troubles myéloïdes avec anomalies dysplasiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

Un groupe de travail initié au sein de l’Association Français de cytométrie en flux (AFC) a été développé afin d’harmoniser l’application de la cytométrie multiparamétrique (MFC) pour le diagnostic myéloïde en France. Le protocole présenté ici a été convenue et appliquée entre septembre 2013 et 2015 de novembre dans six laboratoires diagnostiques Français (centres hospitaliers universitaires de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice et Lille et Institut Paoli-Calmettes dans Marseille) et a permis la normalisation de la moelle osseuse échantillon préparation et acquisition de données. Trois bases de données de maturation ont été développées pour les neutrophiles, monocytes et lignées érythroïde avec la moelle osseuse d’individus donateurs « sain » (individus sans aucune preuve d’une maladie hématopoïétique). Une solide méthode d’analyse pour chaque lignée myéloïde devrait être applicable pour le diagnostic systématique. De nouveaux cas peuvent être analysés de la même façon et comparés à des bases de données habituelles. Ainsi, des anomalies quantitatives et qualitatives phénotypiques peuvent être identifiés et ceux au-dessus de 2SD comparés aux données des échantillons de moelle osseuse normale devraient considérer comme révélateur de la pathologie. La limitation majeure est la variabilité plus élevée entre les données obtenues en utilisant les anticorps monoclonaux obtenus avec les méthodes basées sur les technologies d’hybridomes et actuellement utilisés dans le diagnostic clinique. Établissant des critères de validation technique des données acquises peut contribuer à améliorer l’utilité de MFC pour les diagnostics MDS. La mise en place de ces critères exige l’analyse contre une base de données. La réduction de la subjectivité du chercheur en analyse de données est un important avantage de cette méthode.

Les 54 échantillons BM récoltés en anticoagulant K-EDTA ont été inclus dans l’étude. Le MFC ont été analysées en l’absence de toute information sur les patients. Étude rétrospective a montré que les échantillons de BM étaient de 7 donneurs sains (5 mâles et 2 femelles avec un âge médian de 47,4 [35-48], 11 personnes sans aucun signe d’une maladie hématopoïétique (8 mâles et 3 femelles avec un âge médian de 57,9 [35-72]) et 36 cas avec divers certaines patholo...

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Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.

Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le diagnostic des maladies myéloïdes telles que les syndromes de myélodysplasie ou d’autres maladies hématologiques qui évoluent avec des anomalies de maturation dans les lignées cellulaires myéloïdes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit la subjectivité de l’investigateur dans cette analyse et interprétation. Cette méthode peut fournir un aperçu des paramètres les plus discriminatoires pour la myélodysplasie.Il permet la quantification des différences des populations normales de cellules myéloïdes. Tiphanie Picot, boursier postdoctoral de notre laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par mélanger 600 microlitres de l’échantillon de cellules primaires avec 10 millilitres de tampon de lavage dans un tube conique de 15 millilitres pour deux centrifugations et 10 millilitres de tampon de lavage frais par lavage.Après le deuxième lavage, suspendre à nouveau la pastille dans 400 microlitres de tampon de lavage frais, et transférer 350 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube FACS en polypropylène de cinq millilitres, contenant l’ensemble du panneau d’anticorps épine dorsale. Après avoir soigneusement mélangé les cellules, pipette égale volumes de la solution d’anticorps cellulaire en trois nouveaux tubes de polypropylène, et apporter le volume final dans chaque tube jusqu’à 200 microlitres avec tampon de lavage frais si nécessaire. Ensuite, ajoutez le volume approprié d’anticorps contre les marqueurs de surface cellulaire d’intérêt avec le mélange, pour une incubation de 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.À la fin de l’incubation, ajouter deux millilitres de solution de lysing avec mélange, pour une incubation de 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Recueillir les cellules lysées par centrifugation, et jeter tous sauf les 50 derniers microlitres de supernatant dans chaque tube, sans déranger la pastille. Suspendre à nouveau les granulés dans le supernatant restant, avec un mélange doux, et ajouter deux millilitres de tampon de lavage frais à chaque échantillon.Après le deuxième lavage, jeter le supernatant, en laissant environ 50 microlitres de volume résiduel dans chaque tube, sans déranger la pastille. Suspendre à nouveau la pastille dans 200 microlitres de PBS avec mélange, pour une analyse immédiate. Pour lire les échantillons sur un cytomètre d’écoulement, ouvrez d’abord une nouvelle expérience dans le logiciel de cytomètre de flux, et renommez l’expérience selon le nom, le type d’échantillon et la date.Créez un nouveau spécimen pour trois tubes et spécifiez les anticorps utilisés dans chaque tube dans la disposition de l’expérience. Ouvrez les paramètres du cytomètre et sélectionnez les paramètres d’application pour appliquer les valeurs obtenues dans la configuration mensuelle. Ouvrez une nouvelle feuille de travail globale et créez les parcelles de points appropriées pour les cellules singlet, ainsi que pour les populations de granulocytes, de monocytes, de blastes et de lymphocytes.Créez une nouvelle feuille de travail globale pour les contrôles de rémunération. Ensuite, acquérir 500.000 événements de chaque tube, à un taux d’acquisition moyen, l’exportation des données comme fcs 3.0 fichiers, après leur validation technique. Avant de commencer une nouvelle analyse, téléchargez les fichiers cyt contenant les données normales de moelle osseuse, pour les lignées rouges neutrophiles, monocytiques et nucléées, et les fichiers d’analyse en format inp.Ensuite, enregistrez les données sur votre bureau. Afin d’enregistrer la maturation du neutrophile à la base de données, ouvrez d’abord le logiciel Infinicyt, puis ouvrez le fichier cyt correspondant aux données de maturation des neutrophiles. Dessinez la voie de maturation sur le graphique APS et enregistrez la voie de maturation du neutrophile vers la base de données.Ouvrez le fichier fcs pour la maturation de la lignée neutrophile qui doit être analysée. Téléchargez le fichier inp de maturation neutrophile à partir de l’onglet profils. L’analyse de cette lignée est divisée en trois étapes.Commencez par la sélection de souffles cd34 positifs et engagés dans la neutrophile. À cet effet, utiliser une intersection de sept portes, pour permettre la sélection des CD34 positifs, CD117 positifs, HLADR faible, CD10 négatif, CD13 positif, CD11 événements b-négatifs. Poursuivre l’analyse avec la sélection des précurseurs négatifs du neutrophile CD117 positif et CD34.Poursuivre l’analyse avec la sélection de cellules neutrophiles plus matures. Ensuite, montrez l’analyse des cellules de lignée monocytique. Dessinez la voie de maturation sur le graphique APS.Vérifiez que la flèche indiquant le sens de la maturation est orientée des cellules immatures et monocytiques, CD14 négatif, négatif IREM2, aux monocytes matures, CD14 positif, IREM2 positif. Enregistrez la voie de maturation de la lignée monocytique dans la base de données. Ouvrez le fichier fcs pour la maturation de lignée monocytique qui doit être analysée.Téléchargez le profil pour l’analyse de la lignée monocytique. Pour identifier les cellules de lignée monocytique, utilisez une intersection de quatre portes qui permet la sélection de CD64 positif élevé, CD117 positif, CD117 négatif, HLADR événements positifs. Attribuez ces événements à l’onglet monocytique de l’arbre de hiérarchie de la population.Ouvrez le fichier cyt du CNRC qui doit être enregistré dans la base de données du CNRC. Dessinez la voie de maturation sur le graphique APS et enregistrez la voie de maturation des globules rouges nucléés vers la base de données. Ouvrez le fichier fcs qui doit être analysé.Téléchargez à partir des profils le modèle d’analyse des globules rouges nucléés. L’analyse de cette lignée est divisée en deux étapes. En commençant par la sélection du CD34 positif, érythroïde commis explosions.Ici, utilisez une intersection de sept portes pour permettre la sélection du CD34 positif, CD117 positif, HLADR faible, CD105 positif, CD33 négatif, CD36 positif, CD71 événements positifs. Attribuez ces événements à l’onglet CNRC dans la hiérarchie de la population. Retirez les explosions d’érythroïdes positifs CD34 de la visibilité.Pour identifier les cellules érythroïdes plus matures, utilisez une intersection de quatre portes qui permettent la discrimination des CD45 négatifs et CD45 positifs bas, côté scatter faible, CD36 positif élevé, et CD71 élevé positif. Ensuite, retirez les plaquettes basses de dispersion latérale élevée CD36 des globules rouges nucléés et attribuez cette population à l’onglet CNRC. Pour évaluer la maturation myéloïde dans le compartiment de moelle osseuse, ouvrez le fichier cyt correspondant à la lignée d’intérêt du cas qui doit être évalué.Gardez visibles uniquement les événements attribués à l’onglet du neutrophile dans l’arbre de hiérarchie de la population. Dessinez la voie de maturation sur le graphique APS et chargez la base de données correspondant à la maturation du neutrophile dans la moelle osseuse normale, et comparez les données. Si les données sont au moins partiellement compatibles, le logiciel créera un diagramme normalisé des différences de maturation, et une bande de paramètres, pour visualiser les différences de maturation.Pour comparer la maturation des monocytes dans le compartiment de moelle osseuse, pour un nouveau cas avec les données des moelles osseuses normales, y compris dans la base de données des monocytes, ouvrez le fichier cyt correspondant à la lignée cellulaire monocytique. Gardez visibles uniquement les événements attribués à l’onglet monocytes dans l’arbre de hiérarchie des populations et dessinez la voie de maturation sur le graphique APS. Chargez la base de données correspondant à la maturation des monocytes dans les moelles osseuses normales et comparez les données.Pour comparer la maturation des globules rouges nucléés dans le compartiment de la moelle osseuse, pour un nouveau cas, avec les données des moelles osseuses normales, incluses dans la base de données du CNRC, ouvrez le fichier cyt correspondant à la lignée du CNRC. Gardez visibles uniquement les événements attribués à l’onglet CNRC dans l’arbre de hiérarchie de la population. Et dessiner la voie de maturation sur le graphique APS.Chargez la base de données correspondant à la maturation du CNRC dans les moelles osseuses normales et comparez les données. Ensuite, pour visualiser l’importance des différences entre le nouveau fichier et les données incluses dans la base de données, cliquez sur les différences de maturation normalisées et zoomez. N’oubliez pas que les méthodes qui utilisent les algorithmes hiérarchiques de classification dans l’analyse des données cytométriques de flux sont hautement subjectives et intrinsèquement inexactes, parce qu’elles ne comptent pas pour le chevauchement de la population cellulaire.L’évaluation de nouveaux cas de cytopédia, soupçonnés d’être MDS contre les bases de données normales myéloïdes de maturation, permettent l’identification des antigènes de maturation anormalement exprimés des lignées de neutrophile, de monocyte, et de NRC, même dans les cas sans anomalies cytologiques ou cytogéniques. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’acquérir les données cytométriques de flux, de manière normalisée, pour effectuer la configuration mensuelle de réglage de cytomètre, les contrôles quotidiens, pipette rigoureusement l’anticorps avant utilisation, et de respecter les temps de coloration. Après cette procédure, une autre méthode comme la boussole, peut être effectuée pour comparer les différents groupes de cas, et pour répondre à d’autres questions, telles que ce qui est l’empreinte typique finale pour un groupe particulier de cas.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs intéressés à explorer les modèles de maturation des cellules myéloïdes, dans les cas d’hématopoïèse clonale du potentiel indéterminé pour identifier les changements typiques finaux liés de manière fiable au processus dysplastique. Veuillez noter que la mise à jour de la base de données avec un nombre accru de données provenant de donneurs en bonne santé peut améliorer la robustesse de l’analyse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Recherche

Médecine

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Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

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Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

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