Name: database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Bu çalışmada kullanılan antikor BD Biosciences tarafından temin edilmiştir. Yazarlar kendi meslektaşı Dr Pascale Flandrin-Gresta, düşük moleküler biyoloji bölümü, Hematoloji Laboratuvarı, Üniversitesi Hastanesi Saint-Etienne, ikinci NGS verilerin yorumlanması için uzmanlık sağlayan Fransa, teşekkür etmek istiyorum MDS durumda. Yazarlar için klinisyen hematolog ve hastalar ve sağlıklı bağış bu çalışmaya katılmak onların anlaşma için ilgi ve bu çalışma katılımı için müteşekkiriz. Yazarlar ayrıca "Les Amis de Rémi" Vakfı yayını için finansal destek için teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıda listelenen iletişim kuralı "Comité de koruma des Personnes tarafından" (bağımsız Etik Komitesi) onaylı Sud Est 1 Üniversite Hastanesi Saint-Etienne, Fransa'dan.
1. sitometresi ayarları
Not: Uygun olarak EuroFlow yordam "EuroFlow standart işletim Protokolü (SOP) araç kurulum ve tazminat (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php). Fransa akışı öneriler göre sitometresi ayarları yapıldı
<ol><li>Aylık araç kurulum</stron...

<ol>
	<li>Orfao, A., Ortu&#241;o, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes.">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li><li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+guidelines+for+integration+of+flow+cytometry+results+in+the+WHO+classification+of+Myelodysplastic+Syndromes+-+proposal+from+the+International/European+LeukemiaNet+Working+Group+for+Flow+Cytometry+in+MDS+(IMDSFlow).">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li><li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach:+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS.">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li><li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AutoGate:+automating+analysis+of+flow+cytometry+data.">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology:+myelodysplastic+syndromes.">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li><li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+Syndromes,+Version+2.2017,+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology.">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).</li><li>. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li><li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal,+reactive+and+malignant+leukocytes.">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li><li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry.">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li><li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group).">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response.">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li></ol>

BM aspiratı kalitesini final sonuçlarına etkisi olabilir. BM aspiratı hemodilution hücrelerin CSF'den olgunlaşma olmaması nedeniyle, farklı evrelerinde veya öncül hücrelerin dağıtım deforme. Muhtemelen bir toplu yöntemi lysing istihdam hemodilution akış sitometrik analizlerde için BM boğulmadan normalleştirme yardımcı olabilir. Ayrıca, BM miyeloid displazi değerlendirilmesi için kritik adımlar akış sitometresi tarafından işleme ve boyama örnek, veri toplama ve yorumu2</sup...

Fenotipik işaretleri myeloid hücrelerin MDS başlama ve ilerleme sırasında meydana gelen displastik değişiklikler için belirli yokluğunda, olgunlaşma yolları (değiştirilmiş ifade değerlendirmesine dayanarak son yıllarda yeni bir yaklaşım önerilmiştir myeloid antijenleri olgun myeloid hücrelerin üretimi sırasında) veya kemik iliği (BM) içinde farklı hücre türleri anormal dağılımı bölmeleri1,2hücre.
Bu makale myelodisplastik sendrom (MDS) veya diğer myeloid hematolojik hastalıklar ile ilgili BM myeloid hücre bölmeleri displastik değişiklikleri algılamak için MFC standart uygulanması için yeni bir yöntem sunar. Bu çalışma aynı zamanda MFC veri analizi için olgunlaşma veritabanları kullanmanın yardımcı programını gösterir.
Örnek hazırlama yordamı, veri toplama ve Analizi veritabanlarını kullanarak standardizasyon BM myeloid hücrelerin displastik değişiklikler ile ilgili en alakalı fenotipik anormallikler tanımlaması sağlayacak. Bu nedenle, iyi etiketli ve iyi tanınan biçimlerinin (otomatik popülasyon ayırıcı (APS) diyagramları, çubuk grafikler ve nokta araziler) dayalı istatistiksel olarak seçilen alt kümeleri sonraki analizinde kullanılan bir analizi strateji geliştirmek için gerekli olan yuvarlar. MDS sağlam fenotipik anormallikleri keşfi ile veya minimal morfolojik displazi ve sitogenetik aberrancies olmadan durumlarda tanı hafifletir miydi. İmmunophenotypic panelleri azaltılması için izin ayrımcı parametreleri tanımlaması onların uygulanabilirliği klinik patoloji laboratuarlarında izin geçerli puanları2, kolaylaştırmak.
Bu yöntem sitometresi veri, öznel yorumlarını MDS tanı3' te sinyal olarak sınırlar. Bu adım işleme ve akış veri4analiz otomatik araçları geliştirilmesi için bir önkoşuldur.
MDS klonal hematopoetik kök hücre (HSC) bozuklukları spliceosome mutasyonlar MDS fenotip vermeye belirli epigenetik değiştiriciler ile işbirliği heterojen bir grup oluşur. Şimdi HSC mutasyonlar ile birlikte diğer mekanizmaları anormal Bağışıklık-aracılı inflamasyon ve malign HSCs ve BM stromal microenvironment arasındaki etkileşimler gibi MDS patofizyolojisi katılmaktadırlar, bilinen. Ancak, bu mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. MDS geniş klinik ve biyolojik heterojen tanı ve en uygun tedavi yelpazesi bir meydan okuma yapar. Son on yılda birden fazla çalışmalar MFC kez daha olduğunu göstermiştir içinde hafiye displazi2 morfoloji ama teknik ve ekonomik kısıtlamaları daha duyarlı olun bu teknik, sonuçlar genellikle bağlı olarak standart hale getirmek zor Tercüman3deneyim. Ayrıca, nasıl MFC minimal morfolojik displazi olgularının ve sitogenetik anomali yokluğu veya hypocellular MDS, düşük patlama sayısı, olan gibi sınırda durumlarda denge MDS doğru klonal olmayan diğer BM ipucu belli değil kemik iliği yetmezliği gibi bozukluklar (i.e., aplastik anemi). Ayrıca akut miyeloid lösemi (AML) MDS sınırda durumlarda patlamalar bir fazlalığı ile ayırt etmek zor kalır. Tüm bu nedenlerden dolayı MFC MDS son tanı test klinik yönergeleri entegre değil. 2011 yılında ABD Ulusal kapsamlı kanser ağ (NCCN) CD34 + hücre yüzdesi, paroksismal nokturnal hemoglobinuria klonlar tespiti ve sitotoksik T Hücre klonlar hypocellular MDS5varlığı tahmini için MFC önerilir. Klinik veri immünsüpresif tedavi6bu hastaların iyi bir tepki göstermiştir olduğundan bu iki ikinci durum terapötik bir hedef de içerir. Uluslararası çalışma grubu (IWG) öneriler, gerekçe göstererek 2017 NCCN yönergeleri MFC tarafından anormal immunophenotyping algılama MDS tanı için ama herhangi bir özellikleri6yapmadan Co kriterlerin yanında listelenir. Buna ek olarak, kısa bir süre önce WHO sınıflandırma MFC bulgular yalnız MDS birincil tanısı kesin morfolojik ve/veya sitogenetik veri7yokluğunda kurmak için yeterli değildir öngörülüyor. Ancak, MFC olgunlaşma desenleri myeloid hücre bozukluk gösteren ve "mesafe"--dan normal bir hasta için hastalık sahası içinde belirli bir zamanda miktarının ek bir test olarak kullanılabilir.
Bu yöntem klinik laboratuvarlarında çalışan BM myeloid hücrelerin MDS veya displastik anormallikler ile diğer myeloid bozuklukları tanı iyileştirmek için MFC immunophenotyping, kullanarak displazi değerlendirilmesi ile ilgilenen geçerlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1217px;" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">BD FACSCanto II flow-cytometer</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td style="width:344px;">SN: V33896301336</td>
			<td style="width:344px;">3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Awel C48-R Centrifuge</td>
			<td>AWEL Industries, FR</td>
			<td>SN: 910120016; Model No: 320002001</td>
			<td>low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipetts of 10&#181;l and 200&#181;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polypropylene tube for FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human HLA-DR</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655874</td>
			<td style="width:344px;">clone L243 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V450 
			(Ex max 404 nm/ 
			Em max 448 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560777</td>
			<td style="width:344px;">clone HI30 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ 
			Em max 500 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD16</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656146</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD13</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347406</td>
			<td style="width:344px;">clone L138 
			Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>347222</td>
			<td style="width:344px;">clone 8G12 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PerCP-Cy5.5 
			(Ex max 482 nm/ 
			Em max 678 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD117</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>339217</td>
			<td style="width:344px;">clone 104D2 
			Mouse BALB/c IgG1 
			Fluorochrome PE-Cy7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD11b</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>333143</td>
			<td style="width:344px;">clone D12 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			D12, Fluorochrome APC 
			(Ex max 650 nm/ 
			Em max 660nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD10</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>646783</td>
			<td style="width:344px;">clone HI10A 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD35</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>555452</td>
			<td style="width:344px;">clone E11 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD64</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>644385</td>
			<td style="width:344px;">clone 10.1 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD300e</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>IREM2A-T100</td>
			<td style="width:344px;">clone UP-H2 
			Mouse BALB/c IgG1, k 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD14</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>641394</td>
			<td style="width:344px;">clone MoP9 
			Mouse BALB/c IgG2b, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD36</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656151</td>
			<td style="width:344px;">clone CLB-IVC7 
			Mouse IgG1, &#954; 
			Fluorochrome FITC 
			(Ex max 494 nm/ 
			Em max 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>560839</td>
			<td style="width:344px;">clone 266 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome PE 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD33</td>
			<td></td>
			<td>345800</td>
			<td style="width:344px;">clone P67.6 
			Mouse BALB/c IgG1, &#954; 
			Fluorochrome APC 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 578 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Mouse Anti-Human CD71</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>655408</td>
			<td style="width:344px;">clone M-A712 
			Mouse BALB/c IgG2a, &#954; 
			Fluorochrome APC-H7 
			(Ex max 496 nm/ 
			Em max 785nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSFlow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva CS&#38;T IVD beads</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>656046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td>SPH-RCP-30-5A</td>
			<td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3</td>
			<td>BD Biosciences, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>R&#38;D Systems, Minneapolis, USA</td>
			<td>5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium azide 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:344px;">199931</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Infinicyt software version 1.8.0.e</td>
			<td>Cytognos, Salamanca, Spain</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

database-guided flow-cytometry for evaluation of bone marrow myeloid cell maturation

Fransızca sitometresi Derneği (AFC) içinde başlatılan bir çalışma grubu miyeloid hastalık tanı Fransa multiparameter akış sitometresi (MFC) uygulama uyum amacıyla geliştirilmiştir. Burada sunulan protokolü üzerinde anlaşılan ve Eylül 2013 ve Kasım 2015 yılları arasında uygulanan altı Fransız tanı Laboratuarı (Üniversite Hastaneleri Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice ve Lille ve Institut Paoli-Calmettes oldu Marsilya) ve kemik iliği örnek hazırlama ve veri toplama standardizasyon izin verdi. Üç olgunlaşma veritabanı nötrofil, Monositik, ve erythroid soy "sağlıklı" donör bireyler (bireyler hematopoetik hastalık herhangi bir kanıt olmadan) kemik iliği ile geliştirilmiştir. Analiz sağlam bir yöntem her miyeloid lineage için rutin tanı kullanım için uygulanabilir olmalıdır. Yeni olgu aynı şekilde analiz ve her zamanki veritabanlarının karşı karşılaştırıldığında. Böylece, nicel ve nitel fenotipik anormallikler tespit edilmesi ve bu normal kemik iliği örnekleri verilerle karşılaştırıldığında 2SD yukarıda gösterge patolojisi düşünülmelidir. Daha yüksek değişkenlik Hibridoma teknolojilerini temel alan ve şu anda klinik tanıda kullanılan yöntemleri ile elde edilen monoklonal antikor kullanılarak elde veriler arasında büyük kısıtlamadır. Alınan veri teknik doğrulama ölçütlerini ayar MFC yardımcı programı için MDS diagnostics artırmanıza yardımcı olabilir. Bu kriterler kurulması bir veritabanıyla analiz gerektirir. Veri Analizi araştırmacı öznellik azalma bu yöntemin önemli bir avantajdır.

K-EDTA antikoagülan hasat 54 BM örnekleri çalışmaya dahil. MFC veri yokluğunda hastalar hakkında herhangi bir bilgi, analiz edildi. Retrospektif çalışma BM örnekleri (5 erkek ve 47.4 [35-48] 2 kadın bir Medyan yaş ile hematopoetik hastalığı (8 ve 57,9 [35-72] bir Medyan yaş ile 3 erkek) kanıtı yok ile 11 kişi ve 36 olgu çeşitli ile 7 sağlıklı bağışçılardan olduğunu gösterdi patolojik koşullar: 1 durumda anemi ve düşük kreatinin düzeyi, anemi ve yükse...

Watch this Scientific Journal Video about Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation at JoVE.com

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

MDS tanı morfolojik ölçüt veya bilgilendirici sitogenetik yokluğunda zordur. MFC MDS tanı sürecinin rafine yardımcı olabilir. Klinik uygulamalar için faydalı olmak için MFC analiz parametreleri üzerinde yeterli özgüllük ve duyarlılık ile esas almalıdır ve veri arasında farklı operatör tekrarlanabilir olmalıdır.

Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Bu yöntem miyelodisplazi sendromları veya miyeloid hücre soylarında olgunlaşma anormallikleri ile gelişen diğer hematolojik hastalıklar gibi miyeloid hastalıkların tanısında anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu analiz ve yorumlamada araştırmacının öznelliğini azaltmasIdır. Bu yöntem, miyelodisplazi için en ayrımcı parametrelerin hangileri olduğunu anlamalarını sağlayabilir.Normal miyeloid hücre popülasyonlarından farklılıkların ölçülmesine izin verir. Prosedürü gösteren Tiphanie Picot, bizim laboratuvardan doktora sonrası bir adam olacaktır. Birincil hücre örneğinin 600 mikrolitresini, 15 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre yıkama tamponu yla iki santrifüj ve yıkama başına 10 mililitre taze yıkama tamponu ile karıştırarak başlayın.İkinci yıkamadan sonra, peleti 400 mikrolitre taze yıkama tamponu yla yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunun 350 mikrolitresini omurga antikorlarının tüm panelini içeren beş mililitrelik polipropilen FACS tüpüne aktarın. Hücreleri iyice karıştırdıktan sonra, pipet hücre antikor çözeltisinin hacimleri üç yeni polipropilen tüplere eşit hacimlerde ve gerektiğinde taze yıkama tamponu ile 200 mikrolitreye kadar her tüpteki son hacmi getirir. Daha sonra, ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için, karıştırma ile ilgi hücre yüzeyi belirteçleri karşı antikorların uygun hacmi ekleyin.Kuluçka sonunda, ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için karıştırma ile iki mililitre lysing çözeltisi ekleyin. Santrifüj ile lysed hücreleri toplamak ve pelet rahatsız etmeden, her tüpte supernatant son 50 mikrolitre hariç tüm atın. Kalan süpernatantpelet yeniden askıya, nazik karıştırma ile, ve her örnek için taze yıkama tampon iki mililitre ekleyin.İkinci yıkamadan sonra, her tüpte peleti bozmadan yaklaşık 50 mikrolitre kalıntı hacmi bırakarak süpernatantı atın. Hemen analiz için, karıştırma ile PBS 200 mikrolitre pelet yeniden askıya. Akış sitometresindeki örnekleri okumak için, önce akış sitometre yazılımında yeni bir deneme açın ve denemeyi ada, örnek türüne ve tarihe göre yeniden adlandırın.Üç tüp için yeni bir örnek oluşturun ve deneme düzeninde her tüpte kullanılan antikorları belirtin. Aylık kurulumda elde edilen değerleri uygulamak için sitometre ayarlarını açın ve uygulama ayarlarını seçin. Yeni bir küresel çalışma sayfası açın ve tek lisit hücrelerinin yanı sıra granülosit, monosit, patlama ve lenfosit popülasyonları için uygun nokta çizimlerini oluşturun.Telafi denetimleri için yeni bir genel çalışma sayfası oluşturun. Daha sonra, her tüpten 500,000 olay elde edin, orta satın alma oranında, verileri teknik doğrulamalarından sonra fcs 3.0 dosyaları olarak dışa aktarın. Yeni bir analize başlamadan önce, nötrofil, monositik ve çekirdekli kırmızı soylar için normal kemik iliği verilerini içeren cyt dosyalarını ve analiz dosyalarını inp formatında indirin.Ardından, verileri masaüstünüze kaydedin. Nötrofil olgunlaşmasını veri tabanına kaydetmek için önce Infinicyt yazılımını açın ve ardından nötrofil olgunlaşma verilerine karşılık gelen cyt dosyasını açın. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve nötrofilin olgunlaşma yolunu veritabanına kaydedin.Analiz edilmesi gereken nötrofil soy olgunlaşması için fcs dosyasını açın. Profiller sekmesinden nötrofil olgunlaşma inp dosyasını yükleyin. Bu soy için analiz üç adıma ayrılmıştır.CD34 pozitif, nötrofil kararlı patlamalar seçimi ile başlayın. Bu amaçla, CD34 pozitif, CD117 pozitif, HLADR düşük, CD10 negatif, CD13 pozitif, CD11 b-negatif olayların seçimine izin vermek için yedi kapının kesişme sini kullanın. CD117 pozitif, CD34 negatif nötrofil öncüllerinin seçimi ile analize devam edin.Daha olgun nötrofil hücrelerinin seçimi ile analize devam edin. Sonra, monositik soy hücrelerinin analizini gösterin. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin.Olgunlaşma duygusunu gösteren okun olgunlaşmamış, monositik hücrelerden CD14 negatif, IREM2 negatif, olgun monositler, CD14 pozitif, IREM2 pozitif edoğru olduğunu doğrulayın. Olgunlaşma yolunu monositik soy için veritabanına kaydedin. Analiz edilmesi gereken monositik soy olgunlaşması için fcs dosyasını açın.Monositik soy analizi için profili yükleyin. Monositik soy hücrelerini tanımlamak için, CD64 pozitif yüksek, CD117 pozitif, CD117 negatif, HLADR pozitif olayların seçimine izin veren dört kapının kesişimini kullanın. Bu olayları nüfus hiyerarşisi ağacındaki monositik sekmeye atayın.NRC veritabanına kaydedilmesi gereken NRC cyt dosyasını açın. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve çekirdekli kırmızı hücrelerin olgunlaşma yolunu veritabanına kaydedin. Analiz edilmesi gereken fcs dosyasını açın.Profillerden çekirdekli kırmızı hücreler için analiz şablonu yükleyin. Bu soy için çözümleme iki adıma ayrılmıştır. CD34 pozitif seçimi ile başlayarak, eritroid patlamalar taahhüt etti.Burada, CD34 pozitif, CD117 pozitif, HLADR düşük, CD105 pozitif, CD33 negatif, CD36 pozitif, CD71 pozitif olayların seçimine izin vermek için yedi kapının kesişimini kullanın. Bu olayları nüfus hiyerarşisindeki NRK sekmesine atayın. CD34 pozitif eritroid taahhüt patlamaları görünürlükten çıkarın.Daha olgun eritroid hücreleri tanımlamak için, CD45 negatif ve CD45 pozitif düşük, yan dağılım düşük, CD36 pozitif yüksek ve CD71 pozitif yüksek ayrımcılık sağlayan dört kapı bir kesişme kullanın. Ardından, CD36 yüksek yan dağılım düşük trombositlerini çekirdekli kırmızı hücrelerden çıkarın ve bu popülasyonu NRK sekmesine atayın. Kemik iliği bölmesindeki miyeloid olgunlaşmayı değerlendirmek için, değerlendirilmesi gereken davadan alınan ilgi soyundan gelen sit dosyasını açın.Yalnızca nüfus hiyerarşisi ağacında nötrofil sekmesine atanan olayları görünür tutun. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve nötrofilin normal kemik iliğindeki olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın. Veriler en azından kısmen uyumluysa, yazılım olgunlaşma farklılıklarını görselleştirmek için normalleştirilmiş bir olgunlaşma farkları diyagramı ve bir parametre bandı oluşturur.Kemik iliği bölmesi monosit olgunlaşma karşılaştırmak için, monositveritabanı da dahil olmak üzere normal kemik iliği verileri ile yeni bir durumda, monositik hücre soyu karşılık gelen sit dosyasını açın. Yalnızca popülasyonlar hiyerarşisi ağacında monositler sekmesine atanan olayları görünür tutun ve APS grafiğinde olgunlaşma yolunu çizin. Normal kemik iliklerinde monosit olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın.Kemik iliği bölmesi çekirdekli kırmızı hücrelerin olgunlaşmakarşılaştırmak için, yeni bir durumda, normal kemik ilikleri verileri ile, NRC veritabanında dahil, NRC soyundan karşılık gelen sit dosyasını açın. Yalnızca nüfus hiyerarşisi ağacında NRK sekmesine atanan olayları görünür tutun. Ve APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin.Normal kemik iliklerinde NRC olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın. Ardından, yeni dosya ile veritabanında bulunan veriler arasındaki farkların önemini görselleştirmek için normalleştirilmiş olgunlaşma farklarını tıklatın ve yakınlaştırın. Akış sitometrik veri analizinde hiyerarşik sınıflandırma algoritmalarını kullanan yöntemlerin son derece öznel ve doğal olarak yanlış olduğunu unutmayın, çünkü hücre popülasyonu çakışması için sayılmazlar.Miyeloid normal olgunlaşma veritabanlarına karşı MDS olduğundan şüphelenilen yeni sitopeni olgularının değerlendirilmesi, sitolojik veya sitojenik anormallikleri olmayan olgularda bile nötrofil, monosit ve NRC soylarının anormal ifade edilmiş olgunlaşma antijenlerinin belirlenmesine olanak sağlar. Bu yordamı denerken, akış sitometrik verileri standart bir şekilde elde etmeyi, aylık sitometre ayarını, günlük kontrolleri, kullanmadan önce antikorları titizlikle pipetleme yi ve boyama sürelerine saygı göstermeyi unutmamak önemlidir. Bu yordamı takiben, pusula gibi başka bir yöntem, farklı olgu grubunu karşılaştırmak ve belirli bir vaka grubu için son tipobik künyenin ne olduğu gibi ek sorulara yanıt vermek için gerçekleştirilebilir.Bu teknik, geliştirildikten sonra, displastik süreçle güvenilir bir şekilde ilişkili son typic değişiklikleri belirlemek için belirsiz potansiyelklonal hematopoezis durumlarında, miyeloid hücre olgunlaşma desenleri keşfetmek isteyen araştırmacılar için yol açtı. Veritabanını sağlıklı bağışçılardan gelen veri sayısıyla güncellemenin analizin sağlamlığını artırabileceğini lütfen unutmayın.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Akut Graft-Versus-Host Hastalığı Biyomarkörler onaylanması için Yüksek Verimli Sıralı ELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Hacimsel Capnography ve barometrik pletismografisi akciğer yapısı işlev ilişki ölçmek için birleştirme

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Sıçanlarda Mandibuler Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Yetiştirilmesi

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...