Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

נוגדנים השתמשו במחקר זה נמסרו בידי החיים BD. המחברים רוצה להודות שלהם עמית, ד ר פסקל Flandrin-Gresta, מ המחלקה לביולוגיה מולקולרית, המעבדה להמטולוגיה, אוניברסיטת בית החולים של Saint-Etienne, צרפת, שסיפק מומחיות לפרשנויות של נתונים המיתרים השנייה במקרה של MDS. המחברים מודים ההמטולוגים המטפל שלהם עניין ומעורבות במחקר זה, על המטופלים ועל בריא לתורמים את הסכמתם להשתתף במחקר זה. המחברים רוצה גם להודות הקרן "Les אמיס דה Rémi" תמיכה כספית עבור פרסום.

פרוטוקול המפורטים להלן אושרה על ידי "Comité דה הגנה des Personnes" (ועדת האתיקה Independant) Sud-Est 1 מ אוניברסיטת בית החולים של Saint-Etienne, צרפת.
1. Cytometer הגדרות
הערה: ההגדרות cytometer בוצעו על פי המלצות צרפת לזרום, על פי נוהל EuroFlow "EuroFlow תקן הפעלה פרוטוקול (SOP) עבור כלי ההתקנה ופיצויים (https:...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

האיכות של מוניטור וביופסיה יכול להשפיע על התוצאות הסופיות. Hemodilution של וביופסיה מוניטור יכול לעוות את חלוקת תאים בשלבים שונים של ההבשלה בשל היעדרם של אבות או תאים סימנים מקדימים. כנראה העסקת בכמויות גדולות lysing שיטת עשוי לעזור בנורמליזציה של מוניטור aspirates עבור hemodilution זרם cytometric בניתוח. בנוסף,...

בהיעדר ספציפית לשינויים dysplastic המתרחשים בתאי מיאלואידית במהלך החניכה MDS, התקדמות פנוטיפי סמנים, גישה חדשה הוצע בשנים האחרונות, בהתבסס על הערכת המסלולים ההבשלה (ביטוי שונה של אנטיגנים מיאלואידית במהלך הייצור של התאים מיאלואידית בוגרים) או של התפלגות נורמלית של סוגי תאים שונים בתוך מח העצם (מוניטור) תאים תאים1,2.
מאמר זה מציג שיטה חדשה עבור יישום מתוקננת של MFC כדי לזהות שינויים dysplastic בתאים התאים מיאלואידית מוניטור הקשורות תסמונות myelodysplastic (MDS) או מחלות אחרות hematological מיאלואידית. מחקר זה מראה גם את תוכנית השירות של שימוש ההבשלה מסדי נתונים עבור ניתוח נתונים MFC.
סטנדרטיזציה של הליך הכנת המדגם, חדרי קירור והקפאה, ניתוח באמצעות מסדי הנתונים יאפשר זיהוי ליקויים פנוטיפי הרלוונטיים ביותר הקשורים לשינויים dysplastic בתאי מיאלואידית מוניטור. לכן, קבוצות משנה סטטיסטית הנבחר בהתבסס על תבניות הלחצנים הוסף מוכרת היטב (דיאגרמות מפריד האוכלוסייה אוטומטי (APS), היסטוגרמות, וחלקות נקודה) נדרשים עבור פיתוח אסטרטגיית ניתוח יכול לשמש לאחר מכן ניתוח סיבובים. גילוי מומים פנוטיפי חזק ב- MDS תקל את האבחנה במקרים עם או ללא דיספלזיה מורפולוגי מינימלית וללא cytogenetic aberrancies. זיהוי של פרמטרים מפלה המאפשר צמצום של לוחות immunophenotypic עשויה לפשט הנוכחי ציונים2, המתיר שלהם הישימות במעבדות קליניות פתולוגיות.
שיטה זו מגבילה את הפרשנות הסובייקטיבית של cytometry נתונים, כמו היה לשלוח אותן ב- MDS אבחון3. שלב זה הוא תנאי הכרחי להתפתחות של כלים אוטומטיים עבור עיבוד וניתוח זרימת נתונים4.
MDS כוללת קבוצה הטרוגנית של הפרעות המשובטים תאי גזע hematopoietic (HSC) שבו מוטציות ספלייסוזום לשתף פעולה עם הספציפיים המגבילים epigenetic להניב תשואה של פנוטיפ MDS. כיום ידוע כי יחד עם מועדון הכדורגל מונפלייה מוטציות, מנגנונים אחרים המעורבים פתופסיולוגיה MDS, כגון דלקת בתיווך החיסונית סוטה אינטראקציות בין ממאיר HSCs את microenvironment סטרומה של ויטביע. עם זאת, מנגנונים אלה נשארים ממעטים להבין. הטרוגניות לרווחה קליניים והביולוגיה של MDS הופך האבחון, הבחירה של הטיפול האופטימלי אתגר. בעשור האחרון, מחקרים רבים הראו כי ה-MFC הוא לעיתים קרובות יותר רגיש באיתור דיספלזיה2 יותר מורפולוגיה, אבל אילוצים טכניים וכלכליים לעשות את הטכניקה הזו קשה לתקנן, עם תוצאות קרובות בהתאם ניסיון של מתורגמן3. בנוסף, לא ברור איך MFC יכול להטות את הכף לכיוון MDS במקרים עם או ללא דיספלזיה מורפולוגי מינימלי, בהיעדר חריגות cytogenetic, או במקרים גבוליים כגון hypocellular MDS, עם ספירה נמוכה הפיצוץ, מן מוניטור אחרים שאינם המשובטים הפרעות כגון אי ספיקת מח עצם (כלומר., אנמיה אפלסטית). זה גם נשאר קשה להבדיל בין מקרים גבוליים של MDS עם עודף של תקיעות לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מכל הסיבות האלה, ההנחיות הקלינית אינם משתלבים MFC בדיקות לתוך האבחנה הסופית של MDS. בשנת 2011, ארצות הברית הלאומית מקיף סרטן רשת (NCCN) מומלצת MFC ההערכה של האחוז של תאי CD34 +, זיהוי של שיבוטים hemoglobinuria ליליות התקפי, ונוכחות של שיבוטים ציטוטוקסיות תא T ב- MDS hypocellular5. אלה שני מצבים האחרון כרוך גם מטרה טיפולית כי נתונים קליניים הראו תגובה טובה של חולים אלו טיפול לדיכוי המערכת החיסונית6. הנחיות NCCN 2017, בצטטו את המלצות קבוצת העבודה הבינלאומית (IWG), רשום immunophenotyping סוטה זיהוי על-ידי MFC מהקריטריונים שיתוף לאבחון MDS, אך ללא ביצוע כל מפרטי6. בנוסף, סיווג WHO שפורסמו לאחרונה קובע כי הממצאים MFC לבד אינן מספיקות כדי לבסס אבחון ראשי של MDS, בהעדר נתונים מורפולוגיים ו/או cytogenetic חד7. עם זאת, MFC יכול לשמש מבחן נוסף מציג dysregulation של התאים מיאלואידית ההבשלה דפוסי וכימות "מרחק מן הרגיל" עבור חולה בזמן מסוים בקורס המחלה.
שיטה זו ישימה במעבדות קליניות מעוניין בהערכה של דיספלזיה בתאי מיאלואידית מוניטור באמצעות MFC immunophenotyping, על מנת לחדד את האבחנה MDS או הפרעות אחרות מיאלואידית עם מומים dysplastic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

קבוצת עבודה יזם בתוך האגודה Cytometry צרפתית (AFC) פותחה ומשתלבת בהרמוניה היישום של cytometry זרימה multiparameter (MFC) עבור אבחון מחלת מיאלואידית בצרפת. פרוטוקול המובאת כאן הייתה מוסכמת ושימושית בין ספטמבר 2013 בנובמבר 2015 שש מעבדות אבחון צרפתי (בתי חולים אוניברסיטאיים Saint-Etienne, גרנובל, פראנד, ניס, ואת ליל אינסטיטוט פאולי-Calmettes ב מרסיי) והתירו את התקינה של הכנה דגימת מח עצם ורכישת נתונים. שלושה מסדי נתונים ההבשלה פותחו עבור נויטרופילים, monocytic, ו erythroid שושלות עם מח עצם מאנשים התורם "בריא" (יחידים ללא ראיות של מחלה hematopoietic). שיטה חזקה של ניתוח עבור כל השושלת מיאלואידית צריך להיות ישימים עבור שימוש לאבחון שגרתי. מקרים חדשים יכול להיות מנותח באופן זהה, לעומת נגד מסד הנתונים הרגיל. לפיכך, ניתן לזהות חריגות פנוטיפי כמותיים ואיכותניים, אלה מעל 2SD לעומת הנתונים של דגימות מח עצם נורמלי לשקול מעידה על פתולוגיה. המגבלה העיקרית היא ההשתנות גבוה יותר בין נתוני מושגת באמצעות נוגדנים חד-שבטיים שהושג עם השיטות המבוססים על טכנולוגיות ליפידים ומשמשים כיום אבחון קליני. הגדרת קריטריונים עבור אימות טכני של הנתונים רכשה עשוי לסייע בשיפור השירות של MFC לאבחונים MDS. הקמתה של קריטריונים אלה דורש ניתוח מול מסד נתונים. ההפחתה של החוקר הסובייקטיביות בניתוח נתונים היא יתרון חשוב של שיטה זו.

הדגימות מוניטור 54 האיסוף-K-EDTA קרישה נכללו במחקר. MFC הנתונים נותחו, בהעדר כל מידע על המטופלים. מחקר רטרוספקטיבי הראה כי הדגימות מוניטור היו מתורמים בריאים 7 (5 זכרים ו 2 נקבות עם עידן החציוני של 47.4 [35-48], 11 אנשים עם הוכחות של מחלה hematopoietic (8 זכרים ונקבות 3 עם עידן החציוני של 57.9 [35-72])...

Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

האבחנה MDS קשה בהיעדר קריטריון מורפולוגי או ציטוגנטיקה אינפורמטיבי. MFC יכול לעזור לעדן את תהליך האבחון של MDS. כדי להיות שימושי עבור הקלינית, הניתוח MFC חייבת להתבסס על פרמטרים מספיקה ירידה לפרטים ורגישות, נתונים צריכים להיות לשחזור בין המפעילים השונים.

Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באבחון של מחלות מיאלואידיות כגון תסמונות myelodysplasia או מחלות המטולוגיות אחרות המתפתחות עם חריגות התבגרות בשושלת התאים המיאלואידיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה את הסובייקטיביות של החוקר בניתוח ובפרשנות זו. שיטה זו יכולה לספק תובנה שלתוכם הם הפרמטרים המפלים ביותר עבור myelodysplasia.זה מאפשר לכמת את ההבדלים מאוכלוסיות תאים מיאלואידיות נורמליות. הפגנת ההליך תהיה טיפאני פיקו, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. התחל על ידי ערבוב 600 microliters של מדגם התא הראשי עם 10 מיליליטר של חיץ כביסה בצינור חרוט 15 מיליליטר עבור שני צנטריפוגות ו 10 מיליליטר של חיץ כביסה טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה השנייה, להשעות מחדש את גלולה ב 400 microlitres של חיץ כביסה טרי, ולהעביר 350 microliters של ההשעיה התא לתוך צינור FACS פוליפרופילן חמישה מיליליטר, המכיל את הלוח כולו של נוגדנים עמוד השדרה. לאחר ערבוב יסודי של התאים, פיפטה שווה כמויות של פתרון הנוגדן התא לתוך שלושה צינורות פוליפרופילן חדשים, ולהביא את הנפח הסופי בכל צינור עד 200 microliters עם מאגר כביסה טרי לפי הצורך. לאחר מכן, מוסיפים את הנפח המתאים של נוגדנים נגד סמני פני התא של עניין עם ערבוב, עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, מוסיפים שני מיליליטר של תותב lysing עם ערבוב, עבור דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לאסוף את התאים lysed על ידי צנטריפוגה, ולהשליך את כל מלבד האחרון 50 microliters של על טבעי בכל צינור, מבלי להפריע גלולה. להשעות מחדש את כדורי על-טבעי הנותרים, עם ערבוב עדין, ולהוסיף שני מיליליטר של חיץ כביסה טרי לכל מדגם.לאחר הכביסה השנייה, להשליך את העל טבעי, משאיר כ 50 microliters שאריות נפח בכל צינור, מבלי להפריע גלולה. להשעות מחדש את גלולה ב 200 microliters של PBS עם ערבוב, לניתוח מיידי. כדי לקרוא את הדגימות על ציטומטר זרימה, פתח תחילה ניסוי חדש בתוכנת ציטרומטר הזרימה, ושנה את שם הניסוי לפי השם, סוג המדגם והתאריך.צור דגימה חדשה לשלושה צינורות, וציין את הנוגדנים המשמשים בכל צינור בפריסת הניסוי. פתח את הגדרות הציטרומטר ובחר הגדרות יישום כדי להחיל את הערכים המתקבלים בהגדרה החודשית. פתח גליון עבודה גלובלי חדש וצור את חלקות הנקודות המתאימות לארגון תאי הסינגלים, כמו גם לאוכלוסיות הגרנולוציטים, המונוציטים, הפיצוץ והלימפוציטים.צור גליון עבודה כללי חדש עבור פקדי הפיצוי. לאחר מכן, לרכוש 500, 000 אירועים מכל צינור, בקצב רכישה בינוני, ייצוא הנתונים כמו fcs 3.0 קבצים, לאחר האימות הטכני שלהם. לפני שתתחיל ניתוח חדש, הורד את קבצי הציסטה המכילים את נתוני מח העצם הרגילים, עבור שושלת אדומה נויטרופילית, מונוציטית וגרעין, ואת קבצי הניתוח בפורמט inp.לאחר מכן, שמור את הנתונים בשולחן העבודה. על מנת לשמור את התבגרות נויטרופילים לבסיס הנתונים, תחילה לפתוח את התוכנה Infinicyt ולאחר מכן לפתוח את קובץ ציסטה המתאים נתוני התבגרות נויטרופילים. ציירו את מסלול ההבשלה בגרף ה-APS, והחסכו את מסלול ההבשלה של הנויטרופילים למסד הנתונים.פתח את קובץ fcs עבור התבגרות שושלת נויטרופילים כי יש לנתח. העלה את קובץ inp התבגרות נויטרופילים מהטבליה פרופילים. הניתוח לשושלת זו מחולק לשלושה שלבים.התחל עם מבחר של פיצוצים חיוביים, מחויבים נויטרופילים CD34. לשם כך, השתמש בהצטלבות של שבעה שערים, כדי לאפשר בחירה של CD34 חיובי, CD117 חיובי, HLADR נמוך, CD10 שלילי, CD13 חיובי, CD11 b שלילי אירועים. המשך את הניתוח עם הבחירה של CD117 חיובי, CD34 שלילי נויטרופילים מבשרי.המשך את הניתוח עם הבחירה של תאים נויטרופילים בוגרים יותר. לאחר מכן, הצג את הניתוח של תאי שושלת מונוציטים. צייר את מסלול ההבשלה בגרף ה- APS.ודא כי החץ המציין את תחושת ההתבגרות מכוון מתאים לא בוגרים, מונוציטיים, CD14 שלילי, IREM2 שלילי, למונוציטים בוגרים, חיובי CD14, IREM2 חיובי. שמור את מסלול ההבשלה עבור שושלת מונוצטית למסד הנתונים. פתח את קובץ fcs עבור התבגרות שושלת מונוציטית שיש לנתח.העלה את הפרופיל לניתוח שושלת מונוציטית. כדי לזהות את תאי השושלת המונוציטיים, השתמש בהצטלבות של ארבעה שערים המאפשרת בחירה של CD64 חיובי גבוה, CD117 חיובי, CD117 שלילי, אירועים חיוביים HLADR. הקצה אירועים אלה לכרטיסיה המונוציטית בעץ הירארכיית האוכלוסין.פתח את קובץ הציסטה של NRC שיש לשמור במסד הנתונים של NRC. צייר את מסלול ההבשלה בגרף ה- APS ושמור את מסלול ההבשלה של התאים האדומים הגרעיניים למסד הנתונים. פתח את קובץ fcs שיש לנתח.העלה מהפרופילים את תבנית הניתוח עבור תאים אדומים בעלי גרעין. הניתוח עבור שושלת זו מחולק לשני שלבים. החל עם הבחירה של CD34 חיובי, אריתרויד מחויב תקיעות.כאן, השתמש בהצטלבות של שבעה שערים כדי לאפשר בחירה של CD34 חיובי, CD117 חיובי, HLADR נמוך, CD105 חיובי, CD33 שלילי, CD36 חיובי, CD71 אירועים חיוביים. הקצה אירועים אלה בכרטיסיה NRC בהירארכיית האוכלוסיה. הסר את CD34 אריתרואיד חיובי ביצע תקיעות מן הנראות.כדי לזהות תאים אריתרואידיים בוגרים יותר, השתמש בהצטלבות של ארבעה שערים המאפשרים אפליה של CD45 שלילי ו- CD45 חיובי נמוך, פיזור צדדי נמוך, CD36 חיובי גבוה, ו CD71 חיובי גבוה. לאחר מכן, הסר את ה- CD36 בצד הגבוה פיזור טסיות דם נמוכות מהתאים האדומים הגרעיניים והקצה אוכלוסיה זו ללשונית NRC. כדי להעריך התבגרות מיאלואידית בתא מח העצם, פתח את קובץ הציסטה המתאים לשושלת העניין מהתיק שיש להעריך.שמור רק את האירועים שהוקצו ללשונית של הנויטרופילים בעץ הירארכיית האוכלוסין גלויים. צייר את מסלול ההבשלה בגרף ה- APS וטען את מסד הנתונים המתאים להבשלתו של הנויטרופילים במח עצם רגיל, והשווה נתונים. אם הנתונים תואמים לפחות באופן חלקי, התוכנה תיצור דיאגרמת הבדלי התבגרות מנורמלת ורצועה של פרמטרים כדי להמחיש את הבדלי ההבשלה.כדי להשוות את התבגרות המונוציטים בתא מח העצם, עבור מקרה חדש עם נתונים ממח עצם רגיל, כולל במסד הנתונים מונוציטים, פתח את קובץ הציסטה המתאים לשושלת התאים המונוציטית. השאר רק את האירועים שהוקצו לטאב מונוציטים בעץ הירארכיית האוכלוסיות גלויים וצייר את מסלול ההבשלה בגרף APS. טען את מסד הנתונים המתאים התבגרות מונוציטים במח עצם רגיל, ולהשוות נתונים.כדי להשוות את התבגרות התאים האדומים בגרעין בתא מח העצם, עבור מקרה חדש, עם נתונים ממח העצם הרגיל, הכלולים במסד הנתונים של NRC, פתח את קובץ הציסטה המתאים לשושלת ה- NRC. השאר רק את האירועים שהוקצו בכרטיסיה NRC בעץ הירארכיית האוכלוסין גלויים. ולצייר את מסלול ההבשלה בגרף APS.טען את מסד הנתונים המתאים להבשלת NRC במח עצם רגיל, והשווה נתונים. לאחר מכן, כדי להמחיש את משמעות ההבדלים בין הקובץ החדש לנתונים הכלולים במסד הנתונים, לחץ על הבדלי התבגרות מנורמלים ושינוי גודל תצוגה. זכור ששיטות שמשתמשות באלגוריתמי הסיווג ההיררכי בניתוח נתונים ציטומטריים של זרימה הן סובייקטיביות ביותר ולא מדויקות מטבען, מכיוון שהן אינן נחשבות לחפיפה בין אוכלוסיית התאים.ההערכה של מקרים חדשים של ציטופניה, החשודים כ- MDS נגד מסדי הנתונים של התבגרות נורמלית מיאלואידית, מאפשרת זיהוי של אנטיגנים התבגרות מבוטאים באופן חריג של שושלת נויטרופילים, מונוציטים ו- NRC, גם במקרים ללא חריגות ציטולוגיות או ציטוגניות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לרכוש את הנתונים הציטומטריים של הזרימה, באופן סטנדרטי, כדי לבצע הגדרת ציטומטר חודשית, בדיקות יומיות, כדי pipette בקפדנות את הנוגדן לפני השימוש, ולכבד את זמני הכתמים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כמו מצפן כדי להשוות את קבוצת המקרים השונה, ולהענה על שאלות נוספות, כגון מהי ההטבעה הטיפטית הסופית עבור קבוצה מסוימת של מקרים.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך עבור החוקרים המעוניינים לחקור דפוסי התבגרות תאים מיאלואידיים, במקרים של hematopoiesis שיבוט של פוטנציאל בלתי מוגדר לזהות את השינויים הטיפיים הסופיים הקשורים באופן אמין עבור תהליך דיספלסטי. שים לב כי עדכון מסד הנתונים עם מספר גדל של נתונים מתורמים בריאים עשוי לשפר את החוסן של הניתוח.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

הערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

שילוב Capnography נפח Plethysmography הברומטרי כדי למדוד את מערכת היחסים מבנה-פונקציית ריאות

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

ניתוח ציתום זרימה של תת-סטים של תאים חיסוניים בתוך הטחול מורין, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות Synovial במודל דלקת מפרקים ניוונית

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

בידוד וטיפוח של תאי גזע מסנכימליים במח עצם מנדיבול בחולדות

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...