Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron proporcionados por BD Biosciences. Los autores desean agradecer a su colega, el Dr. Pascale Flandrin-Gresta, desde el Departamento de Biología Molecular, laboratorio de Hematología, Universidad Hospital de Saint-Etienne, Francia, que proporciona conocimientos para la interpretación de datos NGS para la segunda Caso MDS. Los autores están agradecidos por los hematólogos del clínico para su interés y participación en este estudio y para los pacientes y donantes sanos para su acuerdo para participar en este estudio. Los autores quisieran agradecer a la Fundación "Les Amis de Rémi" apoyo financiero para la publicación.

El protocolo a continuación ha sido aprobado por el "Comité de protección des Personnes" (Comité de ética independiente) 1 Sud-Est de la Universidad Hospital de Saint-Etienne, Francia.
1. citometría ajustes
Nota: La configuración de citómetro se realizaron según recomendaciones de flujo de Francia, según procedimiento EuroFlow "EuroFlow operativo protocolo de estándar (SOP) para la configuración del instrumento y compensación (https://www.euroflow.org/usr...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

La calidad de aspirado del BM podría impactar en los resultados finales. La hemodilución de la aspirada del BM podría distorsionar la distribución de células en diferentes etapas de maduración debido a la ausencia de progenitores o precursores. Probablemente emplear un bulto lisis método puede ayudar en la normalización de BM aspira por hemodilución en los análisis de citometría de flujo. Además, los pasos críticos para la evaluación de la displasia mieloide BM por citometría de flujo son la muestra proces...

En la ausencia de marcadores fenotípicos específicos a los que ocurren en las células mieloides durante la MDS iniciación y progresión de los cambios displásticos, ha propuesto un nuevo enfoque en los últimos años basadas en la evaluación de las vías de maduración (expresión alterada de antígenos mieloides durante la producción de células mieloides maduras) o de la distribución anormal de los diferentes tipos de células en la médula (BM) la célula compartimientos1,2.
Este artículo presenta un nuevo método para el uso estandarizado de MFC para detectar cambios displásticos en BM compartimentos de células mieloides relacionadas con síndromes mielodisplásicos (MDS) u otras enfermedades hematológicas mieloides. Este estudio también demuestra la utilidad del uso de bases de datos de maduración para el análisis de datos MFC.
Estandarización del procedimiento de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis con las bases de datos permitiría la identificación de las anormalidades fenotípicas más relevantes relacionados con los cambios displásicos en células mieloides BM. Por lo tanto, son necesarios para el desarrollo de una estrategia de análisis que se puede utilizar en análisis posteriores subconjuntos estadísticamente seleccionados basados en formatos bien marcados y reconocidos (separador de población automático (APS) diagramas, histogramas y diagramas de punto) rondas. El descubrimiento de anormalidades fenotípicas robustos en MDS facilitaría el diagnóstico en casos con o sin displasia morfológica mínima y sin aberrancies citogenéticas. Identificación de parámetros discriminatorios lo que permite la reducción de paneles de immunophenotypic puede simplificar el actual puntuaciones2, permitiendo su aplicación en laboratorios de patología clínica.
Este método limita las interpretaciones subjetivas de datos de citometría, como se ha senalado en MDS diagnóstico3. Este paso es un requisito previo para el desarrollo de herramientas automáticas para el procesamiento y análisis de flujo de datos4.
MDS comprende un grupo heterogéneo de trastornos clonales de células madre hematopoyéticas (HSC) en el que las mutaciones del espliceosoma cooperan con modificadores epigenéticos específicos para producir el fenotipo MDS. Ahora se sabe que, junto con las mutaciones de la HSC, otros mecanismos están implicados en la fisiopatología MDS, como inflamación mediada inmune aberrante e interacciones entre HSCs malignas y el microambiente estromal del BM. Sin embargo, estos mecanismos siguen siendo mal entendidos. La heterogeneidad amplia clínica y biológica de los MDS hace el diagnóstico y la selección de la terapia óptima un desafío. En la última década, varios estudios han demostrado que MFC es a menudo más sensible en la detección de displasia2 de morfología, pero las limitaciones técnicas y económicas dificultan esta técnica estandarizar, con resultados a menudo depende de la experiencia del intérprete3. Además, no está claro cómo MFC puede inclinar la balanza hacia MDS en casos con o sin displasia morfológica mínima y en ausencia de anomalías citogenéticas o en casos extremos como hypocellular MDS, con una cuenta baja blast, de otros no clonal BM trastornos como la insuficiencia de la médula ósea (ej., anemia aplásica). También sigue siendo difícil de distinguir casos dudosos de MDS con un exceso de blastos de la leucemia mieloide aguda (AML). Por todas estas razones, las directrices clínicas integran no MFC de prueba en el diagnóstico final de MDS. En 2011, red nacional de cáncer integral de Estados Unidos (NCCN) recomendó MFC para la estimación del porcentaje de células CD34 +, detección de clones de la hemoglobinuria paroxística nocturna y la presencia de clones de células T citotóxicas en hypocellular MDS5. Estas dos últimas situaciones implican también un objetivo terapéutico porque los datos clínicos han demostrado una buena respuesta de estos pacientes a la terapia inmunosupresiva6. Las guías NCCN de 2017, citando las recomendaciones del grupo de trabajo internacional (GTI), la lista aberrante immunophenotyping detección MFC entre los co criterios para el diagnóstico de la MDS, pero sin realizar ninguna Especificaciones6. Además, la recientemente publicada clasificación de la OMS estipula que resultados MFC solamente no son suficientes para establecer un diagnóstico primario de MDS en ausencia de datos concluyentes de la morfológica y citogenética7. Sin embargo, MFC puede utilizarse como una prueba adicional que el dysregulation de células mieloides patrones de maduración y cuantificar la "distancia de normal" para un paciente en un momento específico en el curso de la enfermedad.
Este método es aplicable a los laboratorios clínicos interesados en la evaluación de la displasia de las células mieloides BM usando MFC immunophenotyping, para afinar el diagnóstico en MDS u otros desordenes mieloides con anormalidades displásticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

Un grupo de trabajo iniciado dentro de la asociación francesa de citometría (AFC) fue desarrollado con el fin de armonizar la aplicación de la citometría de flujo multiparamétrico (MFC) para el diagnóstico de enfermedad mieloide en Francia. El protocolo presentado aquí fue acordada y aplicada entre septiembre de 2013 y noviembre de 2015 en seis laboratorios de diagnóstico francés (hospitales universitarios de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Niza y Lille e Instituto Paoli-Calmettes en Marsella) y permite la estandarización de la médula ósea muestra preparación y adquisición de datos. Tres bases de datos de maduración fueron desarrollados para neutrófilos, monocítica y linajes eritroides con la médula ósea de individuos "sanos" donantes (personas sin ninguna evidencia de una enfermedad hematopoyética). Un método robusto de análisis para cada linaje mieloide debe ser aplicable para el uso rutinario de diagnóstico. Nuevos casos pueden ser analizados de la misma manera y con respecto a las bases de datos generalmente. Por lo tanto, cuantitativas y cualitativas las anormalidades fenotípicas pueden ser identificadas y aquellos por encima de 2SD en comparación con los datos de las muestras de médula ósea normal puede considerarse indicativas de patología. La principal limitación es la mayor variabilidad entre los datos que se consigue utilizando los anticuerpos monoclonales obtenidos con los métodos basados en hibridomas tecnologías y actualmente se utiliza en diagnóstico clínico. Establecimiento de criterios para la validación técnica de los datos adquiridos puede ayudar a mejorar la utilidad de MFC para el diagnóstico MDS. El establecimiento de estos criterios requiere un análisis contra una base de datos. La reducción de la subjetividad del investigador en análisis de datos es una ventaja importante de este método.

Las 54 muestras de BM en anticoagulante EDTA K se incluyeron en el estudio. Se analizaron los datos MFC en la ausencia de cualquier información sobre los pacientes. Estudio retrospectivo demostró que las muestras del BM eran de 7 donantes sanos (5 machos y 2 hembras con una edad media de 47.4 [35-48], 11 personas sin evidencia de una enfermedad hematopoyética (8 varones y 3 hembras con una edad promedio de 57.9 [35-72]) y 36 casos con varias condiciones patológicas: 1 caso con anemia...

Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.

Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el diagnóstico de enfermedades mieloides como síndromes de mielodisplasia u otras enfermedades hematológicas que evolucionan con anomalías de maduración en linajes celulares mieloides. La principal ventaja de esta técnica es que reduce la subjetividad del investigador en ese análisis e interpretación. Este método puede proporcionar información sobre cuáles son los parámetros más discriminatorios para la mielodisplasia.Permite cuantificar las diferencias con respecto a las poblaciones normales de células mieloides. Demostrando el procedimiento estará Tiphanie Picot, un becario postdoctoral de nuestro laboratorio. Comience mezclando 600 microlitros de la muestra de célula primaria con 10 mililitros de tampón de lavado en un tubo cónico de 15 mililitros para dos centrifugaciones y 10 mililitros de tampón de lavado fresco por lavado.Después del segundo lavado, vuelva a suspender el pellet en 400 microlitros de tampón de lavado fresco, y transfiera 350 microlitros de la suspensión celular a un tubo FACS de polipropileno de cinco mililitros, que contiene todo el panel de anticuerpos de la columna vertebral. Después de mezclar a fondo las células, pipetear volúmenes iguales de la solución de anticuerpos celulares en tres nuevos tubos de polipropileno, y llevar el volumen final en cada tubo hasta 200 microlitros con tampón de lavado fresco según sea necesario. A continuación, añada el volumen adecuado de anticuerpos contra los marcadores de la superficie celular de interés con la mezcla, para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.Al final de la incubación, añadir dos mililitros de solución de lisamiento con mezcla, para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Recoger las células de lesed por centrifugación, y desechar todos los últimos 50 microlitros de sobrenadante en cada tubo, sin perturbar el pellet. Vuelva a suspender los pellets en el sobrenadante restante, con una mezcla suave, y agregue dos mililitros de tampón de lavado fresco a cada muestra.Después del segundo lavado, deseche el sobrenadante, dejando aproximadamente 50 microlitros de volumen residual en cada tubo, sin alterar el pellet. Re-suspender el pellet en 200 microlitros de PBS con mezcla, para su análisis inmediato. Para leer las muestras en un citómetro de flujo, abra primero un nuevo experimento en el software del citometro de flujo y cambie el nombre del experimento según el nombre, el tipo de muestra y la fecha.Cree una nueva muestra para tres tubos y especifique los anticuerpos utilizados en cada tubo en el diseño del experimento. Abra la configuración del citometro y seleccione la configuración de la aplicación para aplicar los valores obtenidos en la configuración mensual. Abra una nueva hoja de trabajo global y cree las gráficas de puntos adecuadas para trazar las células singletes, así como para las poblaciones de granulocitos, monocitos, explosiones y linfocitos.Cree una nueva hoja de cálculo global para los controles de compensación. A continuación, adquiera 500.000 eventos de cada tubo, a una tasa de adquisición media, exportando los datos como archivos fcs 3.0, después de su validación técnica. Antes de iniciar un nuevo análisis, descargue los archivos cyt que contienen los datos normales de la médula ósea, para los linajes rojos neutrófilos, monocíticos y nucleados, y los archivos de análisis en formato inp.A continuación, guarde los datos en el escritorio. Para guardar la maduración de los neutrófilos en la base de datos, abra primero el software Infinicyt y luego abra el archivo cyt correspondiente a los datos de maduración de neutrófilos. Dibuje la vía de maduración en el gráfico APS y guarde la vía de maduración del neutrófilo en la base de datos.Abra el archivo fcs para la maduración del linaje de neutrófilos que debe analizarse. Cargue el archivo inp de maduración de neutrófilos desde la pestaña Perfiles. El análisis de este linaje se divide en tres pasos.Comience con la selección de explosiones CD34 positivas y comprometidas con neutrófilos. Para ello, utilice una intersección de siete puertas, para permitir la selección de los eventos CD34 positivos, CD117 positivos, HLADR bajo, CD10 negativos, CD13 positivos, CD11 b negativos. Continúe el análisis con la selección de los precursores de neutrófilos negativos CD117 positivos CD117.Continúe el análisis con la selección de células neutrófilas más maduras. A continuación, muestre el análisis de las células de linaje monocítico. Dibuje la vía de maduración en el gráfico APS.Verifique que la flecha que indica la sensación de maduración está orientada desde células inmaduras, moncíticas, CD14 negativas, IREM2 negativas, a los monocitos maduros, CD14 positivo, IREM2 positivo. Guarde la vía de maduración para el linaje monocítico en la base de datos. Abra el archivo fcs para la maduración de linaje monocítico que debe analizarse.Cargue el perfil para el análisis de linaje monocítico. Para identificar las celdas de linaje monocítico, utilice una intersección de cuatro puertas que permita la selección de CD64 positivo alto, CD117 positivo, CD117 negativo, eventos positivos HLADR. Asigne estos eventos a la pestaña monótica del árbol de jerarquía de población.Abra el archivo cyt NRC que debe guardarse en la base de datos NRC. Dibuje la vía de maduración en el gráfico APS y guarde la vía de maduración de los glóbulos rojos nucleados a la base de datos. Abra el archivo fcs que debe analizarse.Cargar desde los perfiles la plantilla de análisis para los glóbulos rojos nucleados. El análisis de este linaje se divide en dos pasos. Comenzando con la selección de las explosiones positivas de CD34, eritroide.Aquí, utilice una intersección de siete puertas para permitir la selección de los eventos CD34 positivos, CD117 positivos, HLADR low, CD105 positivo, CD33 negativo, CD36 positivo, CD71 positivos. Asigne estos eventos a la pestaña NRC de la jerarquía de población. Retire la visibilidad de las explosiones comprometidas de eritroide positivo CD34.Para identificar células eritroideas más maduras, utilice una intersección de cuatro puertas que permitan la discriminación de CD45 negativo y CD45 positivo bajo, bajo de dispersión lateral, CD36 positivo alto y CD71 positivo alto. Luego, retire las plaquetas bajas de dispersión de lado alto CD36 de los glóbulos rojos nucleados, y asigne esta población a la pestaña NRC. Para evaluar la maduración mieloide en el compartimento de la médula ósea, abra el archivo cyt correspondiente al linaje de interés del caso que debe evaluarse.Mantenga visibles solo los eventos asignados a la pestaña del neutrófilo en el árbol de jerarquía de población. Dibuje la vía de maduración en el gráfico APS y cargue la base de datos correspondiente a la maduración del neutrófilo en la médula ósea normal y compare los datos. Si los datos son al menos parcialmente compatibles, el software creará un diagrama normalizado de diferencias de maduración, y una banda de parámetros, para visualizar las diferencias de maduración.Para comparar la maduración de los monocitos en el compartimento de la médula ósea, para un nuevo caso con datos de médulas óseas normales, incluso en la base de datos de monocitos, abra el archivo cyt correspondiente al linaje celular monocítico. Mantenga visibles solo los eventos asignados a la pestaña monocitos en el árbol de jerarquía de poblaciones y dibuje la ruta de maduración en el gráfico APS. Cargue la base de datos correspondiente a la maduración de los monocitos en las médulas óseas normales y compare los datos.Para comparar la maduración de los glóbulos rojos nucleados en el compartimento de la médula ósea, para un nuevo caso, con los datos de las médulas óseas normales, incluidos en la base de datos NRC, abra el archivo cyt correspondiente al linaje del NRC. Mantenga visibles solo los eventos asignados a la ficha NRC en el árbol de jerarquía de población. Y dibuje la vía de maduración en el gráfico APS.Cargue la base de datos correspondiente a la maduración NRC en las médulas óseas normales y compare los datos. A continuación, para visualizar la importancia de las diferencias entre el nuevo archivo y los datos incluidos en la base de datos, haga clic en diferencias de maduración normalizadas y haga zoom. Recuerde que los métodos que utilizan los algoritmos de clasificación jerárquica en el análisis de datos citométricos de flujo son altamente subjetivos e inherentemente inexactos, porque no cuentan para la superposición de la población de celdas.La evaluación de nuevos casos de citopenia, sospechoso de ser MDS contra las bases de datos de maduración normal mieloide, permite la identificación de antígenos de maduración anormalmente expresados de linajes de neutrófilos, monocitos y NRC, incluso en casos sin anomalías citológicas o citogénicas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar adquirir los datos citométricos de flujo, de manera estandarizada, para realizar la configuración mensual del citometro, controles diarios, pipetear rigurosamente el anticuerpo antes de su uso y respetar los tiempos de tinción. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la brújula para comparar el grupo de casos diferentes y para responder a preguntas adicionales, como cuál es la huella typic final para un grupo determinado de casos.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores interesados en explorar patrones de maduración de células mieloides, en casos de hematopoyesis clonal de potencial indeterminado para identificar los cambios tipicos finales relacionados confiablemente relacionados con el proceso displásico. Tenga en cuenta que la actualización de la base de datos con un mayor número de datos de donantes sanos puede mejorar la solidez del análisis.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Preparación de células mieloides supresoras derivadas (MDSC) de ingenuo y de páncreas ratones portadores del tumor mediante citometría de flujo magnético y automatizado de células activadas clasificación (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Investigación

Medicina

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Alto rendimiento secuencial ELISA para la Validación de Biomarcadores de aguda injerto contra huésped

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Combina la capnografía volumétrica y la pletismografía barométrica para medir la relación estructura-función de pulmón

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Aislamiento Y Cultivo De Células Madre Mesenquimales De Médula Ósea Mandibular En Ratas

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...