Name: in vitro rearing of solitary bees: a tool for assessing larval risk factors
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00
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Os autores agradecer Kimball Clark e Tim Krogh para fornecer Osmia aninhamento juncos, Meredith Nesbitt e Molly Bidwell para assistência em laboratório, os Drs Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter e três revisores anônimos para seus comentários úteis que melhorou o manuscrito. Este trabalho foi financiado por fundos de USDA-Agricultural Research Service, que se apropriou (atual Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin, Ministério da agricultura, do comércio e defesa do consumidor (#197199), National Science Foundation (sob N º de Grant Deb-1442148), o centro de pesquisa de bioenergia do DOE grandes lagos (DOE escritório de ciência BER DE-FC02-07ER64494).

1. prepare soluções propiconazol para experimentos de exposição de fungicida
<ol><li>Prepare 0,1 x solução fungicida dissolvendo volumes adequados de propiconazol adquiridos comercialmente 14,3% em água estéril no dia do experimento. Certifique-se de que a única solução recentemente preparada de fungicida é usada para todos os tratamentos.</li>
	<li>Adicione 23 µ l de 0,1 x solução fungicida por grama de provisão de pólen para obter a concentração máxima de propiconazol anteriormente relatado de pó...

Criação de abelhas do lado de fora seus juncos de nidificação naturais, sob condições de laboratório, permite o teste de múltiplas hipóteses relativas à aptidão larval. Na medida em que fatores não identificados continuam a causar mortalidade das abelhas, os estudos de avaliação de risco usando em vitro experiências podem ajudar a identificar ameaças potenciais e informar as práticas de gestão para este grupo de ricos em espécies de polinizadores selvagens 12 ,</s...

Dado o seu papel como o grupo dominante de insetos polinizadores1, a perda global em populações de abelhas é uma ameaça para a segurança alimentar e o ecossistema estabilidade2,3,4,5,6 ,7. As tendências em declínio em ambas as populações de abelhas gerenciado e selvagens têm sido atribuídas a vários factores de risco compartilhados, incluindo fragmentação de habitat, emergentes, parasitas e agentes patogénicos, perda de diversidade genética e a introdução de espécies invasoras3 ,,4,7,8,9,10,11,12. Em particular, o aumento dramático no uso de pesticidas, (por exemplo, neonicotinoides) tem sido diretamente associado a efeitos prejudiciais entre abelhas13,14,15. Vários estudos têm mostrado que o sinergismo entre neonicotinoides e fungicidas de (EBI) inibindo a biossíntese de ergosterol pode levar a alta mortalidade entre múltiplos abelha espécie16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. não obstante, fungicidas, consideradas por muito tempo para ser 'abelha-safe', continuam a ser pulverizado nas culturas no-flor sem muito controlo23. As abelhas operárias foram documentadas para rotineiramente trazer cargas de pólen contaminadas com resíduos de fungicida24,25,26. O consumo de tal fungicida-ladenpollen pode causar alta mortalidade larval abelhas27,28,29,30e um conjunto de efeitos sub-letais entre abelhas adultas16 , 31 , 32 , 33 , 34. um estudo recente sugere que fungicidas podem causar perdas de abelha, alterando a comunidade microbiana na colmeia-armazenado o pólen, rompendo assim, a crítica simbiose entre abelhas e pólen transmitidas por micróbios35.
Embora as abelhas solitárias são vitais para a polinização de diversas plantas silvestres e agrícolas36,37,38, este grupo diverso de polinizadores tem recebido muito menos atenção em estudos de monitoramento de pesticidas. O ninho de uma fêmea solitária adulta contém câmaras ninhadas seladas de 5-10, cada abastecida com uma massa finita de maternalmente coleta de pólen e néctar e um único ovo39. Após a eclosão, as larvas dependem da prestação de pólen alocado e a microbiota associada transmitidas por pólen para obter uma nutrição adequada40,41. Porque eles não possuem os benefícios de um estilo de vida social, as abelhas solitárias podem ser mais vulneráveis à exposição de pesticidas42. Por exemplo, enquanto os défices em abelhas sociais seguindo um spray podem ser compensados para estendem a alguns trabalhadores e novos emergentes, ninhada, a morte de uma única fêmea solitária adulta termina todas as atividade reprodutiva43. Tais diferenças de susceptibilidade destacam a necessidade de incorporar táxons de abelha diversificada em estudos ecotoxicológicos para garantir proteção adequada para as abelhas selvagens e gerenciadas parecidas. No entanto, além de um punhado de estudos, investigações sobre os efeitos da exposição de fungicida tem focado principalmente nas abelhas sociais18,23,32,44,45 ,46,,47,,48,49.
Abelhas solitárias, pertencentes ao gênero Osmia (Figura 1) têm sido utilizadas no mundo inteiro como polinizadores eficientes de vários frutos importantes e porca culturas39,50,,51,53, 53. como com outros polinizadores gerenciado grupos24,54,55,56,57,58, abelhas adultas Osmia são rotineiramente expostos aos fungicidas pulverizadas sobre as culturas em-flor44. Fêmeas adultas forrageamento em culturas recentemente pulverizadas podem coletar e estocar seus aposentos ninhados com fungicida-carregado de pólen, que posteriormente forma a dieta exclusiva para as larvas em desenvolvimento. Consumir as disposições de pólen contaminados posteriormente pode expor as larvas de fungicida resíduos42. O risco de exposição pode ser maior entre espécies de oligolectic que forragem somente em alguns anfitrião estreitamente relacionadas plantas59,60,61. Certos megachilid de abelhas, por exemplo, parecem preferencialmente forragem para o pólen de Asteraceae de baixa qualidade, como um meio de reduzir o parasitismo62. No entanto, a extensão a que fungicidas impacto larval adequação entre abelhas solitárias oligolectic não foi empiricamente quantificada. O objetivo deste estudo é desenvolver um protocolo para testar as principais e efeitos interativos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão do in vitro criadas abelhas solitárias. Para investigar, ovos de ribifloris o. sensu lato (s.l.) podem ser obtidos comercialmente (tabela de materiais). Esta população é ideal por causa de sua importância como um polinizadores nativos e sua forte predileção para o néctar rico Mahonia aquifolium (uva de Oregon) encontrado dentro da região53,63,64 (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> Figura 1. Uma foto de alta resolução de um adulto Osmia ribifloris. Foto de crédito Dr. Jim Cane, pesquisa entomologista, USDA-ARS <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> Figura 2. Aninhamento de palhetas de Osmia ribifloris (s.l.) com uma fêmea de nidificação em primeiro plano,. de Phragmite Partições de câmara e buchas terminais para as palhetas são construídas a partir de folhas mastigadas. Foto crédito Sr. Kimball Clark, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O primeiro objectivo deste estudo é avaliar o efeito de consumir pólen tratada com fungicida na aptidão larval (medido em termos de tempo de desenvolvimento e biomassa de prepupal). Enquanto a exposição para o propiconazol fungicida comumente aplicada tem sido associada ao aumento da mortalidade entre abelhas adultas através de várias espécies de 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,,66,67, seu impacto sobre as abelhas larvas é menor conhecido. O segundo objectivo deste estudo é avaliar os efeitos de consumir pólen não-host na aptidão larval. Estudos anteriores indicam que as larvas de abelhas oligolectic não conseguem desenvolver quando forçado a consumir pólen host não68. Tais resultados podem ser atribuídos às variações na fisiologia de abelha69, pólen bioquímica70e o benéfico microbiome associado com pólen natural disposições71. O terceiro objectivo deste estudo é avaliar os efeitos interativos de tratamento fungicida e pólen dietético na aptidão larval.
Numerosos traços biológicos, incluindo o tamanho do corpo materno, provisionamento de taxa, estratégia de forrageamento e pólen quantidade72,73,,74,75 são conhecidos por afetar a aptidão larval entre abelhas solitárias. Esses fatores podem introduzir variabilidade significativa entre juncos, que constitui um desafio no desenvolvimento de projetos experimentais defensáveis quando avaliação saúde larval. Além disso, dado que desenvolvimento larval ocorre dentro de juncos aninhamento selados, os efeitos de tal variabilidade na progenitura são difíceis de Visualizar e quantificados sem o uso de técnicas não-letais (Figura 3). Para superar este desafio, todas as hipóteses dentro deste estudo são testados usando larvas criadas fora suas linguetas de aninhamento. O delineamento experimental representa um totalmente cruzados 2 × 2 fatorial set-ups, com cada fator, consistindo em 2 níveis; Fator 1: Exposição fungicida (fungicida; Nenhum fungicida); Fator 2: Fonte de pólen (Host pólen, pólen de Non-host). As abelhas são disparadas do ovo à fase prepupal placas de cultura de célula do multiwell estéril sob condições controladas de laboratório. Cada um bem individualmente é abastecido com uma quantidade padronizada de um único ovo e disposições de pólen. Após a eclosão, a larva alimenta-se o pólen alocado dentro do poço, conclui desenvolvimento larval e inicia a pupa. Após estudos têm mostrado que inexplicáveis de mortalidade é menor entre abelhas levantadas dentro deste ambiente de criação artificial do que o encontrado no selvagem49,,76. O uso do in vitro-abelhas criadas tem diversas vantagens sobre os estudos de campo baseada: 1) minimiza os efeitos de confundimento de variabilidade natural e descontrolados fatores associados tipicamente com os estudos de campo baseada; 2) permite que vários níveis de manipulação para cada factor de interesse a serem testadas simultaneamente em grupos de tratamento; 3) o número de repetições pode ser predeterminado, e fatores experimentais para cada replicar podem ser manipulados individualmente; 4) variáveis resposta larval podem ser facilmente visualizadas e gravadas independentemente sem perturbadoras larvas adjacentes; 5) o protocolo pode ser modificado para acomodar mais complexos desenhos experimentais envolvendo múltiplos fatores e variáveis de resposta.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> Figura 3. Conteúdo dentro de uma palheta de nidificação natural de Osmia ribifloris (s.l.). Perto da (A) um reed dissecado mostrando câmaras individuais, disposições de pólen e as partições e (B) recém colhidas disposições de pólen e os ovos associados (indicados com um círculo preto). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kaysville, Davis County, Utah, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmia reeds</td>
			<td>Nativebees.com</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freshly plugged reeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection set</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89259-964</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long Nose Pliers</td>
			<td>Husky</td>
			<td>1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Sterile sealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-898</td>
			<td>Sterile sealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373100</td>
			<td>Sterile sealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Weighing Boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel Hair Brush</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1153A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin capsules</td>
			<td>EA Consumables</td>
			<td>D1021</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propiconazole 14.3</td>
			<td>Quali-Ppro</td>
			<td>60207-90-1</td>
			<td>Propiconazole 14.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honey bee pollen</td>
			<td>Bee energised</td>
			<td>897098001244</td>
			<td>Untreated, natural, raw pollen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverisette</td>
			<td>LAB SYNERGY INC.</td>
			<td>30334913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden sticks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470146908</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89403-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planting tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1158-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-07940-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tweezer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0135HWPN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze drier</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>LFZ-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS</td>
			<td>Version 21.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro rearing of solitary bees: a tool for assessing larval risk factors

Embora as abelhas solitárias fornecem serviços de polinização crucial para culturas selvagens e gerenciados, este grupo de ricos em espécies foi negligenciado em grande parte em estudos de regulamento de pesticidas. O risco de exposição a resíduos do fungicida é provável que seja especialmente elevado se o spray ocorre em ou perto de plantas hospedeiras, enquanto as abelhas estão coletando pólen para provisionar seus ninhos. Para espécies de Osmia que consomem pólen de um seleto grupo de plantas (oligolecty), a incapacidade de usar o pólen de plantas não-hospedeiras pode aumentar seu fator de risco para toxicidade relacionadas com fungicida. Este manuscrito descreve protocolos usados com sucesso criar abelhas oligolectic mason Osmia ribifloris sensu lato, do ovo à fase prepupal em placas de cultura de células em condições laboratoriais padronizados. O em vitro-abelhas criadas posteriormente são usadas para investigar os efeitos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão de abelha. Baseado em um experimento fatorial 2 x 2 totalmente atravessado, o experimento examina os efeitos principais e interativos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão larval, quantificada por biomassa prepupal, tempo de desenvolvimento larval e sobrevivência. Uma grande vantagem desta técnica é que usando em vitro-abelhas criadas reduz a variabilidade natural de fundo e permite a manipulação simultânea de vários parâmetros experimentais. O protocolo descrito apresenta uma ferramenta versátil para hipóteses testes envolvendo o conjunto de fatores que afetam a saúde das abelhas. Para os esforços de conservação a ser cumprido com sucesso significativo e duradouro, tais insights sobre a complexa interação de fatores fisiológicos e ambientais que levam a abelha declínios provarão para ser crítico.

Aptidão larval foi quantificada utilizando três métricas (i) larval tempo do desenvolvimento, (ii) prepupal biomassa e sobrevivência (iii) por cento. Uma ANOVA de duas vias foi realizada utilizando exposição fungicida (dois níveis: nenhum fungicida, fungicida) e fonte de pólen (dois níveis: Host pólen, pólen de Non-host) como variáveis independentes e tempo de desenvolvimento larval como variável dependente. O principal efeito para exposição de fungicida (F1,2...

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In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval

Sprays de fungicida em plantas de floração podem expor abelhas solitárias para altas concentrações de resíduos do fungicida transmitidas pelo pólen. Usando experimentos baseados em laboratório, envolvendo-se em vitro-larvas de abelha criados, este estudo investiga os efeitos interativos de consumir pólen tratada com fungicida derivado de host e host não plantas.

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

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