Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
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In dieser Studie verwendeten Antikörper wurden von BD Biosciences bereitgestellt. Die Autoren möchte ihre Kollegin Dr. Pascale Flandrin-Gresta, vom Department of Molecular Biology, Hämatologie-Labor, Universität Krankenhaus Saint-Etienne, Frankreich, versorgte sie mit Fachwissen für die Interpretation der NGS-Daten für die zweite MDS-Fall. Die Autoren sind dankbar für die Kliniker Hämatologen für ihr Interesse und ihre Beteiligung an dieser Studie auch für die Patienten und gesunden Spendern für ihre Zustimmung zur Teilnahme an dieser Studie. Die Autoren möchte auch die "Les Amis de Rémi" Stiftung für finanzielle Unterstützung für die Veröffentlichung zu danken.

Die unten aufgeführten Protokoll genehmigt wurde, durch das "Comité de Protection des Personnes" (unabhängigen Ethik-Kommission) Sud-Est 1 aus Universität Krankenhaus Saint-Etienne, Frankreich.
(1) Cytometer Einstellungen
Hinweis: Die Cytometer Einstellungen erfolgten nach Frankreich fließen Empfehlungen nach EuroFlow Verfahren "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) für Inbetriebnahme und Entschädigung (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

Die Qualität der BM Aspirat könnte auf das Endergebnis auswirken. Die Polopiryna der BM-Aspirat könnte die Verteilung der Zellen in verschiedenen Stadien der Reifung aufgrund des Fehlens von Vorfahren oder Vorstufen verfälschen. Normalisierung der BM Aspiraten für Polopiryna im Fluss durchflusszytometrischen Analyse kann helfen, wahrscheinlich einen Großteil Lyse Methode beschäftigt. Darüber hinaus sind die entscheidenden Schritte zur Bewertung von BM myeloische Dysplasie durch Durchflusszytometrie die Probe Vera...

In Ermangelung der phänotypischen Marker speziell für die dysplastischen Veränderungen in myeloische Zellen während MDS Initiation und Progression schlägt ein neuer Ansatz in den letzten Jahren, basierend auf der Auswertung der Reifung Bahnen (veränderte Expression von myeloische Antigene bei der Herstellung von Reifen myeloische Zellen) oder abnorme Verteilung der verschiedenen Zelltypen im Knochenmark (BM) Zelle Fächer1,2.
Dieser Artikel stellt eine neue Methode für standardisierte Anwendung von MFC um dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen Fächer im Zusammenhang mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder anderen myeloischen hämatologischen Krankheiten zu erkennen. Diese Studie zeigt auch das Dienstprogramm Reifung Datenbanken für MFC Datenanalyse zu verwenden.
Standardisierung der Vorbereitung Beispielprozedur, Datenerfassung und Analyse mit den Datenbanken würde es der relevantesten phänotypischen Anomalien im Zusammenhang mit dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen ermöglichen. Daher sind statistisch ausgewählte Teilmengen basierend auf gut beschriftet und anerkannter Formaten (automatische Bevölkerung Separator (APS) Diagramme, Histogramme und Punkt plottet) erforderlich für die Entwicklung einer Strategie-Analyse, die in der nachfolgenden Analyse verwendet werden können Runden. Die Entdeckung der robuste phänotypischen Anomalien bei MDS würde in Fällen mit oder ohne minimale morphologische Dysplasie und zytogenetische Aberrancies die Diagnose erleichtern. Identifikation der diskriminierenden Parameter ermöglicht die Reduzierung der Immunophenotypic Platten kann die aktuelle Resultate2, deren Anwendbarkeit im klinischen Pathologie-Labor bei schönem vereinfachen.
Diese Methode schränkt die subjektiven Interpretationen der Zytometrie Daten, wie in MDS Diagnose3signalisiert worden. Dieser Schritt ist eine Voraussetzung für die Entwicklung von automatisierten Tools für die Verarbeitung und Analyse fließen Daten4.
MDS umfasst eine heterogene Gruppe von klonalen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Störungen in denen Spliceosome Mutationen mit spezifische epigenetische Modifikatoren den MDS-Phänotyp Ausbeute Zusammenwirken. Es ist nun bekannt, dass zusammen mit HSC Mutationen, MDS Pathophysiologie, z. B. abweichende immunvermittelte Entzündung und Wechselwirkungen zwischen malignen HSCs und die stromale Mikroumgebung des BM andere Mechanismen beteiligt sind. Diese Mechanismen bleiben jedoch schlecht verstanden. Die breite klinische und biologische Heterogenität der MDS macht die Diagnose und die Wahl der optimalen Therapie zu einer Herausforderung. In den letzten zehn Jahren mehrere Studien haben gezeigt, dass MFC oft mehr empfindlich bei der Aufdeckung von Dysplasie2 als Morphologie, aber technische und wirtschaftliche Abhängigkeiten erschweren diese Technik zu standardisieren, mit Ergebnissen oft abhängig von der Erfahrung der Dolmetscher3. Darüber hinaus ist unklar, wie MFC kann Zünglein an der Waage in Richtung MDS in Fällen mit oder ohne minimale morphologische Dysplasie und fehlender zytogenetischer Anomalien oder in Grenzfällen wie Hypocellular MDS, mit einer niedrigen Explosion zählen, von anderen nicht-klonale BM Störungen wie Knochenmarkdepression (i.e., aplastische Anämie). Es bleibt auch schwierige Grenzfälle des MDS mit einem Überschuss von Blasten von akuter myeloischer Leukämie (AML) zu unterscheiden. Aus all diesen Gründen integrieren MFC Tests in die endgültige Diagnose MDS nicht die klinischen Leitlinien. Im Jahr 2011 empfohlen die US nationale umfassende Krebs Network (NCCN) MFC für die Schätzung von den Prozentsatz von CD34 + Zellen, Erkennung von paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie Klone und Vorhandensein von zytotoxischen T-Zell-Klone in Hypocellular MDB-5. Diesen beiden letzteren Fällen beinhalten auch ein therapeutisches Ziel, da klinische Daten haben eine gute Reaktion der Patienten auf immunsuppressive Therapie6gezeigt. Die 2017 NCCN-Richtlinien, unter Berufung auf die internationalen arbeiten Group (IWG) Empfehlungen aufgeführt aberranten Immunphänotypisierung Erkennung von MFC zu den KO Kriterien für MDS-Diagnose, ohne jedoch irgendwelche Spezifikationen-6. Außerdem legt die kürzlich veröffentlichte WHO-Klassifikation, dass MFC Erkenntnisse allein nicht ausreichen, Primärdiagnose von MDS bei fehlender schlüssigen morphologischen und/oder zytogenetische Daten7zu etablieren. MFC ist jedoch als ein zusätzlicher Test zeigt die Dysregulation der myeloischen Zellen Reifung Muster und Quantifizierung den "Abstand von" normal "" für einen Patienten zu einem bestimmten Zeitpunkt im Krankheitsverlauf einsetzbar.
Diese Methode ist anwendbar bei klinischen Labors interessiert bei der Bewertung der Dysplasie bei BM myeloische Zellen unter Verwendung von MFC Immunphänotypisierung, um die Diagnose MDS oder anderen myeloischen Erkrankungen mit dysplastischen Anomalien zu verfeinern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

Eine Arbeitsgruppe innerhalb der französischen Zytometrie Verband (AFC) initiiert wurde entwickelt, um die Anwendung der multiparameter Durchflusszytometrie (MFC) in Einklang zu bringen für die myeloischen Krankheit Diagnose in Frankreich. Die hier vorgestellten Protokoll war vereinbarten und angewandte September 2013 bis November 2015 in sechs französischen diagnostische Laboratorien (Universitätskliniken von Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza, und Lille und Institut Paoli-Calmettes in Marseille) und erlaubt die Standardisierung von Knochenmark Probe Vorbereitung und Datenerfassung. Für Neutrophilen, monozytären, und erythroiden Linien mit Knochenmark von "gesunden" Spenders Einzelpersonen (Individuen ohne Nachweis einer hämatopoetischen Krankheit) wurden drei Reifung Datenbanken entwickelt. Eine robuste Methode zur Analyse für jedes myeloid Abstammung sollte für den Routineeinsatz diagnostische Anwendung finden. Neuerkrankungen können auf die gleiche Weise analysiert und mit den üblichen Datenbanken verglichen. So, quantitative und qualitative phänotypische Anomalien identifiziert werden können und den oben genannten 2SD im Vergleich mit Daten des normalen Knochenmarkproben gezogen werden bezeichnend für Pathologie. Die größte Beschränkung ist die höhere Variabilität zwischen den Daten mit Hilfe der monoklonale Antikörper erhalten mit den Methoden basieren auf Hybridom-Technologien und derzeit in der klinischen Diagnostik eingesetzt. Festlegung von Kriterien für technische Validierung der gewonnenen Daten kann dazu beitragen das MFC-Dienstprogramm für die MDS-Diagnostik. Die Festlegung dieser Kriterien erfordert eine Analyse anhand einer Datenbank. Die Reduzierung der Ermittler Subjektivität in der Datenanalyse ist ein wichtiger Vorteil dieser Methode.

Die 54 BM-Proben im K-EDTA Antikoagulans geerntet wurden in die Studie einbezogen. Die MFC-Daten wurden in Ermangelung von Informationen über die Patienten analysiert. Retrospektive Studie zeigte, dass die BM-Proben von 7 gesunden Spendern (5 Rüden und 2 Hündinnen mit einem Durchschnittsalter von 47,4 [35-48], 11 Personen ohne Anzeichen einer hämatopoetischen Krankheit (8 Männer und 3 Frauen mit einem Durchschnittsalter von 57,9 [35-72]) und 36 Fälle mit verschiedenen pathologische...

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Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.

Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Diagnose von myeloiden Erkrankungen wie Myelodysplasie-Syndrome oder andere hämatologische Erkrankungen zu beantworten, die sich mit Reifeanomalien in myeloiden Zelllinien entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Subjektivität des Prüfers bei dieser Analyse und Interpretation verringert. Diese Methode kann Einen Einblick geben, welche die diskriminierendsten Parameter für Myelodysplasie sind.Es ermöglicht die Quantifizierung der Unterschiede zu normalen myeloischen Zellpopulationen. Demonstriert wird das Verfahren von Tiphanie Picot, einem Postdoktoranden aus unserem Labor. Beginnen Sie mit dem Mischen von 600 Mikrolitern der primären Zellprobe mit 10 Milliliter Waschpuffer in einem 15 Milliliter Konustube für zwei Zentrifugationen und 10 Milliliter frischer Waschpuffer pro Waschgang.Nach der zweiten Wäsche das Pellet in 400 Mikroliter frischer Waschpuffer wieder aufhängen und 350 Mikroliter der Zellsuspension in ein fünf Milliliter Polypropylen-FACS-Rohr übertragen, das die gesamte Platte von Backbone-Antikörpern enthält. Nach gründlichem Mischen der Zellen, Pipette gleiche Volumen der Zellantikörperlösung in drei neue Polypropylen-Röhren, und bringen Sie das endgültige Volumen in jedem Rohr bis zu 200 Mikroliter mit frischem Waschpuffer bei Bedarf. Als nächstes fügen Sie das entsprechende Volumen von Antikörpern gegen die Zelloberflächenmarker von Interesse mit Mischen, für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.Am Ende der Inkubation zwei Milliliter Lysing-Lösung mit Mischen hinzufügen, für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Sammeln Sie die lysierten Zellen durch Zentrifugation, und entsorgen Sie alle bis auf die letzten 50 Mikroliter Überstand in jedem Rohr, ohne das Pellet zu stören. Die Pellets im verbleibenden Überstand mit sanftem Mischen wieder aufhängen und jeder Probe zwei Milliliter frischen Waschpuffer hinzufügen.Nach der zweiten Wäsche, entsorgen Sie den Überstand, so dass etwa 50 Mikroliter Restvolumen in jedem Rohr, ohne das Pellet stören. Das Pellet in 200 Mikroliter PBS mit Mischen wieder aufhängen, zur sofortigen Analyse. Um die Proben auf einem Durchflusszytometer zu lesen, öffnen Sie zunächst ein neues Experiment in der Durchflusszytometer-Software, und benennen Sie das Experiment entsprechend dem Namen, dem Probentyp und dem Datum um.Erstellen Sie eine neue Probe für drei Röhren, und geben Sie die Antikörper an, die in jedem Rohr im Experimentlayout verwendet werden. Öffnen Sie die Zytometereinstellungen, und wählen Sie Anwendungseinstellungen aus, um die in der monatlichen Einrichtung erhaltenen Werte anzuwenden. Öffnen Sie ein neues globales Arbeitsblatt, und erstellen Sie die entsprechenden Punktdiagramme zum Gating der Singlet-Zellen sowie für die Populationen Granulozyt, Monozyten, Explosion und Lymphozyten.Erstellen Sie ein neues globales Arbeitsblatt für die Vergütungssteuerelemente. Erwerben Sie dann 500.000 Ereignisse aus jeder Röhre, mit einer mittleren Erfassungsrate, und exportieren Sie die Daten nach ihrer technischen Validierung als fcs 3.0-Dateien. Laden Sie vor Beginn einer neuen Analyse die Cyt-Dateien mit den normalen Knochenmarkdaten für neutrophile, monozytäre und nukleierte rote Linien sowie die Analysedateien im Inp-Format herunter.Speichern Sie dann die Daten auf Ihrem Desktop. Um die Neutrophilenreifung in der Datenbank zu speichern, öffnen Sie zuerst die Infinicyt-Software und dann die Cyt-Datei, die den Neutrophilen-Reifungsdaten entspricht. Zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm, und speichern Sie den Reifungspfad des Neutrophilen in der Datenbank.Öffnen Sie die fcs-Datei für die neutrophile Abstammungsreifung, die analysiert werden muss. Laden Sie die Neutrophilen-Reifungs-Inp-Datei von der Registerkarte Profile hoch. Die Analyse für diese Abstammung ist in drei Schritte unterteilt.Beginnen Sie mit der Auswahl der CD34-positiven, neutrophilen Sprengungen. Verwenden Sie dazu einen Schnittpunkt von sieben Gates, um die Auswahl der CD34-positiven, CD117-positiven, HLADR-tief, CD10-negativ, CD13-positiven, CD11 b-negativen Ereignisse zu ermöglichen. Setzen Sie die Analyse mit der Auswahl der CD117-positiven, CD34-negativen Neutrophilen-Vorstufen fort.Setzen Sie die Analyse mit der Auswahl reiferer neutrophiler Zellen fort. Zeigen Sie als Nächstes die Analyse monozytierter Linienzellen. Zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm.Stellen Sie sicher, dass der Pfeil, der den Reifungssinn angibt, von unreifen, monozytischen Zellen, CD14 negativ, IREM2 negativ, zu den reifen Monozyten, CD14 positiv, IREM2 positiv ausgerichtet ist. Speichern Sie den Reifungspfad für monozytäre Abstammung in der Datenbank. Öffnen Sie die fcs-Datei für monozytische Linienreifung, die analysiert werden muss.Laden Sie das Profil für die monozytische Abstammungsanalyse hoch. Um die monozytäre Abstammungszellen zu identifizieren, verwenden Sie einen Schnittpunkt von vier Gates, der die Auswahl von CD64-positiven, CD117-positiven, CD117-positiven, HLADR-positiven Ereignissen ermöglicht. Weisen Sie diese Ereignisse der monozytischen Registerkarte in der Bevölkerungshierarchiestruktur zu.Öffnen Sie die NRC-Cyt-Datei, die in der NRC-Datenbank gespeichert werden muss. Zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm, und speichern Sie den Nukleated Red Cells-Reifungspfad in der Datenbank. Öffnen Sie die fcs-Datei, die analysiert werden muss.Laden Sie aus den Profilen die Vorlage für die Analyse für nukleierte rote Zellen hoch. Die Analyse für diese Abstammung ist in zwei Schritte unterteilt. Beginnend mit der Auswahl der CD34 positive, erythroid begangen Explosionen.Verwenden Sie hier einen Schnittpunkt von sieben Gates, um die Auswahl der CD34-positiven, CD117-positiven, HLADR-tief, CD105-positiven, CD33-negativen, CD36-positiven, CD71-positiven Ereignisse zu ermöglichen. Weisen Sie diese Ereignisse der Registerkarte NRC in der Bevölkerungshierarchie zu. Entfernen Sie die CD34 positive Erythroid begangen Eblasten aus der Sichtbarkeit.Um reifere Erythroidzellen zu identifizieren, verwenden Sie einen Schnittpunkt von vier Gates, die die Diskriminierung von CD45-Negativ und CD45-positivem Tief, Side-Scatter-Tief, CD36-positiv-hoch und CD71-positiv hoch ermöglichen. Entfernen Sie dann die CD36-Hochseite, die niedrige Thrombozyten aus den nukleierten roten Zellen streuen, und weisen Sie diese Grundgesamtheit der Registerkarte NRC zu. Um die myeloische Reifung im Knochenmarkfach zu beurteilen, öffnen Sie die Zyt-Datei entsprechend der Interessenlinie aus dem zu bewertenden Fall.Halten Sie nur die Ereignisse sichtbar, die der Registerkarte Neutrophil in der Bevölkerungshierarchie zugewiesen sind. Zeichnen Sie den Reifungsweg auf dem APS-Diagramm, und laden Sie die Datenbank, die der Reifung des Neutrophilen im normalen Knochenmark entspricht, und vergleichen Sie Die Daten. Wenn die Daten zumindest teilweise kompatibel sind, erstellt die Software ein normalisiertes Reifungsdifferenzdiagramm und ein Parameterband, um die Reifungsunterschiede zu visualisieren.Um die Monozytenreifung im Knochenmarkfach zu vergleichen, öffnen Sie für einen neuen Fall mit Daten aus normalen Knochenmarken, einschließlich in der Monozytendatenbank, die Cyt-Datei, die der monozytigen Zelllinie entspricht. Halten Sie nur die Ereignisse, die der Registerkarte Monozyten in der Hierarchiestruktur der Basishaben zugewiesen sind, sichtbar, und zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm. Laden Sie die Datenbank, die der Monozytenreifung in normalen Knochenmarkierungen entspricht, und vergleichen Sie Daten.Um die Nukleated Red Cells Reifung im Knochenmarkfach zu vergleichen, für einen neuen Fall, mit Daten aus den normalen Knochenmark, die in der NRC-Datenbank enthalten sind, öffnen Sie die Cyt-Datei entsprechend der NRC-Linie. Halten Sie nur die Ereignisse sichtbar, die der Registerkarte NRC in der Bevölkerungshierarchie zugeordnet sind. Zeichnen Sie den Reifungspfad im APS-Diagramm.Laden Sie die Datenbank, die der NRC-Reifung entspricht, in normale Knochenmarkren, und vergleichen Sie Daten. Um dann die Bedeutung der Unterschiede zwischen der neuen Datei und den in der Datenbank enthaltenen Daten zu visualisieren, klicken Sie auf normalisierte Reifungsunterschiede und Zoomen. Denken Sie daran, dass Methoden, die die hierarchischen Klassifizierungsalgorithmen in der Flusszytometrischen Datenanalyse verwenden, sehr subjektiv und von Natur aus ungenau sind, da sie für die Überlappung der Zellpopulation nicht zählen.Die Bewertung neuer Fälle von Zytopenie, bei denen der Verdacht besteht, mdS zu sein, anhand der myeloischen Normalreifungsdatenbanken, ermöglicht die Identifizierung von anormal exprimierten Reifungsantigenen von Neutrophilen-, Monozyten- und NRC-Linien, selbst in Fällen ohne zytologische oder zytogene Anomalien. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die zytometrischen Daten des Durchflusses in standardisierter Weise zu erfassen, um monatliche Zytometereinstellungen, tägliche Kontrollen durchzuführen, den Antikörper vor gebrauchen rigoros zu pipetten und die Färbezeiten einzuhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Kompass durchgeführt werden, um die verschiedenen Gruppen von Fällen zu vergleichen und zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. was der endgültige typische Abdruck für eine bestimmte Gruppe von Fällen ist.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher, die an der Erforschung myeloischer Zellreifungsmuster interessiert waren, in Fällen klonaler Hämatopoese unbestimmten Potenzials, um die endgültigen typischen Veränderungen zu identifizieren, die zuverlässig mit dysplastischen Verfahren zusammenhängen. Bitte beachten Sie, dass die Aktualisierung der Datenbank mit einer erhöhten Anzahl von Daten von gesunden Spendern die Robustheit der Analyse verbessern kann.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Forschung

Medizin

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

High Throughput Sequential ELISA zur Validierung von Biomarkern des akuten Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

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Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

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Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

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Kombination von volumetrischen Capnographie und barometrischen Plethysmographie der Lunge-Struktur-Funktions-Beziehung zu messen

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...