Name: long-term in vivo tracking of inflammatory cell dynamics within drosophila pupae
Uploaded: 2018-06-14T14:45:00
Duration: 9 min 26 s
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Vorremmo ringraziare i membri del Martin, Nobes, Richardson e legno labs per utile discussione. Ringraziamo anche la struttura di Bioimmagini Wolfson (Università di Bristol, UK), il centro di Stock di Bloomington (Indiana University, USA) e Vienna Drosophila Resource Centre (per le scorte di Drosophila ) e Flybase (per fino ad oggi della drosofila annotazioni geniche). Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto MRC per P.M. e W.W. (MR/J002577/1), un Wellcome Trust Senior Fellowship di W.W. e un Wellcome Trust Investigator Award al P.M..

Questo protocollo è costituito da quattro fasi sequenziali principali: (1) preparazione di Drosophila scorte e messa in scena di Drosophila pupe, dissezione pupale (2) e il montaggio, ferendo pupale (3), (4) in vivo imaging time-lapse confocale.
1. preparazione degli stock di Drosophila e messa in scena di pupe
<ol><li>Ottenere adeguate scorte di Drosophila (Vedi introduzione e Tabella materiali).</li>
	<li>Raccogliere le mosche adulte sani giovane del genotipo appropriato.<ol>
<li>Seleziona adulto Vola utilizzando pastiglie di gas di biossido di carbonio per anestetizzare brevemente le mosche e un pennello fine per trasferire Vola del genotipo appropriato o il sesso in una fiala di raccolta.</li>
		<li>Aggiungere 20 maschi e 20 femmine vergini ogni flaconcino contenente cibo volare standard media (una miscela di farina di mais-melassa-agar, Vedi Tabella materiali) completati con lievito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la generazione di pupal ottima, le mosche adulte una mancia ogni giorno sul nuovo cibo in fiale fresche, mantenendo tutte le fiale a 25 ° C. Nota: Se viene utilizzato il sistema Gal4-UAS31 per guidare l'espressione genica di lineage-specifici, tutti passaggi devono essere eseguiti a 25 ° C o superiore, come il sistema Gal4-UAS è sensibile alla temperatura.</li>
	<li>18 ore prima della sessione di formazione immagine pianificata, selezionare almeno 10 neonate bianche pre-pupe (Figura 1A) dai flaconcini (cioè 0 h dopo la formazione del pupario, APF) utilizzando forcipe o un pennello fine per sloggiare pupe dalla superficie interna flaconcino e pupe di trasferimento con attenzione al lato di un flaconcino di plastica pulita vuoto. Nota: Errante 3rd instar larve strisciano verso l'alto fuori il mezzo di cibo a subire impupamento; Neonata bianche membranose sono facilmente identificabili come possiedono anteverso spiracoli anteriori e sono stazionari (a differenza di 3rd instar larve). La cuticola si trasforma in 'pupario' (il caso pupal) che è inizialmente bianco e morbido17. Deve prestare attenzione per evitare di danneggiare le pupe, come questo può condurre non solo ad una risposta infiammatoria indotta da lesione indesiderata, ma anche un significativo ritardo dello sviluppo.</li>
	<li>Età le pupe selezionate per la fase inerente allo sviluppo appropriata (18h APF darà risultati ottimali) nel flaconcino a 25 ° C. Nota: Come sviluppano le pupe, il caso pupal diventerà progressivamente più scuro e più fragile.</li>
	<li>Preparare altri reagenti per il passo successivo prima del tempo. Per rendere l'eptano colla, combinano una lunghezza di 20 cm di nastro biadesivo arrotolato con eptano 20 mL in una provetta da centrifuga 50ml, sigillare con la pellicola di paraffina e rock a temperatura ambiente durante la notte in panchina.</li>
</ol>2. preparazione e dissezione della drosofila pupe
<ol><li>Trasferire le pupe di Drosophila in scena un pezzo di nastro adesivo bifacciale montato su un vetrino. Posizionare le pupe in modo che il lato ventrale è saldamente attaccato al nastro e la parte dorsale è rivolto verso l'alto (Figura 1B). Nota: L'anteriore della pupa sarà identificabile dai due spiracoli che sporgono dalla parte anteriore del caso pupal.</li>
	<li>Rimuovere accuratamente pupe dal loro involucro protettivo pupario sotto un microscopio di dissezione di campo chiaro utilizzando forcipe e micro-forbici (Figura 1B-D).<ol>
<li>Inizialmente, fare un'incisione nella regione anteriore-la maggior parte del pupario usando il forcipe (Figura 1B). Assicurarsi che il caso pupal in quest'area sia vuoto e privo di tessuto pupal perché le pupe sono state ridimensionate all'interno il caso durante lo sviluppo iniziale di pupal.</li>
		<li>Dopo questa incisione iniziale, attentamente strappare o tagliare il caso pupal aperta in un anteriore di direzione posteriori con pinze o microforbici (Figura 1) fino a quando la pupa è completamente esente dall'involucro fragile opaco marrone (Figura 1). Nota: Pupe in questa fase sono molto fragili e cura deve essere presa per evitare di perforare la superficie pupal; perforatura è evidente come l'emolinfa rapidamente perdite fuori dal sito di puntura. Pupe con forature, seppur piccole, devono essere eliminate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montare le pupe in un piatto fondo di vetro con colla eptano.<ol>
<li>Utilizzare una punta di pipetta 20 mL per mettere una goccia di 10 mL di colla pre-preparati eptano (Vedi sezione 1.6 sopra) in una linea sul piatto con fondo di vetro.</li>
		<li>Consentire la colla si asciughi per 5 s prima di trasferire le pupe dissecate accuratamente sulla colla eptano usando il forcipe (Figura 1E).</li>
		<li>Per facilità di ferimento e di imaging, allineare le pupe di fila; circa 5 pupe sono suggeriti ma più saranno gestibili con esperienza. Nota: Uso di eptano colla è consigliato quando si utilizzano sistemi di imaging in posizione verticale, ma non è necessario quando si utilizza un sistema invertito. Se la colla crea ottica aberrazioni durante imaging, pupe possono essere posizionate direttamente sul coprioggetto invece – l'adesione naturale fra il tessuto pupal e vetro sarà sufficiente nella maggior parte dei casi per l'imaging stabile, come cura quando si sposta l'imaging piatto tra microscopi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per ottenere risultati ottimali, è necessario montare le pupe in modo che l'ala sia piatta il coprioggetto con la maggior parte della superficie dell'ala a diretto contatto con il coprioggetto (Figura 1F). Rotolare le pupe usando pinze per cambiare la loro posizione per assicurarsi che l'ala sia montata correttamente.</li>
	<li>Per prevenire la disidratazione del campione durante il periodo di formazione immagine, aggiungere un pezzo di carta da filtro assorbente imbevuto di acqua distillata al lato del piatto con fondo di vetro alla fine del montaggio, facendo attenzione a non disturbare le pupe (Figura 1E). Coprire il recipiente con un coperchio. Nota: Pupe sono ora pronti per ferire e imaging.</li>
</ol>3. laser-induced ferimento di Drosophila Pupal Ali
<ol><li>Trasferire il piatto con fondo di vetro contenente le pupe montate ad un largo campo microscopio dotato di un sistema di ablazione laser sintonizzabile.<ol>
<li>Uso un pulsata-UV raffreddato ad aria azoto-pompato ablazione laser sintonizzato a 435 nm – Vedi Tabella materiali per dettagli11; la precisa lunghezza d'onda della luce utilizzata per l'illuminazione viene selezionata dall'utente tramite una cella colorante appropriato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando ottiche campo chiaro, regolare i controlli di fase di microscopio per individuare l'ala pupal della pupa prima di essere ferito (Figura 1F).</li>
	<li>Per risultati ottimali, utilizzare un obiettivo obiettivo ad immersione 40x o 63 X per entrambi l'imaging e laser ablazione; Assicurarsi che il liquido di immersione usato (olio o glicerolo) è coerenza tra l'ablazione e sistemi di imaging. Regolare il microscopio di concentrarsi sul piano dell'epitelio pupal ala più vicina il vetrino coprioggetti (cioè messa a fuoco sulla regione dell'epitelio a essere ferito) utilizzando la manopola di messa a fuoco fine.</li>
	<li>Utilizzando le regolazioni di fase di microscopio, posizionare l'ala pupa, in modo che l'area per essere ferito è direttamente allineata con l'area di destinazione nota di ablazione laser.</li>
	<li>Utilizzare una diapositiva di attenuatore di densità di energia montata al microscopio per regolare manualmente il livello di potenza della luce ablazione. Nota: Il dispositivo di scorrimento di attenuatore ha i fermi a scatto e sentenze per identificare il relativo livello di attenuazione e permettere l'utilizzo delle impostazioni riproducibili.</li>
	<li>Utilizzando un controllo manuale esterno trigger , attivate l'ablazione laser utilizzando un solo clic breve del trigger per rendere una ferita. Controllare per la comparsa di bolla aria transitoria al sito di ablazione poiché ferendo sarà normalmente accompagnato. Verifica se il ferimento indotta da laser ha avuto successo usando i filtri fluorescenti appropriati per visualizzare l'epitelio pupal. Nota: fare attenzione a evitare l'esposizione accidentale a fasci laser come le riflessioni del fascio possono causare l'occhio severo o danneggiare la pelle.</li>
	<li>Se ferendo ha esito negativo, variare il piano focale (spostando il focus di microscopio leggermente di sopra o sotto l'attuale livello di focale) e ripetere il semplice clic del grilletto ablazione. In alternativa, aumentare gradualmente la potenza del laser utilizzando la diapositiva di attenuatore fino a raggiunta la dimensione desiderata della ferita.</li>
	<li>Per variare la frequenza di ripetizione degli impulsi di ablazione laser, usare la manopola di frequenza di ripetizione sul pannello di controllo posteriore (che cambia la frequenza da meno di 1 impulso/s fino a 60 Hz). Per ferimento ottimale, impostare la frequenza di ripetizione degli impulsi a 40Hz.</li>
	<li>Per generare le ferite di dimensioni diverse, è necessario utilizzare la diapositiva di attenuatore di densità di energia per regolare manualmente il livello di potenza della luce ablazione.</li>
	<li>Astenersi dal ferimento tutte le pupe montate e utilizzare queste pupe non ha rimosso come controlli illesi.</li>
	<li>Per ottenere risultati costanti, regolarmente riallineare il sistema di ablazione (utilizzando il relativo manuale). Inoltre, pulire e riempire la cella del risonatore di tintura che controlla la lunghezza d'onda laser.</li>
</ol>4. in Vivo Imaging confocale time-lapse
<ol><li>Trasferire rapidamente il piatto con fondo di vetro per un microscopio appropriato per l'imaging di time-lapse. Nota: Per risultati ottimali, utilizzare una specifica elevata confocale o la filatura disco microscopio dotato di rivelatori sensibili in grado di rilevare sia GFP e mCherry fluorofori.</li>
	<li>Per realizzare l'immagine l'intera ala pupal, utilizzare una lente dell'obiettivo ingrandimento basso (ad es. 20 X) (Figura 2A). In ordine per la riparazione di immagine della ferita e la risposta infiammatoria che accompagna con elevata risoluzione spaziale, utilizzare l'olio da immersione 40x (NA 1.3) o 63 X lenti dell'obiettivo (NA 1.4) (Vedi immagini rappresentative in Figura 2B-D).</li>
	<li>Aprire il software di acquisizione immagine appropriata associato con il microscopio.</li>
	<li>Utilizzando il software di acquisizione immagine, accendere il laser appropriato ad es. la 488 nm e 561 nm laser per visualizzare fluorofori GFP e mCherry, rispettivamente (facendo clic nelle caselle pertinenti) e regolare la potenza del laser e guadagno/offset impostazioni per dare segnale fluorescente sufficiente, evitando la saturazione pixel; utilizzare la minima potenza possibile (nel range 5-20%) per ridurre al minimo photobleaching e fototossicità.</li>
	<li>Per catturare la riparazione dell'epitelio e reclutamento di cellule infiammatorie, impostare il microscopio per registrare un z-stack utilizzando le manopole di regolazione messa a fuoco sul pannello di controllo; per risultati ottimali, impostate il software (tramite clic del pulsante manuale) su record z-fette attraverso l'ala pupa (minimo ogni 3 mm), dall'alto dell'epitelio ferito attraverso allo spazio extracellulare sotto (contenente la migrazione emociti) per ottenere un grande z-stack (nella gamma di 50-100 mm).</li>
	<li>Per l'imaging di time-lapse, registrare z-stack a intervalli di tempo regolari (minimo ogni 30 s) per almeno 1 h post-ferimento. Nota: L'intervallo di tempo esatto tra z-stack scelto rappresenta un compromesso tra cattura le dinamiche di evoluzione delle cellule ed evitando foto-candeggio dei campioni.</li>
	<li>Per realizzare l'immagine contemporaneamente più pupe (inclusi controlli illesi non rimossa), utilizzare un tavolino motorizzato (collegato al microscopio) e la funzione di acquisizione multi-posizione disponibile all'interno del software di imaging. Impostare manualmente la posizione di ogni singolo pupa all'interno del software tramite le manopole di controllo posizione di fase e quindi impostare manualmente i limiti appropriati z-stack (superiore e inferiore) per ogni singolo pupa.</li>
	<li>Visualizzare le immagini time-lapse durante acquisizione immagine o più tardi con software di analisi di immagine di specialista (ad esempio di ImageJ32) utilizzando le proiezioni dello stack z o rendering 3D. Ad esempio, per seguire i movimenti di emociti individuali (come in Figura 2' e D'), i nuclei di emociti di traccia utilizzando l'accesso aperto ImageJ plug-in "TrackMate" o "Manuale di metodi di monitoraggio" (pubblicati in 33, 34).</li>
	<li>Utilizzare sonde fotoconvertibile (ad esempio di Kaede30) selettivamente fotoconvertita ed etichettare un sottoinsieme delle cellule epiteliali o immune durante la formazione immagine.<ol>
<li>Aprire i moduli appropriati all'interno del software di imaging per eseguire la fotoconversione (come ad esempio la FRAP, recupero di fluorescenza dopo lo sbiancamento foto modulo) e attivare il 405nm laser (facendo clic nella finestra di software pertinente)35.</li>
		<li>Selezionare le celle per essere photoconverted all'interno del software FRAP utilizzando lo strumento selezione quadrata, circolare o a mano libera. All'interno del software FRAP, impostare il corso di tempo per fotoconversione (imbianchimento) di un singolo iterazione/telaio e il laser di 405 nm al potere del laser di 20%. Manualmente, fare clic su avviare l'esperimento per eseguire fotoconversione.</li>
		<li>Uscire dal modulo FRAP (fare clic su Chiudi) e tornare alla schermata di imaging originale all'interno del software; uso la 488 nm e 561 nm laser per il comportamento delle cellule photoconverted e non photoconverted di immagine impostando un z-stack e registrazione time-lapse come sopra. Nota: La Photoconverted sonde rimangono stabili per molte ore dopo l'iniziale fotoconversione, consentendo il comportamento delle cellule photoconverted da seguire nel corso del tempo (per almeno 5 ore). Ad esempio, le cellule infiammatorie nella ferita possono essere selettivamente photoconverted (Figura 2F) e loro comportamento seguito come si risolvono dal sito di lesione (Figura 2 e H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+metabolism+in+tissue+repair+and+regeneration.">Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration.</a> Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).</li><li>Crusz, S. M., Balkwill, F. 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Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti conflitti di interessi.

La risposta infiammatoria acuta a danno di tessuto è un processo complesso e altamente dinamico che è essenziale per orchestrare la riparazione dei tessuti danneggiati, tra cui la liquidazione dei residui necrotici e la lotta contro l'infezione. Per comprendere appieno e svelare aspetti fondamentali di questa risposta, è fondamentale che gli studi sono eseguiti in vivo su campioni viventi 3-dimensionale in ordine per il comportamento preciso e interazioni dei vari cell lineages coinvolti da seguire con precisione nel tempo. Analisi in tempo reale di queste dinamiche di cella permette una più dettagliata caratterizzazione dei fenotipi mutanti di tempo-punti singoli statici da campioni fissati utilizzando tecniche di immunoistochimica classico. Tradizionalmente, la maggior parte degli studi di formazione immagine live utilizzando il modello di Drosophila geneticamente trattabile hanno usato la fase embrionale di sviluppo moscerino grazie alla sua ottica traslucenza e immobilità rispetto a successive fasi di sviluppo4 , 5. Tuttavia, più recentemente il nostro gruppo e altri hanno sviluppato la pupa di Drosophila come un modello di romanzo per eseguire ad alta risoluzione e a lungo termine di imaging di riparazione della ferita ed infiammazione simultaneamente in vivo8,22 ,23. Questo approccio emergente offre un'eccitante potenziale a lungo termine per unraveling aspetti fondamentali del comportamento delle cellule infiammatorie e può essere ulteriormente adattato per studiare il comportamento dinamico di altri lignaggi di cellule (ad esempio di Drosophila adipociti 38) dopo la lesione del tessuto.
Ci sono una serie di fattori critici durante la preparazione e la formazione immagine del ferito pupe di Drosophila che determineranno la qualità degli esiti imaging descritto sopra. Probabilmente il passo più difficile del protocollo descritto è la dissezione attenta e il posizionamento preciso delle pupe prima del ferimento e imaging. Pupe in questa fase inerente allo sviluppo sono estremamente fragili e anche lievi danni accidentali per le pupe durante le fasi di preparazione saranno significativamente alterare l'esperimento; qualsiasi pupe che possono subire danni involontari devono essere scartati dall'esperimento, poiché questo danno potrebbe attivare la propria risposta infiammatoria, che potrebbe condurre ad effetti più diffusa (o anche sistemici) il comportamento di cellule infiammatorie altrove in La pupa. A causa del continuo sviluppo delle pupe utilizzati in questi esperimenti (che stanno subendo le riorganizzazioni significativa del tessuto per preparare i tessuti per l'età adulta), occasionalmente pupe si muovono durante il corso di formazione immagine. Pupal rolling è, tuttavia, più probabilità di verificarsi se non sono stati montati correttamente pupe con la superficie più piatta dell ala (o altro tessuto essere imaged) nel contatto diretto con il coprioggetto; uso di eptano colla per stabilizzare le pupe il vetro di copertura dovrebbe ridurre al minimo questo movimento indesiderabile. Per questo motivo, si deve anche prestare molta attenzione per evitare di staccare le pupe da loro posizioni allineate con attenzione quando si spostano i campioni tra microscopi; Idealmente, il laser ferentesi sarà collegato al microscopio stesso da utilizzare per la formazione immagine successiva time-lapse e conversione di foto.
Oltre la capacitÃ della dissezione pupal e operazioni di montaggio, il genotipo esatto delle pupe Drosophila utilizzato avrà un effetto significativo sulla qualità dei dati di imaging generati. Ad esempio, il numero di copie del driver Gal4 e costrutti UAS (ad es. UAS-GFP o UAS-Kaede) all'interno di un singolo genotipo pupal determinerà il rapporto segnale-rumore durante la formazione immagine successiva. Come regola generale, più copie di un Gal4 o UAS costruire presente, maggiore sarà il livello totale di proteina fluorescente (per esempio GFP o Kaede) all'interno del tessuto. Il livello ottimale di proteina fluorescente, tuttavia, sarà un attento equilibrio tra elevando fluorescenza del tessuto sufficientemente per consentire di alta qualità delle immagini (consentendo l'uso di potenze laser inferiori, riduzione in photobleaching e imaging nel tempo esteso periodi) senza però provocare tossicità cellulare indotta da fluorophore; il numero ottimale di costrutti Gal4 e UAS in ogni esperimento varierà secondo il particolare driver e fluorofori utilizzati. Cura dovrebbe essere presa a sollevare le pupe a 25 ° C (o superiore, fino a 29 ° C) perché il sistema Gal4-UAS è sensibile alla temperatura e sarà inefficace a bassa temperature31. Per raggiungere ulteriori livelli di controllo sopra il tessuto o tempo-specificità di Gal4 -driven espressione, il repressore di sistema Gal4-UAS Gal80 possa anche essere incluso nel genotipo pupal39. Gal80 può essere utilizzato per reprimere Gal4 attività all'interno di un tessuto particolare (utilizzando un Gal80 tessuto-specifico) o in un determinato momento (utilizzando una temperatura sensibili Gal80). Il sistema Gal4-UAS può essere ulteriormente raggruppato con altri sistemi di binari indipendenti (ad esempio i sistemi di QF -QUAS e LexA -lexAop ) per generare drosofila che ha molteplici costruzioni (ad es. fluorofori, linee di RNAi o altri costrutti genetici) espresso simultaneamente in una gamma di tessuti differenti39.
Utilizzo di questo nuovo modello di Drosophila pupal offre una serie di vantaggi rispetto al più tradizionale approccio di embrione. Rispetto per l'imaging a breve termine (fino a 3 h) disponibile in embrioni in fase 15 (la fase in cui più embrionale ferendo studi vengono eseguiti), pupe possono essere imaged in significativamente più lunghi periodi di tempo (in capitale fino all'età adulta dopo 96 h di sviluppo pupa ). Inoltre, numeri di gran lunga maggiori di emociti (cellule immuni innate diDrosophila ) sono presenti all'interno dei tessuti pupal (e disponibili per l'imaging) rispetto al numero più limitato presente all'interno dell'embrione e questo ci ha permesso di raccogliere significativamente più dati sul comportamento di emociti utilizzando lo stesso numero totale di esemplari di imaging. Fondamentalmente, questo, a sua volta, ci ha permesso di applicare più sofisticati modelli matematici per analizzare il comportamento di emociti ed estrarre caratteristiche novelle della ferita attrattivi e risposta infiammatoria che sarebbe altrimenti rimaste sperimentalmente inaccessibili23. Un altro vantaggio del modello pupal è che quello atterramento di RNAi-mediata del gene è notevolmente più efficiente rispetto alle precedenti fasi embrionali, permettendo una migliore analisi del tessuto o inattivazione del gene di tempo specifico utilizzando sistemi di binari come il sistema Gal4-UAS 39. l'efficienza del RNAi in questa fase si apre così la possibilità di eseguire su larga scala (o anche imparziale genoma) RNAi schermi per cercare nuovi giocatori coinvolti nella riparazione della ferita o comportamento delle cellule infiammatorie.
Tuttavia, Drosophila pupe chiaramente non possono essere utilizzati per studiare i fenotipi risultanti da mutazioni genetiche che sono embrionali letali; studi funzionali e live-imaging di geni che sono essenziali per lo sviluppo embrionale quindi ancora devono essere eseguiti in embrioni, a meno che atterramento di RNAi-mediata del gene in un tempo o in modo tessuto-specifico consente lo sviluppo di verificare attraverso fasi pupal. L'embrione rimane anche il modello di scelta per lo studio e live-immagine determinate caratteristiche di comportamento delle cellule immuni, compreso la dispersione inerente allo sviluppo delle cellule immuni dalla loro origine, inibizione da contatto di locomozione e la fagocitosi dei corpi apoptotici generato durante inerente allo sviluppo del tessuto scolpire5,8 , che non sono ancora state osservate nei modelli pupal. Anche se gli studi in adulti e larve di Drosophila hanno fornito un'importante comprensione dei meccanismi alla base della ferita riparazione e infiammazione40,41,42,43, 44 live-formazione immagine studia in queste fasi hanno dimostrato difficile dovuto la natura intrinsecamente mobile dei campioni. Mentre le larve possono essere anestetizzate per consentire brevi periodi di vivere-imaging, dovuto la natura temporanea dell'anestesia, ripristino solo brevi istantanee della ferita diretta o risposta infiammatoria può essere visualizzato in quel momento45. Un recente studio ha sviluppato un protocollo migliorato che consente a più lungo termine imaging di cicatrizzazione larvale46, anche se la preparazione e formazione immagine ancora rimangono notevolmente più impegnativo che in embrioni o pupe. A lungo termine, noi immaginiamo che utilizzando lo stadio di sviluppo più appropriato per affrontare ogni questione specifica, studi in tutti e quattro di queste diverse fasi di Drosophila - da embrioni attraverso periodi di larvali e pupe all'età adulta (ognuno con i loro unici vantaggi e limitazioni) - fornirà complementari intuizioni il meccanismo molecolare e cellulare guida riparazione arrotolata e l'infiammazione.
In futuro, questo protocollo per ferimento e l'imaging a lungo termine di Drosophila pupe può essere facilmente adattato per studiare una gamma di fenomeni in relazione con l'infiammazione e ha vasta portata potenziale per scoprire caratteristiche novelle della risposta infiammatoria della ferita. La combinazione di imaging a lungo termine, unitamente alla domanda di fluorofori fotoconvertibile (ad esempio di Kaede), sono di grande valore per comprendere le dinamiche del comportamento delle cellule immuni innate e, in particolare, lontano meno capito fase di risoluzione di la risposta infiammatoria della ferita. Identificando in particolare individuo o sottopopolazioni di cellule immunitarie (ad esempio quelli reclutati per una ferita) sarà possibile analizzare come l'esposizione a una stecca ambientale (ad esempio un cadavere o lesioni) colpisce la successiva risposta immunitaria della cella a una versione successiva Cue. Il comportamento infiammatorio di Drosophila emociti può essere alterato da precedenti esperienze - per esempio, essi sono pronti a rispondere alla lesione del tessuto dalla precedente fagocitosi dei corpi apoptotici durante sviluppo12 ma rimane essere visto Se altri stimoli ambientali inducono eventi simili di adescamento. Anche se studi di pupale ferite finora si sono concentrati sulla risposta infiammatoria innata, il modello di pupal ala inoltre fornisce l'occasione ideale per entrambi immagine live e sezionare i meccanismi che sottendono la riparazione arrotolata epiteliale. Inoltre, questo metodo di imaging pupal potrebbe essere adattato anche per studiare il comportamento dinamico di altri lignaggi di cellule in risposta a tessuto danni38, nell'ala pupal stesso o altri tessuti pupal facilmente accessibile (ad esempio, occhi, gambe e torace). Infine, combinando la trattabilità genetica della drosofila insieme con la facilità di lungo periodo pupale imaging, romanzo riparazione epiteliale o regolatori infiammatori potrebbero essere scoperti attraverso l'applicazione di imparziale genoma knock-down si avvicina.

Una risposta infiammatoria efficiente ed efficace è fondamentale per qualsiasi organismo a combattere le infezioni, rimuovere i detriti e orchestrare la riparazione dei tessuti danneggiati1. Anche se questa risposta è un risultato inevitabile della maggior parte dei danni ai tessuti, infiammazione richiede una regolamentazione rigorosa perché un'inappropriata risposta infiammatoria è stata collegata ad una varietà di diverse malattie umane (compreso le ferite croniche che non guariscono, cicatrizzazione eccessiva e predisposizione al cancro)1,2,3. Data la rilevanza clinica, è cruciale ottenere una comprensione più dettagliata dei meccanismi molecolari e cellulari Guida la risposta infiammatoria al fine di sviluppare nuovi indicatori prognostici e strategie per trattare una gamma di cronica infiammatoria condizioni, che potrebbero proteggere riparazione tessuti da infiammazione prolungata e inutile.
Negli ultimi anni, Drosophila è diventato un sistema di modello ben consolidata e prezioso per sezionare le caratteristiche fondamentali della risposta infiammatoria conservate dagli insetti all'umano4,5. Allo stato attuale, Drosophila offre trattabilità genetica molto maggiore di quanto sia attualmente possibile in altri modelli sperimentali (come topi o Danio rerio), permettendo preciso spazio-temporali manipolazione genetica in vivo (per inattivare o sovraesprimere qualsiasi gene di interesse all'interno di tipi cellulari specifici in un determinato tempo-punto inerente allo sviluppo) e facilità di genoma schermi6,7. Tradizionalmente, la maggior parte live-imaging di guarigione della ferita e l'infiammazione in Drosophila sono stati condotti alle fasi embrionali, come embrioni sono immobili (a differenza della drosofila larve o adulti) e otticamente trasparente che consente ad alta risoluzione senza pari in vivo imaging8. Questo ha permesso ai ricercatori di visualizzare il reclutamento rapido e robusto di cellule immuni innate di Drosophila (emociti) al sito della ferita in risposta al danno meccanico o indotta da laser al epitelio embrionale9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. combinando questi studi di formazione immagine live con la manipolazione genetica, studi in embrioni di Drosophila hanno scoperto molte proteine importanti delle cellule immuni che controllano la cellula infiammatoria comportamento in vivo. Ad esempio, è stato identificato l'omologo di CED-1 Draper (una ITAM dominio contenenti proteine) come un importante 'recettore i danni' che media le cellule immunitarie di Drosophila di reclutamento in un H2O2-modo dipendente ai siti di danni15. Livelli di Draper all'interno delle cellule immuni sono regolati a sua volta indotta da calcio segnalazione JNK e elevato a valle di apoptotic cadavere assorbimento12. Motilità di emociti ulteriormente richiede complessi cambiamenti citoscheletrici di coordinare la migrazione diretto verso la ferita e questo dipende l'attività dei regolatori del citoscheletro come fascina proteina actina-impacchettato16 e la famiglia di Rho piccola GTPasi Rac e Rho9.
Drosophila è un insetto olometaboli che passa attraverso le fasi larvali e pupale ulteriori seguendo l'embriogenesi, prima di raggiungere l'età adulta17. La pupa di Drosophila è stata sviluppata come un ulteriore modello per vivere-imaging non-invasivo di una varietà di eventi cellulari dinamici, tra cui developmental cell migrazione18, divisione cellulare19, cella crescita20e muscolo contrazione21. Più recentemente, si è stabilito come un modello di romanzo in cui studiare la dinamica di ferita riparazione e infiammazione in vivo22,23.
Proprio come in fasi embrionali, Drosophila pupe sono immobili e otticamente traslucido, dopo dissezione accurata da loro casi pupal opaco18. Sfruttando questa trasparenza ottica, si può seguire il comportamento in vivo di cellule dell'immunità innata (emociti) in risposta al danno del tessuto all'interno dei tessuti pupal Drosophila , ad esempio l' ala pupal22. L'ala pupal esiste come una semplice struttura bilayered, composto da due grandi lastre piatte epiteliali connessi intorno alla periferia di ala; lo spazio extracellulare tra questi due strati epiteliali è riempito con l'emolinfa (insetto sangue) e un gran numero di emociti motili24. Proprio come embrioni, lesioni meccaniche o indotta da laser all'epitelio ala innesca un rapido reclutamento di emociti alla ferita sito23. Tuttavia, questa fase pupal offre alcuni vantaggi distinti per l'imaging nel corso di precedenti fasi embrionali. Pupe feriti possono essere imaged in periodi di tempo molto più lungo (per almeno 5 ore), più area di tessuto è disponibile per la perturbazione sperimentale (ad esempio di generazione di ferite multiple) e ci sono un numero significativamente maggiore di emociti presente a questa fase ( fornendo più traiettorie di cella da distanze maggiori per una migliore potenza statistica durante l'analisi matematica). Inoltre, l'efficienza di inattivazione del gene di RNAi-mediata è notevolmente migliorata in fasi pupal, permettendo molti geni a essere 'abbattuto' in un tessuto o il modo di tempo specifico rispetto al più tradizionale approccio complesso mutante degli embrioni.
Al fine di seguire la dinamica di riepitelizzazione della ferita e la risposta infiammatoria di accompagnamento all'interno di questo nuovo modello pupal, due popolazioni differenti delle cellule devono essere etichettate: l'epitelio pupal e le cellule dell'immunità innata (Drosophila emociti). Un numero di differenti marcatori (Tabella materiali) è disponibile per etichettare queste due popolazioni differenti delle cellule - la scelta del segno dipende dal particolare processo per essere studiato. Per contrassegnare l'epitelio pupal, Drosophila righe contenenti sia un'espressa ubiquitariamente GFP-etichettato E-caderina (che etichetta le giunzioni intermedie) sono ordinariamente utilizzato per indicare le posizioni dei margini delle celle, o in alternativa, un GFP-etichettato Dominio di legare l'actina di moesina (che le etichette del citoscheletro di actina) per visualizzare le sporgenze di anello e all'avanguardia di ferita-bordo contrattili actina. Per etichettare la drosofila emociti, un emociti specifiche srp-Gal425 all'espressione di unità di nucleare RFP (per rilevamento nucleare), citoplasmatico GFP o GFP-etichettato moesina (per etichettare il citoplasma o actina citoscheletrica, rispettivamente) o un fotoconvertibile fluoroforo (ad esempio di Kaede) vengono utilizzati. Infatti, spesso è vantaggioso utilizzare più marcatori delle cellule immuni in combinazione, per abilitare l'analisi simultanea del movimento nucleare e la morfologia delle cellule (Vedi risultati rappresentativi). Tuttavia, poiché questo protocollo prevede l'utilizzo di Drosophila pupe, solo combinazioni di marcatori genetici che sono vitali fino a metà-pupal fasi possono essere utilizzati. Inoltre, scorte letale embrionale non sarà adatte. Questo è improbabile che sia un problema quando la formazione immagine di controllo (o wild type) pupe ma è importante considerare quando i geni sono per essere abbattuto o iperespresso, per valutare il loro effetto sulla chiusura della ferita o l'infiammazione. Nel caso di letalità precoce causata da gene atterramento (o sovraespressione), un Gal80ts costrutto può essere utilizzato per indurre l'atterramento Gal4-driven più avanti in sviluppo (vedi discussione).
Nei nostri studi recenti, si spostano in fase di pupa ci ha permesso di raccogliere dati di traiettoria delle cellule immuni sufficienti per analizzare il comportamento infiammatorio utilizzando sofisticati modelli matematici, che a sua volta ha permesso di dedurre nuovi dettagli della ferita attractant infiammatoria segnali23. Ad esempio, questo approccio ha rivelato che il chemoattractant ferita si diffonde lentamente attraverso il tessuto infiammato a 200 μm2/min, un tasso molto più lento di quanto precedentemente proposto piccole molecole come ATP o H2O2 sono segnalati per diffuso il26,27,28,29; Queste molecole di piccoli "danni" rischiano invece di agire come segnali permissivi. Inoltre, seguendo il comportamento a lungo termine delle cellule dell'immunità innata che risolvere lontano da una ferita iniziale e sono esposti a un secondo (fatto timepoints vari dopo il primo), abbiamo scoperto un periodo temporaneo 'desensibilizzazione' durante il quale le cellule immunitarie sono ciechi a lesioni successive23. Sfruttando le potenzialità di imaging a lungo termine del modello pupal, insieme a trattabilità genetica di Drosophila , si può seguire il comportamento delle popolazioni delle cellule immuni specifiche (ad esempio solo quelle cellule immunitarie reclutati al sito della ferita) in risposta agli insulti successivi, usando il fotoconvertibile fluoroforo30 che può essere espresso esclusivamente all'interno delle cellule immuni lignaggio23.
Qui descriviamo un protocollo per visualizzare le dinamiche di riparazione della ferita e la risposta infiammatoria associata ad alta risoluzione spazio-temporale utilizzando vivente delle crisalidi della drosofila . Forniamo una dettagliata metodologia per coprire i passaggi necessari per la preparazione di pupe iniziale (dissezione e montaggio) e il ferimento di laser-mediata successive e l'imaging di time-lapse. Inoltre descriviamo l'uso di foto-convertible fluorofori per consentire l'etichettatura dei sottoinsiemi delle cellule immuni specifiche in vivo. A lungo termine, prevediamo che questo nuovo modello di Drosophila pupal si apre interessanti possibilità per la dissezione le complesse dinamiche di segnalazione sottostante la risposta infiammatoria al danno tissutale. Applicando più sofisticate analisi statistiche uno potrebbe scoprire caratteristiche della risposta che altrimenti rimarrebbero sperimentalmente inaccessibile, mentre la migliorata efficienza di RNAi potrebbe prestarsi all'applicazione dello screening genoma all'interno cellule del sistema immunitario in vivo per identificare nuovi giocatori che regolano il comportamento delle cellule immuni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitous GFP-tagged E-cadherin 
			;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)</td>
			<td>Kyoto Stock Center, DGRC</td>
			<td>#109007</td>
			<td>Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitous GFP-tagged E-cadherin 
			;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td>
			<td>#58742</td>
			<td>Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ubiquitous GFP-tagged Moesin 
			P{sGMCA}3.1</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td>
			<td>#59023</td>
			<td>The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocyte specific serpent-Gal4 driver 
			;srp-Gal4;</td>
			<td>Generated by Katja Bruckner</td>
			<td>Generated by Katja Bruckner</td>
			<td>Expression of Scer\GAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Br&#252;ckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., R&#248;rth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73&#8211;84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-nuclearRFP 
			w1118;;P{UAS-RedStinger}6</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td>
			<td>#8545 or #8547</td>
			<td>UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-cytoplasmicGFP 
			;;P{UAS-GFP.S65T}</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td>
			<td>Multiple stocks available (e.g. #1522)</td>
			<td>Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-photoconvertibleKaede 
			w1118;; P{UAS-Kaede.A}3</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td>
			<td>#26161</td>
			<td>Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-tagged spaghetti squash 
			w1118;;P{sqh-GFP.RLC}</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td>
			<td>#57145</td>
			<td>The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:Avic\GFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingredients for fly food media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maize</td>
			<td>Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)</td>
			<td>Contact supplier direct</td>
			<td>organic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soya flour</td>
			<td>Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)</td>
			<td>Contact supplier direct</td>
			<td>organic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malt extract</td>
			<td>Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)</td>
			<td>Contact supplier direct</td>
			<td>organic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molasses</td>
			<td>Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)</td>
			<td>Contact supplier direct</td>
			<td>organic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco agar</td>
			<td>BD Biosciences, Fisher Scientific</td>
			<td>DF0142-15-2</td>
			<td>For preparation of fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402907</td>
			<td>For preparation of fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nipagen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79721</td>
			<td>For preparation of fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dried baker&#39;s yeast</td>
			<td>Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD</td>
			<td>Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD</td>
			<td>For preparation of fly food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample preparation and mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>For preparation of heptane glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush</td>
			<td>Daler-Rowney (or equivalent)</td>
			<td>#0 or 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific (or Fine Science Tools)</td>
			<td>NC9404145</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottomed dishes for imaging</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51730-5ML</td>
			<td>For preparation of heptane glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided sticky tape (e.g. Scotch)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG263</td>
			<td>For preparation of heptane glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tube (for heptane glue)</td>
			<td>Falcon tubes from Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For preparation of heptane glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGL4244</td>
			<td>For dissection of Drosophila pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereo microscope with brightfield</td>
			<td>Leica (or equivalent)</td>
			<td>M50</td>
			<td>For dissection of Drosophila pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>John Weiss International</td>
			<td>103123</td>
			<td>Miniature Research Scissors (straight)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser ablation and imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitogen ablation laser</td>
			<td>Spectra-Physics (or Andor equivalent)</td>
			<td>Model VSL-337ND-S</td>
			<td>For wounding, this should be attached to a widefield imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM)</td>
			<td>Leica (or equivalent)</td>
			<td>TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent)</td>
			<td>Ideally including a motorised stage for multi-site and &#39;mosaic&#39; scanning, plus &#8216;hybrid&#8217; GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (or equivalent)</td>
			<td>&#34;Microscope Temperature Control System&#34;</td>
			<td>Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRAP software module</td>
			<td>Leica (or equivalent)</td>
			<td>CLSM FRAP software module</td>
			<td>For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (image analysis software)</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. &#34;NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis&#34;. Nature Methods 9, 671-675, 2012.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ plugin &#34;Manual Tracking&#34;</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>https://imagej.net/Manual_Tracking</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ plugin &#34;TrackMate&#34;</td>
			<td>ImageJ, NIH</td>
			<td>https://imagej.net/TrackMate</td>
			<td>Tinevez, JY.; Perry, N. &#38; Schindelin, J. et al. (2016), &#34;TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.&#34;, Methods 115: 80-90, PMID 27713081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity (high performance 3D imaging software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS (image analysis software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS for Cell Biologists</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term in vivo tracking of inflammatory cell dynamics within drosophila pupae

Durante la rapida risposta infiammatoria al danno tissutale, le cellule del sistema immunitario innato sono rapidamente reclutate nel sito di lesione. Una volta la ferita, cellule immuni innate eseguono una serie di funzioni essenziali, come combattere le infezioni, rimozione dei detriti necrotici e stimolando la deposizione di matrice. Al fine di comprendere meglio i diversi eventi di segnalazione che regolano la risposta immunitaria, è fondamentale per osservare i comportamenti complessi di (e le interazioni che avvengono tra) multiple delle cellule lignaggi in vivo e in tempo reale, con l'alta risoluzione spazio-temporale. La traslucidità ottica e la trattabilità genetica degli embrioni di Drosophila hanno stabilito la Drosophila come un prezioso modello di immagine live e dissezionare aspetti fondamentali del comportamento delle cellule infiammatorie, compresi i meccanismi di dispersione inerente allo sviluppo, liquidazione dei corpi apoptotici e/o patogeni microbici e reclutamento per le ferite. Tuttavia, lavoro più recente ha ora dimostrato che impiegando una fase molto successiva del ciclo di vita di Drosophila – la pupa di Drosophila – offre una serie di vantaggi, tra cui il miglioramento dell'efficienza di RNAi, più lungo periodi, di imaging e significativamente maggiori numeri delle cellule immuni. Qui descriviamo un protocollo per imaging riparazione della ferita e la risposta infiammatoria associata presso l'alta risoluzione spazio-temporale in diretta della drosofila pupe. Per seguire la dinamica di riepitelizzazione e di infiammazione, utilizziamo una serie di specifici in vivo marcatori fluorescenti per l'epitelio e cellule dell'immunità innata. Inoltre dimostriamo l'efficacia della foto-convertible fluorofori, quali Kaede, per seguire i sottoinsiemi delle cellule immuni specifiche, per monitorare il loro comportamento durante la loro migrazione e risolvere da, il sito di lesione.

Questo protocollo descrive la preparazione di Drosophila pupe per time-lapse live imaging ferita riparazione e infiammazione in vivo. Utilizzando questo metodo, dovrebbe essere possibile generare più filmati ad alta definizione della chiusura della ferita pupal e reclutamento di cellule infiammatorie con facilità e le pupe per lunghi periodi di tempo (almeno 5 h) Post-ferendo senza significativi photobleaching di immagine.
Uno schema generale per la preparazione di pupa di Drosophila 
La figura 1 illustra il metodo ottimale per la preparazione delle crisalidi della drosofila per in vivo imaging. Drosophila bianchi 'membranose' sono raccolti direttamente presso '0 h' dopo formazione pupario (APF), come le larve striscianti cessano motilità e adottano la forma pupal stereotipata con estroflesso respirazione appendici (spiracoli) visibili alla loro estremità anteriore più ( Figura 1A). Il bianco h 0 membranose APF sono permesso di sviluppare per 18 h a 25 ° C, dal momento che il pupario è diventato marrone (Figura 1B) e sono quindi sezionato utilizzando una pinzetta e/o microforbici (Figura 1, per rimuovere la custodia protettiva pupal) per rivelare il otticamente traslucido pupa all'interno (Figura 1). A seguito di dissezione, le ali pupale saranno visibili sui lati del torace pupa (evidenziato in blu, Figura 1-D). In questa fase, altre parti del corpo pupal sono anche facilmente individuabili, inclusi gli occhi, gambe e addome (etichettato in Figura 1). Le gambe sono adatte anche per studi di infiammazione della ferita e possono essere ferite utilizzando lo stesso metodo laser descritto sopra. H 18 più pupe APF possono essere installati simultaneamente all'interno il piatto imaging (Figura 1E, utilizzando un filtro di carta impregnati d'acqua ed eptano colla per minimizzare la disidratazione) con la parte piatta dell'ala (contorno blu) a contatto con il vetrino coprioggetti ( Figura 1F); Questo è particolarmente vantaggioso se il microscopio imaging è dotato di un tavolino motorizzato per consentire diversi pupe da registrare durante l'un periodo di formazione immagine singolo. Devono essere eliminate qualsiasi pupe che sono stati danneggiati durante la dissezione o montaggio (ad es. la pupa si trova terzo nella sequenza, freccia in Figura 1E). Altre parti del corpo (ad es. occhi e gambe, profilato rosa) possono anche contattare il vetrino coprioggetto e sono disponibili per ferire e successivi di formazione immagine (Figura 1,F). Per esperimenti studiando singole ferite, danni indotti da laser sono generalmente meglio inflitto centralmente nell'ala (asterisco, Figura 1F), anche altre località può essere usato se ferite multiple devono essere studiati.
Ferendo sterile attiva una risposta infiammatoria robusta nell'ala pupal Drosophila 
Per seguire la riparazione della ferita e l'accompagnamento risposta infiammatoria in vivo le ali ferite di pupe APF Drosophila 18h erano imaged usando la microscopia confocal di time-lapse (Figura 2A-H). In questa fase pupal, gli epiteli di ala sono semplici lastre piane delle cellule (denominate qui usando GFP-etichettato E-caderina per segnare i confini delle singole celle, margine ala descritta nella Figura 2A). Anche nelle umiliazioni Ali (basso ingrandimento, figure 2A e 2A'), un numero elevato di cellule immuni innate migratori (emociti, associata all'etichetta srp-Gal4 guidato citoplasmico GFP, verde e nucleare RFP, magenta) si trovata all'interno del (emolinfa sangue dell'insetto) che occupa lo spazio extracellulare intermedio (Figura 2A e 2A'). Lesione indotta da laser all'epitelio pupal ala (margine di ferita in bianco, Figura 2B-D) stimola una rapida migrazione di emociti al sito della ferita (fig. 2B-D e i nuclei delle cellule immuni in Figura 2B '-D'). Etichettatura emociti con entrambi un marcatore nucleare (ad es. il nucleare RFP 'rosso-stinger') in combinazione con un pennarello citoplasmatico o del citoscheletro (es. citoplasmatica GFP o GFP-etichettato moesina) è particolarmente vantaggioso in quanto consente la rilevamento simultaneo di emociti nuclei (per l'analisi automatizzata di emociti comportamento ad es. velocità di migrazione e direzionalità) e la visualizzazione della morfologia di emociti. Quest'ultimo è importante in quanto permette di determinare se emociti sono phagocytosing residui necrotici (Figura 2, da incasso) al bordo della ferita (o microbi in caso di infezione)12,23 e ci permette anche di seguire loro comportamento protrusiva come si estende bene filopodi o lamellipodi al loro bordo di attacco durante la loro migrazione verso o dalla ferita.
Semplice monitoraggio delle traiettorie nucleare emociti utilizzando appropriati Image Analysis software32 (Tabella materiali) illustra le complesse dinamiche spazio-temporali della risposta infiammatoria, simile a quella riportata in precedenza per ferito embrioni9,36 (tracce multi-colore, Figura 2' e D'). All'interno di soli 30 min di ferimento, emociti situati più vicino al sito di lesione iniziano la migrazione diretto verso la ferita (Figura 2'). Tuttavia, con l'aumento di alberino-ferita tempo, emociti trova progressivamente ulteriormente lontano dal sito di lesione anche iniziano diretto migrazione verso la ferita (Figura 2D'). In questo modo, si è osservata una 'onda' della risposta delle cellule immuni che si diffonde verso l'esterno dal bordo della ferita, che immaginiamo per riflettere la diffusione della ferita chemoattractant lontano dal sito di lesione. Queste dinamiche spazio-temporali delle cellule immuni fornito un utile punto di partenza per il nostro studio recente quello impiegato sofisticate analisi ('inferenza bayesiana') di modellazione matematica per dedurre nuove proprietà del segnale attractant ferita (metodi dettagliati Pubblicato in23). Calibrando i nostri modelli computazionali (che collegava il gradiente attractant ferita alla parzialità di emociti) per adattare le traiettorie immunitaria osservata in vivo , uno potrebbe estrarre caratteristiche dettagliate di attractant la ferita dalla nostra traiettoria di emociti dati (ad esempio, il tasso di diffusione del segnale, l'origine e la durata della produzione del segnale)23.
Inoltre, percorrendo in espressione del fluoroforo fotoconvertibile Kaede all'interno della stirpe delle cellule immuni utilizzando srp-Gal4 (verde, Figura 2E) siamo stati anche in grado di selettivamente etichettare una sottopopolazione di questi emociti migratori ala (come ad esempio quelli reclutati al sito della ferita; E, prima di fotoconversione UV-indotta e F, post-fotoconversione). Possiamo quindi seguire il comportamento di questi emociti nel tempo (magenta, Figura 2-H) come risolvere dal sito della ferita (frecce, Figura 2 e H) e confrontare come il loro comportamento è diverso da quelli non-photoconverted cellule che non raggiungono il sito di lesione. Abbiamo usato questo in vivo di etichettatura tecnica per dimostrare che emociti reclutati per un iniziale della ferita sono temporaneamente insensibili a una seconda ferita generata 90 minuti più tardi23, anche se questa tecnica di etichettatura differenziale potrebbe anche avere molte altre applicazioni penetranti in futuro (vedi discussione).
Utilizzando questo approccio, anche contemporaneamente possiamo seguire le dinamiche spazio-temporali della riparazione arrotolata o stai-riepitelizzazione ' (Figura 2B-D). Qui espressa ubiquitariamente GFP-etichettato E-cadherin etichette le giunzioni intermedie cellulare in tutto l'epitelio di ala e consente le forme di singole cellule epiteliali da seguire nel corso del tempo. Il bordo della ferita è facilmente identificabile come la giunzione tra cellule epiteliali GFP-etichettato intatte e detriti senza etichetta (linea tratteggiata bianca, Figura 2B-D). Per la maggior parte delle ferite, la ferita comincia a ri-epithelialize entro 1 h della ferita e la ferita bordo progressi verso l'interno (Figura 2D); le ferite di questa dimensione guarirà in genere entro 2-3 h di lesioni23. La chiusura della ferita in embrioni e pupe è guidata da un cavo contrattile di actomiosina insieme all'avanguardia ricco di actina filopodi23,37; queste dinamiche del citoscheletro possono essere direttamente visualizzate durante la riparazione della ferita usando appropriati in vivo ai giornalisti, come GFP-etichettato Spaghetti squash (regolamentazione catena leggera della miosina) o23, GFP-etichettato leganti l'actina, Moesin. Per alcune ferite particolarmente grande, tuttavia, il cavo di actomiosina e avanguardia filopodi non persistono - queste ferite diventano 'croniche' e mai completamente ri-epithelialize23 anche dopo periodi più lunghi (oltre 24 ore) di in vivo di imaging. Interessante, la risposta infiammatoria connessa con queste ferite non guariscono è nettamente diversa da quello connesso con le ferite acute normale23 suggerendo che comportamento anormale delle cellule immuni potrebbe essere un utile indicatore prognostico nella clinica . In futuro, ulteriori analisi in vivo delle lesioni croniche usando la formazione immagine a lungo termine (oltre 24 h) nel modello pupal potrebbe fornire importanti informazioni mecanicistiche questo stato debilitante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig1.jpg"> Figura 1: Preparazione di pupa della drosofila per vivere-formazione immagine e ferendo. (A) Drosophila membranose bianchi raccolti a 0 h APF, con estremità anteriore indicato da estroflesso respirazione appendici (spiracoli). (B) dopo l'innalzamento membranose APF bianco 0 h per 18 h a 25 ° C, il pupario appare marrone. Dissezione del caso pupal dovrebbe iniziare con la regione anteriore più (freccia), indicata dagli spiracoli estroflesso come la pupa corretta è assente da questa regione e una pinzetta e/o microforbici utilizzato per rimuovere la custodia protettiva pupa (C). Le ali pupale saranno visibili sui lati del torace pupa (contorni blu). (D) caso Pupal completamente rimosso dalle 18h pupa APF, qui la pupa è stata rotolata 90 ° per mostrare il lato laterale, con l'ala essere imaged evidenziato in blu. (E-F) Cinque pupe APF 18h montato su vetrino coprioggetti in imaging piatto utilizzando colla eptano, con carta da filtro impregnati d'acqua per ridurre al minimo la disidratazione (E). Pupa si trova terzo nella sequenza (freccia) dovrebbe essere scartato perché danno si è verificato durante la preparazione. Pupe sono montati con la parte piatta dell'ala (contorno blu) a contatto con il vetrino coprioggetti (F) e indotta da laser ferite vengono generate centralmente nell'ala (asterisco, F), anche se altre posizioni possono essere utilizzati se sono ferite multiple per essere studiato. L'immagine in (D) adattato con permesso da tessitori et al., 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig2.jpg"> Figura 2: Dinamica in vivo l'analisi della risposta infiammatoria al danno tissutale. Pupe sezionato da Custodie protettive pupale e montato su vetrino coprioggetti (A) sono feriti e successivamente ripreso usando la microscopia confocal di time-lapse (B-H). Visualizza ingrandimento dell'ala pupal illesi a basso (A, margine di ala in bianco) che contiene un numero elevato di emociti migratori (A'). Lesione indotta da laser all'epitelio pupal ala (B-D, bordi della cella etichettati usando GFP-etichettato Drosophila E-caderina; ferita margine indicato in bianco) attiva una risposta infiammatoria rapida con la migrazione di emociti multiple ( SRP-Gal4 guidato espressione di nucleare RFP, magenta e citoplasmico GFP, verde) verso il sito della ferita (B-D; rappresentante fotogrammi da un filmato time-lapse in cui ogni fotogramma è una proiezione di 25 fette 3 μm ogni). Manuale rilevamento delle traiettorie di emociti (tracce multi-colore, C' e D') indicano le complesse dinamiche spazio-temporali della risposta infiammatoria, simile a quella segnalata per embrioni feriti. Emociti fagocitare anche residui necrotici cellulari presso il sito della ferita (punta di freccia, C e anche da incasso). Espressione del fluoroforo fotoconvertibile Kaede nel lineage delle cellule immuni (verde, E, utilizzando srp-Gal4) consente ferita-reclutato emociti (freccia, E) essere differenzialmente etichettato (magenta, F) e seguiti nel corso del tempo come si risolvono dal sito di lesione (frecce, G e H). Sono stati utilizzati i seguenti genotipi pupal: (A-D) w1118; ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) e (E-H), w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Immagini adattati con permesso da tessitori et al., 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Qui presentiamo un protocollo per la riparazione della ferita di vivere-imaging e la risposta infiammatoria associata al alta risoluzione spazio-temporale in vivo. Questo metodo utilizza la fase pupal dello sviluppo della drosofila per consentire a lungo termine di imaging e di monitoraggio delle popolazioni di cellule specifiche nel tempo ed è compatibile con inattivazione del gene di RNAi-mediata efficiente.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

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