Name: culture and transfection of zebrafish primary cells
Uploaded: 2018-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells at JoVE.com

Мы благодарим т. Фрич, а. волк-Asseburg, I. Linde и с.-М. Токарски отличный уход за животными и технической поддержки. Мы признательны всем членам Köster лаборатории для интенсивной и полезной дискуссии. Мы с благодарностью признаем, финансирование Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) и федеральной земли Нижняя Саксония, Нижнесаксонская Vorab (VWZN2889).

Все животные описанные здесь ведется в соответствии с правовыми нормами (ЕС-Директива 2010/63). Обслуживание и обработка рыбы утвержден местными властями и животных представитель технический университет Брауншвейга и Нижней Саксонии государственного управления защиты прав потребителе?...

<ol>
	<li>Ablain, J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+fish+and+men:+using+zebrafish+to+fight+human+diseases.">Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases.</a> Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).</li><li>K&#246;ster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).</li><li>Driever, W., Rangini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+cell+line+derived+from+zebrafish+(Brachydanio+rerio)+embryos.">Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).</li><li>Badakov, R., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+primary+zebrafish+fibroblasts+by+nucleofection.">Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection.</a> Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).</li><li>Senghaas, N., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+and+transfecting+zebrafish+PAC2+fibroblast+cells.">Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017)</li><li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD.">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes &amp; Development. 8, 1311-1323 (1994).</li><li>Piperno, G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+specific+for+an+acetylated+form+of+alpha-tubulin+recognize+the+antigen+in+cilia+and+flagella+from+a+variety+of+organisms.">Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).</li><li>Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+phalloidin+and+nucleotide-binding+sites+on+actin.">Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin.</a> European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+a+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Stornaiuolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KDEL+and+KKXX+retrieval+signals+appended+to+the+same+reporter+protein+determine+different+trafficking+between+endoplasmic+reticulum,+intermediate+compartment,+and+Golgi+complex.">KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).</li><li>Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+proteins+to+mitochondria.">Targeting of proteins to mitochondria.</a> FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).</li><li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., D&#252;bel, S., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+zebrafish+primary+cell+culture+for+transfection+and+live+cellular+and+subcellular+imaging.">Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging.</a> Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).</li><li>Horesh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doublecortin,+a+stabilizer+of+microtubules.">Doublecortin, a stabilizer of microtubules.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+neither+persistently+leads+migration+nor+determines+the+site+of+axonogenesis+in+migrating+neurons+in+vivo.">The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).</li><li>Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+dynamics+inside+cells+using+a+rationally+designed+photoconvertible+protein.">Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein.</a> Nature Methods. 5, 339-345 (2008).</li><li>Archer, B. T., Oz&#231;elik, T., Jahn, R., Francke, U., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+chromosomal+localizations+of+two+human+genes+encoding+synaptobrevins+1+and+2.">Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).</li><li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications.">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10, 407-409 (2013).</li><li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).</li><li>Peri, F., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo.">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133, 916-927 (2008).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132, 5069-5079 (2005).</li><li>Jusuf, P. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+expressed+transiently+in+all+types+of+amacrine+cells+in+the+embryonic+zebrafish+retina.">Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina.</a> Neural Development. 4, 34 (2009).</li><li>Kani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proneural+gene-linked+neurogenesis+in+zebrafish+cerebellum.">Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum.</a> Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).</li><li>Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+cell+lines+from+zebrafish+embryos+and+tumors.">Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors.</a> Zebrafish. 10, 316-332 (2013).</li></ol>

Здесь мы представляем две различные протоколы культуры клетки первичной от 2 dpf zebrafish эмбриона или взрослых рыбок данио мозга.
Подготовка первичного клеточных культур от 2 dpf данио рерио сравнительно легко выполнять для тех, кто с опытом работы в основные клеточные культу?...

Данио рерио (данио рерио, D. рерио) — популярная модель позвоночных для многочисленных областей фундаментальных и биомедицинских исследований1. Данио рерио эмбрионы быстро развиваться ex внутриутробно, прозрачным, и подходят под микроскопом, таким образом обеспечивая отличные предпосылки для изучения развития позвоночных в живом организме. Из-за генетических уступчивость данио рерио2были созданы многие стабильной репортер трансгенных линий с выражение определенного типа клеток различных флуоресцентных маркеров, что позволяет для наблюдения за конкретными клеточных популяций. Данио рерио сообщество предлагает целый ряд так называемых Gal4-водитель линий, которые несут трансген, выражая синтетических Kal4TA4 (или KalTA3-эквивалент GalFF) гена с доменом Gal4-ДНК связывающих дрожжей сливается с вирусной transcriptional активации домены под контролем усилители определенного типа клеток. Эти линии драйвер пересечены эффекторных линий, которые осуществляют трансгенов, состоящий из определенной последовательности вверх по течению активация (УАС) сливается с Репортер ген. Kal4TA4 протеин связывает к элементу UAS, тем самым активизируя ячейки типа селективный выражение Репортер ген3,4. Этот подход позволяет весьма разнообразных комбинаторной исследований почти всех доступных enhancer и репортер элементов в двойной трансгенных животных.
Однако углубленных живых изображений с упором на отдельные ячейки или их субцеллюлярные содержание ограничено в целом и постоянно меняющейся эмбриона. Для решения биологических вопросов конкретных клеток с высоким разрешением, часто предпочтительнее использование клеточных культур. Существуют некоторые клеточных линий данио рерио, но они считаются сильно выбранных5,6,7 и их распространения часто занимает много времени. Кроме того все доступные клеточных линий являются фибробластов производные, ограничивая эксперименты с использованием культуры клеток к одному типу клеток. Таким образом мы установили эффективный и простой в использовании протокола подготовить Главные ячейки непосредственно из zebrafish эмбриона и взрослых рыбок данио мозга, а также подходы для увеличения продолжительности жизни, культуры и расширения разнообразия культивируемых типы клеток. Кроме того мы представляем процедура transfect эмбриональных клеток первичной с конструкциями выражение для флуоресцентных органеллы маркеров. Таким образом клеточной морфологии и внутриклеточных структур могут быть проанализированы с высоким пространственным и временным разрешением в типах различных клеток, которые сохраняют свои основные характеристики.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(ptf1a:eGFP)jh1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(XITubb:DsRed)zf148</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed&#160; (Peri and N&#252;sslein-Volhard, 2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>model 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>model SP8, equipped with 28 &#176;C temperature box and a 63 x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epifluorescent microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>model DM5500B, equipped with 28 &#176;C temperature box and a 40 x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell with capacitance extender</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652661</td>
			<td>electroporation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>GFL</td>
			<td></td>
			<td>model 3011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator for cell culture (28 &#176;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>model incubator I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator for embryos (28 &#176;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>type B6120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>model TELAVAL 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile work bench</td>
			<td>Bio Base</td>
			<td></td>
			<td>with laminar flow and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>Style 5, Inox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical tube rotator</td>
			<td>Labinco B.V.</td>
			<td></td>
			<td>model LD-79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS-DCX-tdTomato</td>
			<td>K&#246;ster Lab</td>
			<td># 1599</td>
			<td>based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS-eGFP</td>
			<td>K&#246;ster Lab</td>
			<td># 7</td>
			<td>based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS-H2B-mseCFP</td>
			<td>K&#246;ster Lab</td>
			<td># 2379</td>
			<td>based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS-mClover</td>
			<td>K&#246;ster Lab</td>
			<td># 3865</td>
			<td>based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS-MitoTag-YFP</td>
			<td>K&#246;ster Lab</td>
			<td># 2199</td>
			<td>based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS-ss-RFP-KDEL</td>
			<td>K&#246;ster Lab</td>
			<td># 4330</td>
			<td>based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS-VAMP1-mCitrine</td>
			<td>K&#246;ster Lab</td>
			<td># 2291</td>
			<td>based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSK-UAS:mCherry</td>
			<td>K&#246;ster Lab</td>
			<td># 1062</td>
			<td>based on the pBluescript-backbone of Stratagene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid numbers refer to the database entries of the K&#246;ster lab. Plasmids are available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic and glass ware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Cell Strainer (40 &#181;m)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>REF 352340</td>
			<td>distributed by BD Bioscience, used as &#8220;landing net&#8221; to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL reaction tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72690550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falconic tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3924.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrainer (40 &#181;m)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>542 040</td>
			<td>with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporation cuvette (0.4 cm)</td>
			<td>Kisker</td>
			<td>4905022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslips</td>
			<td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td>1051201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel Gl&#228;ser)</td>
			<td>631-0845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Henneberg-Sander GmbH</td>
			<td>9020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (plastic; 3 mL)</td>
			<td>A. Hartenstein</td>
			<td>PP05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473</td>
			<td>for zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Blue (1000 &#181;l): 70762; Yellow (200 &#181;l): 70760002; White (10 &#181;L): 701116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm)</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72690550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0601.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde in 1 x PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol p.a. 100%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat &#945;-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>DOW CORNING</td>
			<td>3826-50</td>
			<td>silicon grease used for self-made glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Serva</td>
			<td>29198.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Poly/Mount (mounting medium)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potasssion chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Roth</td>
			<td>68514-61-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-X Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase (Type 2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td>dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pronase (from Streptomyces griseus)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium and solutions for cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x PBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>distributed by Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>18045054</td>
			<td>distributed by Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtrated bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td></td>
			<td>individual batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine 100 x</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td>distributed by Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>11415049</td>
			<td>distributed by Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep (10,000 units/mL)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140148</td>
			<td>distributed by Thermo Fisher Scientific</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and transfection of zebrafish primary cells

Данио рерио эмбрионов являются прозрачными и быстро развиваются вне матери, что позволяет отлично в vivo визуализации динамических биологических процессов в нетронутыми и развивающихся позвоночных. Однако в целом монтирует ограничено подробных изображений морфологии клеток различных типов и внутриклеточных структур. Таким образом мы создали эффективный и простой в использовании протокола для живых клеток первичной культуре zebrafish эмбриона и взрослых ткани.
Короче говоря 2 dpf zebrafish эмбриона, dechorionated, deyolked, стерилизации и отделить в отдельные ячейки с коллагеназы. После шага фильтрации клетки первичной покрытием на стекла дно блюда и культивировали в течение нескольких дней. Свежих культурах, как долго термин differenciated, может использоваться для высокого разрешения конфокальный изображений исследования. Культура содержит различных типов клеток, с striated миоцитов и нейронов, видные на поли L-лизин покрытие. Чтобы специально внутриклеточных структур label флуоресцентных маркеров белков мы также создали электропорации протокол, который позволяет трансфекции плазмидной ДНК в различных типов клеток, включая нейронов. Таким образом в присутствии оператора определенные стимулы, поведение сложных клеток и внутриклеточных динамики первичных данио рерио клеток может оцениваться с высоким пространственным и временным разрешением. Кроме того с помощью головного мозга взрослых рыбок данио, мы демонстрируем, что описанные диссоциации технику, а также основных условий культивирования, также работать для взрослых рыбок данио ткани.

Рисунок 1 g показывает передачи света изображение типичного культуры, производные от дикого типа эмбрионов с striated миоцитов и кластеры нейроноподобных клеток, наиболее обильные. Для более легко выявить определенные типы клеток, трансгенные линии с выра...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells at JoVE.com

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Мы представляем эффективной и простой в использовании протокола для подготовки начального клеточных культур данио рерио эмбрионов для transfection и живых клеток, а также протокол для подготовки первичной клетки мозга взрослых рыбок данио.

Культура и Transfection клетки первичной данио рерио

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Выделение и культура взрослых данио мозга, полученных из нейросферах

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Первичный энтодермальная эпителиальной клетки культуры из желтка мембраны японского перепела Эмбрионы

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Подготовка и культура Миогенный прогениторных клеток / Первичные миобластов из скелетной мышце взрослых и выдержана Людей

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Изоляции и культуры клеток первичного эпикардиальной, производный от сердца человека взрослых и плода образцов

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...