Name: stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts at JoVE.com

Os autores agradecer o pessoal do Hospital Universitário animal instalação (UTE) de Nantes para pecuária e cuidados, o celular e tecidual de imagem facilidade do núcleo da Universidade de Nantes (MicroPICell) para a imagem latente e a facilidade de citometria (Cytocell) de Nantes para sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO inter-regional 2017) e o consórcio europeu ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). A equipe é financiada pelo Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Este trabalho foi realizado no contexto do LabEX IGO e os programas IHU-Cesti, suportado pelo nacional investigação Agência Investissements d'Avenir através dos programas ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, respectivamente. O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Metropole e a região de Pays de la Loire. Os autores agradecer Chirine Rafia para fornecer ajuda em corrigir o manuscrito.

As procedimento envolvendo animais disciplinas foi realizada segundo as orientações institucionais (acordo #00186.02; Comitê de ética regional de Pays de la Loire [França]). Humano PBMC foram isolada a partir do sangue coletado de doadores saudáveis informados (Etablissement Français du Sang Nantes, França). Todas as etapas são executadas sob condições estéreis.
1. não-específica expansão de linfócitos citotóxicos Effector T
<ol><li>Preparar e irradiar as células alimentado...

<ol>
	<li>Stupp, R., Roila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+ESMO+clinical+recommendations+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).</li><li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet?.">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet?.</a> Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).</li><li>Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. 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G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas.">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).</li><li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+depletion+followed+by+intracerebral+CpG-ODN+injection+induce+brain+tumor+rejection.">Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection.</a> Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).</li><li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+immunotherapeutic+potential+of+gammadelta+T-cells+in+patients+with+glioblastoma.">Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).</li><li>Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+of+allogeneic+innate+lymphocyte+therapy+for+glioma+patients+with+prior+cranial+irradiation.">The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).</li><li>Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+responses+of+the+central+nervous+system.">Innate and adaptive immune responses of the central nervous system.</a> Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+sustained+delivery+of+5-fluorouracil+from+biodegradable+microspheres+for+the+radiosensitization+of+glioblastoma:+a+pilot+study.">Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study.</a> Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).</li><li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+implantation+of+5-fluorouracil-releasing+microspheres+in+malignant+glioma.">Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma.</a> Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).</li><li>Salot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expansion+of+gamma+9+delta+2+T+lymphocytes:+Innacell+gamma+delta+cell+therapy+product.">Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product.</a> Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).</li><li>Bennouna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-I+study+of+Innacell+gammadelta,+an+autologous+cell-therapy+product+highly+enriched+in+gamma9delta2+T+lymphocytes,+in+combination+with+IL-2,+in+patients+with+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li></ol>

Uma transferência adotiva de selecionado nativo ou células efetoras imune engenharia representa uma abordagem promissora para tratar eficientemente a tumores, como câncer de cérebro infiltrativa, tendo o cuidado de limitar reatividades contra células não-transformadas15, 16,17,18. No entanto, o sistema nervoso central, que compreende o cérebro, tem um determinado status imune, nomeadame...

GBM (quem grau astrocitoma IV), é o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos. Apesar de tratamentos agressivos que combinam radio-quimioterapia e cirurgia, GBM continua associada com um prognóstico extremamente pobre (sobrevida média de 14,6 meses e um ano-2-mortalidade > 73%)1. Isto evidencia que alguns avanços terapêuticos eficientes foram validados ao longo da última década2. Entre os candidatos para a concepção de estratégias terapêuticas mais eficazes3,4,5, imunoterapias6 são atualmente exploradas para controlar e eliminar altamente invasivo e rádio/quimioterapia-resistente do tumor células, suspeitadas por sua contribuição fundamental para a rápida e fatal tumor recaída7. Vários alvos imunológicos foram identificadas e propostas para imunoterapias, envolvendo natural ou αβ modificado ou linfócitos T de ϒδ como antígenos do tumor GBM específicos ou estresse induzido por moléculas8,9, 10. A possibilidade de administrar efetores de células imunes GBM-reativos selecionados representa uma oportunidade única para entregar quantidades elevadas de linfócitos efetores diretamente no site da malignidade residual. Para oferecer suporte a esta estratégia, nós recentemente demonstraram que modelos baseados em camundongos imunodeficientes carregando ortotópico primários xenografts humanos de GBM fielmente recapitular o desenvolvimento de tumores cerebrais em GBM pacientes9,11. Além disso, estes modelos foram usados para demonstrar a eficiência forte antitumoral de enviaram transferidos linfócitos humanos alogênico de Vϒ9Vδ2T.
Este protocolo descreve as etapas experimentais críticas para alcançar imunoterapias estereotáxica de tumores cerebrais, tais como GBM, com base na transferência adotiva de alogênico linfócitos T. O artigo mostra: (i) a amplificação de linfócitos terapêuticos alogénicos imunes efetoras T, tais como linfócitos humanos Vϒ9Vδ2T; (ii) a preparação destes linfócitos efetores T para injeção; (iii) o processo de administração estereotáxica dentro do cérebro, perto do tumor. Este artigo também fornece insights sobre o comportamento desses efetores celulares após a injeção estereotáxica.
A abordagem terapêutica aqui apresentada baseia-se a injeção de 20 x 106 efetoras células por dose para cada mouse imunodeficientes rolamento-tumor de cérebro. Uma etapa de expansão inicial em vitro é necessária para produzir grandes quantidades de células do sistema imunológico. Portanto, expansões de célula não-específicas são executadas usando a Fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiados células alogénicas alimentador: células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis e célula B-lymphoblastoid Epstein Barr vírus EBV-transformado linhas (BLCLs), derivado de PBMC por infecção em vitro com cultura EBV-contendo sobrenadante da linha celular sagui B95-8, na presença de 1 µ g/mL ciclosporina-A.
Células imunes efetoras GBM-reativa são comparadas e selecionadas a partir de vitro ensaios9. Estas células efetoras são ativadas e amplificado usando protocolos padrão, de acordo com sua natureza (por exemplo, de linfócitos humanos Vγ9Vδ2 T9 ou humano anti-herpes vírus αβ T linfócitos12) com uma pureza mínima de > 80%, como rotineiramente verificada pela análise cytometric. O procedimento de expansão celular detalhado abaixo aplica-se a vários subconjuntos de linfócitos humanos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PBMCs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:232px;">from 3 different healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BLCLs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>from 3 different donors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">FCS</td>
			<td style="width:136px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">IL-2</td>
			<td style="width:136px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;">proleukin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PHA-L</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Mouse adaptator for stereotaxic frame&#160;&#160;</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">51624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microsyringe pump injector&#160;</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoFil Syringe</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">NF34BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">NSG mice</td>
			<td style="width:136px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">NSGSSFE07S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Ketamine</td>
			<td style="width:136px;">Merial</td>
			<td style="width:119px;">Imalg&#232;ne 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylazine</td>
			<td style="width:136px;">Bayer</td>
			<td style="width:119px;">Rompur 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Scissors</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">201758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Forceps</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OmniDrill 115/230V</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td align="right">503598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Vicryl 4-0</td>
			<td style="width:136px;">Ethicon</td>
			<td>VCP397H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylocaine</td>
			<td style="width:136px;">Astrazeneca</td>
			<td>3634461</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos, é geralmente associada com um prognóstico pobre e escassas eficientes terapias têm sido propostas ao longo da última década. Entre os candidatos promissores para a concepção de novas estratégias terapêuticas, imunoterapias celulares têm sido alvo para eliminar altamente invasivo e células tumorais de quimio-radioresistant, provavelmente envolveram em uma recaída rápida e fatal de câncer. Assim, organismos de alogênico GBM-reativa efetores célula imune, como linfócitos T Vϒ9Vδ2 humanos, nas proximidades do tumor que representa uma oportunidade única para entregar eficiente e altamente concentrado agentes terapêuticos diretamente para o site de malignidades do cérebro. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito pré-clínicos para a viabilidade e a eficácia antitumoral destes imunoterapias celulares que dependem de injeções estereotáxica de linfócitos humanos alogênico dentro camas de tumor intrabrain.

Este estudo descreve a estratégia de transferência adotiva de células efetoras imune celular dentro do cérebro de camundongos portadores de tumor, baseado em injeções estereotáxica realizadas diretamente dentro da cama do tumor.
Para minimizar qualquer risco de lesão cerebral associada com um volume grande de injeção, a suspensão de células efetoras precisa ser concentrado (20 x 106 células em 15-20 µ l ...

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Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

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Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...