Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

De antikroppar som används i denna studie gavs av BD Biosciences. Författarna vill tacka sin kollega, Dr Pascale Flandrin-Gresta, från Institutionen för molekylärbiologi, hematologi laboratorium, University Hospital i Saint-Etienne, Frankrike, som lämnat kompetens för tolkning av NGS data för andra MDS-fall. Författarna är tacksamma för de klinikern hematologer för deras intresse och engagemang i denna studie och för patienter och friska donatorer för deras avtal att delta i denna studie. Författarna vill även tacka stiftelsen ”Les Amis de Rémi” finansiellt stöd för publikation.

Protokollet som anges nedan har godkänts av den ”Comité de Protection des Personnes” (oberoende etisk kommitté) Sud-Est 1 från universitet sjukhus av Saint-Etienne, Frankrike.
1. Cytometer inställningar
Obs: Cytometer inställningarna utfördes enligt Frankrike Flow rekommendationer, i enlighet med EuroFlow förfarande ”EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) för instrumentet Setup och ersättning (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
<o...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

Kvaliteten på BM aspirera skulle kunna inverka på de slutliga resultaten. Hemodilution av den BM aspirera snedvrida fördelning av celler i olika stadier av mognad på grund av avsaknad av föräldraparets eller prekursorer celler. Förmodligen anställa en bulk lyseringslösning metod kan hjälpa normalisering av BM enkelarmade för hemodilution i flödescytometrisk flödesanalyser. Dessutom är de kritiska steg för utvärdering av BM myeloisk dysplasi av flödescytometri prov beredning och färgning, datainsamling o...

I avsaknad av fenotypiska markörer specifika att de dysplastiska förändringar som sker i myeloida celler under MDS initiering och progression, har en ny strategi föreslagits under de senaste åren baserat på utvärderingen av den mognad vägar (förändrat uttryck av myeloisk antigener under produktionen av mogen myeloida celler) eller onormala fördelningen av olika celltyper i benmärgen (BM) cell fack1,2.
Denna artikel presenterar en ny metod för standardiserade tillämpningen av MFC för att upptäcka dysplastiska förändringar i BM myeloida cell fack relaterade till myelodysplastiska syndrom (MDS) eller annan myeloisk blodsjukdomar. Denna studie visar också verktyget att använda mognad databaser för MFC dataanalys.
Standardisering av provet arbetsgången, datainsamling och analys med hjälp av databaserna skulle möjliggöra identifiering av den mest relevanta fenotypiska avvikelser relaterade till dysplastiska förändringar i BM myeloida celler. Därför krävs statistiskt utvalda undergrupper baserat på väl märkta och välkänt format (automatisk befolkningen Separator (APS) diagram, histogram och dot tomter) för att utveckla en analys strategi som kan användas i efterföljande analys rundor. Upptäckten av robust fenotypiska avvikelser i MDS skulle underlätta diagnosen i fall med eller utan minimal morfologiska dysplasi och utan cytogenetiska aberrancies. Identifiering av diskriminerande parametrar möjliggör en minskning av immunophenotypic paneler kan förenkla den nuvarande noter2, tillåter deras tillämplighet i klinisk patologi laboratorier.
Den här metoden begränsar de subjektiva tolkningarna av flödescytometri data, som har varit signalerade i MDS diagnos3. Detta steg är en förutsättning för utveckling av automatiserade verktyg för bearbetning och analys av flöde data4.
MDS omfattar en heterogen grupp av klonala hematopoetiska stamceller (HSC) sjukdomar där de spliceosome mutationerna samarbeta med specifika epigenetiska modifierare att ge MDS fenotypen. Det är nu känt att, tillsammans med HSC mutationer, andra mekanismer är inblandade i MDS patofysiologi, som avvikande immunmedierad inflammation och interaktioner mellan maligna Förenta och den stromal mikromiljö av BM. Dessa mekanismer är dock fortfarande dåligt förstådd. MDS breda kliniska och biologiska heterogenitet gör diagnos och val av den optimala terapin en utmaning. Under det senaste decenniet har flera studier visat att MFC är ofta mer känsliga att upptäcka dysplasi2 än morfologi, men tekniska och ekonomiska begränsningar gör denna teknik svårt att standardisera, med resultat ofta beroende på den erfarenhet av tolk3. Dessutom är det oklart hur MFC kan rubba balansen mot MDS i fall med eller utan minimal morfologiska dysplasi och i avsaknad av cytogenetiska avvikelser eller i gränsfall såsom hypocellular MDS, med en låg blast räkna, från andra icke-klonal BM störningar såsom benmärgssvikt (dvs., aplastisk anemi). Det är också fortfarande svårt att skilja gränsfall av MDS med ett överskott av Blaster från akut myeloisk leukemi (AML). Av alla dessa skäl integrerar de kliniska riktlinjerna inte MFC testning i den slutliga diagnosen MDS. I 2011 rekommenderade den amerikanska nationella omfattande Cancer Network (NCCN) MFC för uppskattning av andelen CD34 + celler, upptäckt av paroxysmal nattlig hemoglobinuri kloner, och förekomsten av cytotoxiska T-celler kloner i hypocellular MDS5. Dessa två sistnämnda situationer också innebära ett terapeutiskt mål eftersom kliniska data har visat ett bra svar av dessa patienter på immunsuppressiv behandling6. 2017 NCCN riktlinjerna, med hänvisning till internationella arbetar gruppen (IWG) rekommendationer, listade avvikande immunophenotyping upptäckt av MFC bland Co kriterierna för MDS diagnos, men utan att göra någon specifikationer6. Den nyligen publicerade WHO-klassifikationen stadgar dessutom att MFC resultaten enbart inte är tillräckligt för att fastställa en primärdiagnos på MDS i avsaknad av avgörande morfologiska och/eller cytogenetiska uppgifter7. MFC kan dock användas som en ytterligare test visar dysreglering av myeloida cell mognad mönster och kvantifiera ”avståndet från normala” för en patient vid en viss tidpunkt i sjukdomsförloppet.
Denna metod är tillämplig på kliniska laboratorier intresserade av utvärderingen av dysplasi i BM myeloida celler med MFC immunophenotyping, för att förfina diagnosen MDS eller andra myeloiska sjukdomar med dysplastiska avvikelser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

En arbetsgrupp som initierats inom franska flödescytometri Association (AFC) utvecklades för att harmonisera tillämpningen av multiparametrar flödescytometri (MFC) för myeloisk sjukdomsdiagnos i Frankrike. Det protokoll som presenteras här var överenskomna och tillämpad mellan September 2013 och November 2015 i sex franska diagnostiska laboratorier (universitetssjukhusen i Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, och Lille och Institut Paoli-Calmettes i Marseille) och tillät en standardisering av benmärgen prov förberedelse och datainskaffning. Tre mognad databaser har utvecklats för neutrofiler, monocytic, och erytroid härstamningar med benmärg från ”friska” givare individer (individer utan bevis på en hematopoetisk sjukdom). En robust metod för analys av varje myeloisk härstamning bör tillämpas för rutinmässig diagnostisk användning. Nya fall kan analyseras på samma sätt och jämfört mot de vanliga databaserna. Således, kvantitativa och kvalitativa fenotypiska avvikelser kan identifieras och dessa ovanstående 2SD jämföras med data av normal benmärg prover övervägas vägledande av patologi. Den största begränsningen är det högre variabilitet mellan data som uppnås med de monoklonala antikroppar erhållits med de metoder utifrån Hybridomteknik tekniker och för närvarande används i klinisk diagnos. Ställer upp kriterier för teknisk validering av de uppgifter som erhållits kan bidra till att förbättra användbarheten av MFC för MDS diagnostik. Fastställandet av dessa kriterier kräver analys mot en databas. Minskningen av prövaren subjektivitet i analys av data är en viktig fördel med denna metod.

De 54 BM prover som skördats i K-EDTA antikoagulans inkluderades i studien. MFC data analyserades i avsaknad av någon information om patienterna. Retrospektiv studie visade att BM proverna var från 7 friska donatorer (5 hanar och 2 honor med en medianålder av 47,4 [35-48], 11 individer utan tecken på en hematopoetisk sjukdom (8 hanar och 3 honor med en medianålder av 57,9 [35-72]) och 36 fall med olika sjukdomstillstånd: 1 fall med anemi och lågt kreatinin nivå, 3 fall med anemi...

Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

MDS diagnosen är svår i avsaknad av morfologiska kriterier eller icke-informativa cytogenetik. MFC kunde bidra till att förfina den diagnostiska processen för MDS. För att bli användbart för klinisk praxis, MFC analysen måste baseras på parametrar med tillräcklig specificitet och känslighet, och data bör vara reproducerbar mellan olika operatörer.

Databas-guidad-flödescytometri för utvärdering av benmärgen myeloida Cell mognad

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Denna metod kan bidra till att besvara viktiga frågor i diagnos av myeloida sjukdomar såsom myelodysplasia syndrom eller andra blodsjukdomar sjukdomar som utvecklas med mognad avvikelser i myeloisk cell härstamningar. Den största fördelen med denna teknik är att det minskar subjektiviteten hos utredaren i den analysen och tolkningen. Denna metod kan ge insikt i vilka som är de mest diskriminerande parametrarna för myelodysplasia.Det möjliggör kvantifiering av skillnaderna från normala myeloida cellpopulationer. Demonstrera förfarandet kommer att Tiphanie Picot, en post-doktor från vårt laboratorium. Börja med att blanda 600 mikroliter av primärcellprovet med 10 milliliter tvättbuffert i ett koniskt rör på 15 milliliter för två centrifugeringar och 10 milliliter färsk tvättbuffert per tvätt.Efter den andra tvätten, åter upphäva pelleten i 400 mikroliter av färsk tvätt buffert, och överföra 350 mikroliter av cellen suspensionen till en fem milliliter polypropylen FACS rör, som innehåller hela panelen av stamnätet antikroppar. Efter att noggrant blanda cellerna, pipetter lika volymer av cellen antikroppslösning i tre nya polypropylen rör, och föra den slutliga volymen i varje rör upp till 200 mikroliter med färsk tvättbuffert som behövs. Därefter lägger du till lämplig volym av antikroppar mot cellytan markörer av intresse med blandning, för en 30-minuters inkubation vid rumstemperatur, skyddad från ljus.Tillsätt i slutet av inkubationen två milliliter lyserlösning med blandning, för en 10-minuters inkubation vid rumstemperatur, skyddad från ljus. Samla de lystna cellerna genom centrifugering, och kassera alla utom de 50 sista mikroliter av supernatant i varje rör, utan att störa pelleten. Åter upphäva pellets i de återstående supernatant, med mild blandning, och tillsätt två milliliter färsk tvätt buffert till varje prov.Efter den andra tvätten, kassera supernatanten, och lämna cirka 50 mikroliters restvolym i varje rör, utan att störa pelleten. Åter avbryta pelleten i 200 mikroliter av PBS med blandning, för omedelbar analys. För att läsa proverna på en flödescytometer öppnar du först ett nytt experiment i programvaran för flödescytmetern och byter namn på experimentet efter namn, typ av prov och datum.Skapa ett nytt exemplar för tre rör, och ange de antikroppar som används i varje rör i experimentlayouten. Öppna inställningarna för cytometer, och välj programinställningar, för att tillämpa de värden som erhålls i den månatliga inställningen. Öppna ett nytt globalt kalkylblad och skapa lämpliga punkttomter för gating singlet-cellerna, samt för granulocyt-, monococyt-, blast- och lymfocytpopulationerna.Skapa ett nytt globalt kalkylblad för kompensationskontrollerna. Sedan, förvärva 500, 000 händelser från varje rör, på en medelhög förvärvshastighet, exportera data som FCS 3.0 filer, efter deras tekniska validering. Innan du påbörjar en ny analys, ladda ner cyt-filerna som innehåller de normala benmärgsdata, för neutrofil, monocytic, och nucleated röda linjer, och analysfilerna i INP-format.Spara sedan data på skrivbordet. För att spara neutrofila mognaden till databasen, först öppna Infinicyt programvara och sedan öppna cyt filen motsvarar neutrofil mognadsdata. Rita mognadsvägen på APS-grafen och spara neutrofisens mognadsväg till databasen.Öppna fcs-filen för neutrofila härstamning mognad som måste analyseras. Ladda upp neutrofilmognads-inp-filen från fliken profiler. Analysen för denna härstamning är uppdelad i tre steg.Börja med urval av CD34 positiva, neutrofil-engagerade blaster. För detta syfte, använd en skärningspunkt mellan sju grindar, för att tillåta val av cd34 positiva, CD117 positiva, HLADR låg, CD10 negativ, CD13 positiva, CD11 b-negativa händelser. Fortsätt analysen med valet av CD117 positiva, CD34 negativa neutrofil prekursorer.Fortsätt analysen med val av mer mogna neutrofilceller. Därefter visar analysen av monocytiska härstamning celler. Rita mognadsvägen på APS-grafen.Kontrollera att pilen som anger mognadskänslan är orienterad från omogna, monocytiska celler, CD14 negativ, IREM2 negativ, till de mogna monocyterna, CD14 positiva, IREM2 positiv. Spara mognadsvägen för monocytisk härstamning till databasen. Öppna fcs-filen för monocytisk härstamningsmognad som måste analyseras.Ladda upp profilen för monocytisk härstamningsanalys. För att identifiera de monocytiska härstamning celler, använd en skärningspunkt av fyra grindar som möjliggör val av CD64 positiv hög, CD117 positiva, CD117 negativa, HLADR positiva händelser. Tilldela den monocytiska fliken i populationshierarkiträdet dessa händelser.Öppna den NRC-cytfil som måste sparas i NRC-databasen. Rita mognadsvägen på APS-grafen och spara de nucleated röda cellerna mognadsvägen till databasen. Öppna filen FCS som måste analyseras.Ladda upp från profilerna mallen för analys för nucleated röda blodkroppar. Analysen för denna härstamning är uppdelad i två steg. Från och med valet av CD34 positiva, erythroid begått blaster.Här, använd en skärningspunkt mellan sju grindar för att tillåta val av cd34 positiva, CD117 positiva, HLADR låg, CD105 positiv, CD33 negativ, CD36 positiva, CD71 positiva händelser. Tilldela de här händelserna till fliken NRC i befolkningshierarkin. Ta bort CD34 positiva erythroid begåtts blaster från synlighet.För att identifiera mer mogna erytroida celler, använd en skärningspunkt mellan fyra grindar som tillåter diskriminering av CD45 negativ och CD45 positiva låg, side-scatter låg, CD36 positiv hög, och CD71 positiv hög. Sedan, ta bort CD36 hög sida scatter låga trombocyter från de kärnade röda cellerna, och tilldela denna population till NRC fliken. För att bedöma myeloisk mognad i benmärgen fack, öppna cyt filen motsvarar härstamning av intresse från det fall som måste utvärderas.Håll endast de händelser som tilldelats neutrofisens flik i populationshierarkiträdet synliga. Rita mognadsvägen på APS-grafen och ladda databasen som motsvarar neutrofila mognaden i normal benmärg, och jämför data. Om data är åtminstone delvis kompatibla, kommer programvaran att skapa en normaliserad mognadsskillnader diagram, och en parameter band, för att visualisera mognadsskillnaderna.För att jämföra monocyterna mognad i benmärgfacket, för ett nytt fall med data från normala benmärg, inklusive i monocyternas databas, öppna cyt-filen som motsvarar den monocytiska cellen härstamning. Håll endast de händelser som tilldelas fliken monocyter i populationshierarkiträdet synliga och rita mognadsvägen på APS-grafen. Ladda databasen som motsvarar monocyterna mognad i normala benmärar, och jämför data.För att jämföra de nucleated röda cellerna mognad i benmärgen facket, för ett nytt fall, med data från de normala benmärgarna, som ingår i NRC databasen, öppna cyt filen motsvarar NRC: s härstamning. Håll endast de händelser som tilldelats fliken NRC i populationshierarkiträdet synliga. Och rita mognadsvägen på APS-grafen.Ladda databasen som motsvarar NRC-mognaden i normala benmärg, och jämför data. Sedan, för att visualisera betydelsen av skillnaderna mellan den nya filen och de data som ingår i databasen, klicka på normaliserade mognadsskillnader och zoom. Kom ihåg att metoder som använder de hierarkiska klassificeringsalgoritmerna i flödescytometrisk dataanalys är mycket subjektiva och till sin natur felaktiga, eftersom de inte räknas för cellpopulationens överlappning.Utvärderingen av nya fall av cytopeni, misstänks vara MDS mot myeloisk normal mognad databaser, möjliggöra identifiering av onormalt uttryckta mognadsanföringsantigener av neutrofil, monocyt och NRC härstamningar, även i de fall utan cytologiska eller cytogenic avvikelser. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att förvärva flödet cytometric data, på ett standardiserat sätt, att utföra månatliga cytometer inställning setup, dagliga kontroller, att pipettera rigoröst antikroppen före användning, och att respektera färgning gånger. Efter denna procedur, kan en annan metoder som kompass, utföras för att jämföra de olika gruppen av fall, och att besvara ytterligare frågor, till exempel vad som är den slutliga typiska avtryck för en viss grupp av fall.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för de forskare som är intresserade av att utforska myeloida cellmognadsmönster, i fall av klonala hematopoies av obestämd potential att identifiera de slutliga typiska förändringarna som är tillförlitligt relaterade för dysplastisk process. Observera att en uppdatering av databasen med ökat antal data från friska givare kan förbättra analysens robusthet.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Framställning av myeloida Derived suppressorceller (MDSC) från naiva och pankreatisk tumör-bärande möss med användning av flödescytometri och automatiserat Magnetisk cellsortering (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Hög genomströmning Sekventiell ELISA för validering av biomarkörer för akut graft-versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Preklinisk utvärdering av tyrosinkinashämmare för behandling av akut leukemi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Anpassning av halvautomatiserad cirkulerande tumör Cell (CTC) Analyser för klinisk och preklinisk forskning Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Lårbens Benmärg aspiration Live Möss

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- och flödescytometri-baserad analys av cell Position och cellcykeln i 3D Melanom Sfäroider

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Kombinera volymetrisk Capnography och barometrisk pletysmografi för att mäta förhållandet Lung struktur och funktion

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Flödescytometrianalys av immuncellsdelmängder inom Murine Mjälte, Benmärg, Lymfkörtlar och synovial vävnad i en artrosmodell

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolering och odling av mandibulära benmärgsmjukelsemjukelsestamceller hos råttor

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...