Name: rapid isolation of the mitoribosome from hek cells
Uploaded: 2018-10-04T12:30:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells at JoVE.com

هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة السويدية" للبحوث الاستراتيجية (FFL15:0325 منحة قادة المستقبل)، ومؤسسة سودربيرغ راغنار (زمالة في الطب M44/16)، ومجلس البحوث السويدية (× NT "المنحة ابتداء من" عام 2015-04107)، الزمالة الطويلة الأجل فيبس (SA) ، H2020-مسكاً-أي تي-2016 مشروع 721757 (ص).

يجب أن تتم جميع خلايا الثدييات ثقافة العمل داخل مجلس الوزراء سلامة بيولوجية. استخدام معدات معقمة إذا كان الاتصال مع الخلايا. ارتداء القفازات النتريل ومعطف معمل واتباع الممارسات الجيدة في مجال زراعة الأنسجة.
1-خلية ثقافة
<ol><li>الحفاظ على HEK293S تعليق الخلايا في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين خالية من التتراسيكلين (FBS)، 5 ميكروغرام/مل بلاستيسيدين و 200 ميكروغرام/مل الأزيتروميسين، في 37 درجة مئوية و 5% CO2.</li>
	<li>مقياس يصل إلى 9 x T175 قوارير. في كونفلوينسي 90%، حصاد الخلايا وتدور لهم إلى أسفل في ز 500 x لأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في فريستيل تكملة مع 5% FBS خالية من التتراسيكلين. حساب عدد الخلايا باستخدام خلية الآلي مكافحة وضبط تركيز الخلية إلى 1.5 x 106 خلايا/مل في قارورة تهتز تنفيس. ملاحظة: هذا سوف عادة تتوافق مع وحدة تخزين بدءاً من 300 مل في قارورة تنفيس مل 1,000.</li>
	<li>احتضان خلايا في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 120 لفة في الدقيقة (قطر الهز 50 ملم).</li>
	<li>وبعد يومين عد الخلايا والشروع في تقسيم الخلايا إذا كانت كثافة الخلية أعلاه 3.0 x 106 خلايا/مل. تقسيم الخلايا بالغزل أسفل ثقافة الخلية 2 × 150 مل في زجاجات مخروطية 2 × 250 مل على 500 غرام للحد الأدنى 5 خلايا ريسوسبيند في وسائط جديدة 2 × 10 مل ونقل إلى 2 × 1، 000 مل تنفيس قوارير تحتوي على وحدة التخزين المناسبة لكثافة خلية النهائية 1.5 × 106 خلية/مل، مثل 2 × 300 مل من كثافة خلية بداية 3.0 x 106 خلايا/مل.</li>
	<li>احتضان خلايا في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 120 لفة في الدقيقة (قطر الهز 50 ملم).</li>
	<li>وبعد يومين عد الخلايا والشروع في تقسيم الخلايا إذا كانت كثافة الخلية أعلاه 3.0 x 106 خلايا/مل. انقسام الخلايا بالغزل أسفل 4 × 150 مل خلية ثقافة في زجاجات مخروطية الشكل 4 × 250 مل على 500 غرام للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا في وسائط جديدة 2 × 10 مل ونقل إلى قارورة تنفيس مل 2 x 2,000 الذي يحتوي على وحدة التخزين المناسبة لكثافة خلية الأخيرة 1.5 x 106 خلية/مل، مثلاً 2 x 700 مل من كثافة خلية بداية 3.0 x 106 خلايا/مل.</li>
	<li>احتضان خلايا في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 120 لفة في الدقيقة (قطر الهز 50 ملم).</li>
	<li>وبعد يومين عد الخلايا والشروع في تقسيم الخلايا إذا كانت كثافة الخلية أعلاه 3.0 x 106 خلايا/مل. تقسيم الخلايا بصب مل 2 x 700 تنفيس ثقافة الخلية إلى 2 × مل 2800 قوارير وتتصدر مع 2 × 300 مل وسائط جديدة للوصول إلى وحدة تخزين من 2 × 1 ل.</li>
	<li>احتضان خلايا في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 120 لفة في الدقيقة (قطر الهز 50 ملم).</li>
	<li>بعد 24 ساعة عد الخلايا وحصاد الخلايا إذا كانت كثافة الخلية بين 3.0-4.0 × 106 خلايا/مل.</li>
</ol>2-الميتوكوندريا العزلة
<ol><li>المخازن المؤقتة المطلوبة ملاحظة: الكميات التي تعطي لإعداد من الخلايا ل 2. إعداد الحلول الأسهم التالية قبل الموعد المحدد لعزل المتقدرية المخزن المؤقت (MIB)، السكروز/المانيتول المخزن المؤقت (SM4)، المخزن المؤقت التجريبي (ميبسم)، لاستثارة المخزن المؤقت (SEM).<ol>
<li>جعل 0.5 لتر MIB المخزن المؤقت: 50 مم هيبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 10 مم بوكل، 1.5 مم مجكل2، 1 مم يدتا، 1 مم اجتا، 1 مم DTT، مثبطات البروتياز.</li>
		<li>جعل المخزن المؤقت 100 مل SM4: السكروز 280 ملم، المانيتول 840 ملم، 50 ملم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 10 مم بوكل، 1.5 مم مجكل2، 1 مم يدتا، 1 مم عطا، 1 م م DTT، ومثبطات البروتياز.</li>
		<li>جعل 160 مل ميبسم المخزن المؤقت: 120 مل MIB المخزن المؤقت + 40 مل SM4 المخزن المؤقت.</li>
		<li>تخزين 200 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>جعل المخزن المؤقت 5 مل SEM: السكروز 250 ملم، 20 ملم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، يدتا 1 مم.</li>
		<li>تجعل حلول 4 × 10 مل الأسهم للتدرج السكروز التدرجي الذي يحتوي على 20 مم حبيس-كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 1 مم يدتا و 60%/السكروز 32% 23 في المائة و 15 في المائة، على التوالي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>عزل الميتوكوندريا ملاحظة: من المهم أن تعمل بسرعة، وإبقاء كل شيء على الجليد طوال فترة الإجراءات.</li>
	<li>بريكول التجويف النيتروجين الدائرة المسبقة لاستخدام.<ol>
<li>حصاد الخلايا ل 2 × 1 (3-4 × 109 خلايا كل أنبوبة الطرد المركزي) بالطرد المركزي في غ س 1,000 لمدة دقيقة 7، 4 درجة مئوية.</li>
		<li>صب المادة طافية بعناية وريسوسبيند الخلايا الأعلاف بسرعة في 2 × 100 مل برنامج تلفزيوني. تجمع الخلايا.</li>
		<li>الطرد المركزي الخلايا ريسوسبينديد في س 1,200 ز ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية.</li>
		<li>صب المادة طافية بعناية وتزن بيليه (~ 20 g).</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه في 120 مل MIB المخزن المؤقت.</li>
		<li>السماح للخلايا تضخم بالتحريك بلطف في غرفة باردة لمدة 10 دقائق.</li>
		<li>ضع الدائرة التجويف النيتروجين على الجليد ونقل الخلايا سوليد لقاعة التجويف النيتروجين. إضافة 45 مل SM4 المخزن المؤقت (1/3 الحجم النهائي لحراكه الخلايا، حوالي 140 مل، مما أسفر عن تركيز نهائي من المانيتول السكروز و 210 ملم 70 مم).</li>
		<li>ربط الدائرة التجويف النيتروجين والتعبئة مع النيتروجين حتى يصل الضغط إلى 500 رطل/بوصة مربعة. إغلاق الصنابير وتبقى معزولة في الثلج لمدة 20 دقيقة.</li>
		<li>ببطء الإفراج عن الضغط في الدائرة التجويف النيتروجين وجمع (حوالي 185 مل).</li>
		<li>الطرد المركزي المواد ليسيد لإزالة الحطام خلية ونواة في 800 x ز لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.</li>
		<li>جمع المادة طافية التي تتدفق من خلال القماش القطني كوب أبقى على الجليد. عدم تجاهل بيليه.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت ميبسم 90 مل (1/2 وحدة التخزين السابقة). مجانسة استخدام الخالطون دونس تفلون/الزجاج وتكرار استخدام الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.</li>
		<li>جمع المادة طافية التي تتدفق من خلال القماش القطني كوب أبقى على الجليد. الجمع بين هذه المادة طافية مع المادة طافية من الخطوة 2.2.11.</li>
		<li>الطرد المركزي supernatants مجتمعة في غ س 1,000 لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.</li>
		<li>جمع المادة طافية التي تتدفق من خلال القماش القطني كوب أبقى على الجليد.</li>
		<li>تجاهل بيليه والطرد المركزي المادة طافية المحتوية على النفط الخام الميتوكوندريا في 10,000 ز س لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية. ملاحظة: عادة ما بيليه سوف تتألف من جزأين: فضفاض وضيق.</li>
		<li>عناية تغسل بيليه فضفاضة دون إزعاج جزء ضيق. ريسوسبيند بيليه ضيق في 10 مل ميبسم المخزن المؤقت.</li>
		<li>إجراء مقايسة تركيز بروتين استخدام "طقم مقايسة البروتين" تجارية أو طريقة مشابهة. يتم تركيز نموذجي الغلة من 2 لتر ابتداء من الثقافة ~ 2 ملغ/مل.</li>
		<li>إضافة 200 "وحدات رناسي" الدناز الحرة وترك لتناوب اسطوانة في غرفة باردة لمدة 20 دقيقة لخلط الدناز لإزالة الحمض النووي الجينوم بالتساوي.</li>
		<li>الطرد المركزي في 10,000 ز س لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية، وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت 2 مل وزارة شؤون المرأة. مجانسة برفق باستخدام صغير الخالطون دونس تفلون/زجاج إلى ريسوسبيند أي المجاميع المتبقية. أداء لا يزيد على خمسة مسارات صعودا ونزولاً لتجنب الكسر. الحفاظ على الجليد.</li>
		<li>إعداد التدرج السكروز في 14 مل SW40 الأنابيب بعناية بيبيتينج 1.5 مل من 60% السكروز المخزون الاحتياطي في الجزء السفلي من الأنبوب. عناية إضافة 4.5 مل 32% السكروز المخزن المؤقت الأسهم على رأس الفرقة 60% دون الإخلال بذلك. كرر مع 1.5 مل من السكروز 23% الأسهم المخزن المؤقت، ومرة أخرى مع 1.5 مل من السكروز 15% الأسهم المخزن المؤقت.</li>
		<li>تحميل تعليق المتقدرية كامل (حوالي 3 مل) على رأس التدرج السكروز.</li>
		<li>الطرد المركزي في دوار SW40 139, 065 س ز لمدة 60 دقيقة.</li>
		<li>جمع الفرقة براون يهاجرون إلى الواجهة من 32 في المائة و 60 في المائة من السكروز استخدام ماصة نقل، وعادة من 2-3 مل بعناية.</li>
		<li>الأداة الإضافية-تجميد الميتوكوندريا المنقاة في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. إعداد ميتوريبوسومي
<ol><li>المخازن المؤقتة المطلوبة ملاحظة: إعداد الحلول الأسهم التالية قبل الموعد المحدد لتحلل المخزن المؤقت، السكروز وسادة/التدرج، واستثارة المخزن المؤقت.<ol>
<li>جعل المخزن المؤقت لتحلل مل 10: 25 مم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 150 مم بوكل، 50 مم مجواك، 2% البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل الاثير، 2 مم DTT، مثبطات البروتياز.</li>
		<li>جعل 10 مل السكروز وسادة المخزن المؤقت: السكروز 1 م (34% w/v)، 20 مم هيبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 100 ملم بوكل، 20 مم مجواك، 1% البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل الاثير، 2 مم DTT.</li>
		<li>جعل المخزن المؤقت لاستثارة مل 5: 20 مم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 100 ملم بوكل، 20 مم مجواك، 2 مم DTT</li>
		<li>جعل التدرجات الخطية السكروز مع المخزن المؤقت لاستثارة 15% إلى 30% في أنابيب البولي TLS-55.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تنقية ميتوريبوسومي<ol>
<li>تذويب الميتوكوندريا مجمدة في الجليد.</li>
		<li>إضافة 2 حجم المخزن المؤقت تحلل،مثلاً إضافة المخزن المؤقت لتحلل 6 مل إلى 3 مل الميتوكوندريا. مزيج فورا بعكس الأنبوبة عدة مرات.</li>
		<li>تجانسه مع الخالطون دونس تفلون/زجاج صغيرة لمساعدة تحلل واحتضان لمدة 5-10 دقيقة على الجليد لإكمال تحلل.</li>
		<li>الطرد المركزي بالمواد ليسيد (حوالي 9 مل) في 30,000 ز x لمدة 20 دقيقة، 4 درجة مئوية إزالة المواد غير قابلة للذوبان. صب المادة طافية بعناية من بيليه وتجاهل بيليه.</li>
		<li>تكرار استخدام الطرد المركزي في 30,000 س ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية لضمان توضيح المادة طافية. صب المادة طافية بعناية من بيليه وتجاهل بيليه.</li>
		<li>إعداد وسادة السكروز في أنابيب TLA 120.2 (واضحة جداً): 0.4 مل السكروز وسادة كل أنبوب. إعداد أنبوب واحد كل مل تفكيك المواد.</li>
		<li>طبقة تفكيك الميتوكوندريا على وسائد السكروز: حوالي 1 مل في أنبوب، ونتج عنه: نسبة وسادة من 2.5:1.</li>
		<li>الطرد المركزي في عينة في 231، س 550 ز لمدة 45 دقيقة في دوار TLA120.2 في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>تجاهل المادة طافية وشطف أنابيب تسلسلياً مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت استثارة لإزالة بقايا السكروز.</li>
		<li>ريسوسبيند الكريات في المجموع 100 ميليلتر استثارة المخزن المؤقت.</li>
		<li>دوامة على سرعة بطيئة لمدة 30 ق حل المجاميع المتبقية والطرد المركزي في 17,949 س ز لمدة 10 دقائق في أجهزة الطرد المركزي microtube في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>جمع المادة طافية وكرر الطرد المركزي بعناية.</li>
		<li>قياس امتصاص ميتوريبوسومي في ألف260. ملاحظة: هو عائد نموذجي 7 A260، مع A260:280 نسبة 1.3.</li>
		<li>تحميل العينة كاملة على أنبوب تدرج سكروز خطية واحدة. الطرد المركزي في دوار TLS-55 في 213، ز 626 x لمدة 120 دقيقة في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>يجزئ التدرج وتحديد كثافة بصرية في A260 وتجمع الكسر المقابلة إلى ذروة الحمض النووي معا. ملاحظة: Aنموذجية260: نسبة280 الذروة > 1.6.</li>
		<li>تبادل المخزن المؤقت إذا لزم الأمر، باستخدام أسلوب الاختيار. حساب تركيز النهائي باستخدام التحويل 1 A260 = 0.1 مغ/مل.</li>
		<li>الأداة الإضافية تجميد العينة ميتوريبوسومي المنقي في المخزن المؤقت لاستثارة ومخزن في-80 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ott, M., Amunts, A., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+mitochondrial+protein+synthesis.">Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis.</a> Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).</li><li>Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+human+mitochondrial+ribosome.">The structure of the human mitochondrial ribosome.</a> Science. 348 (6230), 95-98 (2015).</li><li>Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+structure+of+the+55S+mammalian+mitochondrial+ribosome.">The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome.</a> Science. 348 (6232), 303-308 (2015).</li><li>Greber, B. J., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+mitochondrial+ribosome.">Structure and function of the mitochondrial ribosome.</a> Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).</li><li>Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+large+subunit+of+the+mammalian+mitochondrial+ribosome.">Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome.</a> Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).</li><li>Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+ribosomes+can+switch+their+structural+RNA+composition.">Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338 (2016).</li><li>Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+ribosomes+can+switch+structural+tRNAs-but+when+and+why?.">Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why?.</a> RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).</li><li>Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Genome+Engineering:+The+Revolution+May+Not+Be+CRISPR-Ized.">Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized.</a> Trends in Genetics. , (2017).</li><li>Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+human+mitochondrial+ribosome+in+native+states+of+assembly.">Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866 (2017).</li><li>Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+in+rhodopsin:+high-level+expression+of+rhodopsin+with+restricted+and+homogenous+N-glycosylation+by+tetracycline-inducible+N-acetylglucosaminyltransferase+I-negative+HEK293S+stable+mammalian+cell+line.">Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).</li><li>Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+large+ribosomal+subunit+from+human+mitochondria.">Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria.</a> Science. 346 (6210), 718-722 (2014).</li><li>O'Brien, T. W., Kalf, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomes+from+rat+liver+mitochondria+I.+Isolation+procedure+and+contamination+studies.">Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).</li><li>Spremulli, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+isolation+of+mitochondrial+ribosomes+from+mammalian+tissues.">Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues.</a> Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).</li><li>Rice, J. E., Lindsay, J. G., Grahamand, J. M., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+of+mitochondria.">Subcellular fractionation of mitochondria.</a> Subcellular Fractionation: A Practical Approach. , 107-142 (1997).</li><li>Attardi, G., Ching, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+mitochondrial+proteins+in+HeLa+cells.">Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells.</a> Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).</li><li>Gottlieb, R. A., Adachi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+cavitation+for+cell+disruption+to+obtain+mitochondria+from+cultured+cells.">Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells.</a> Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation.">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).</li><li>Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+fatty+acids+and+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+by+isolated+rat+liver+mitochondria.">Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation.">Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2001).</li><li>Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Ll&#225;cer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+yeast+mitochondrial+large+ribosomal+subunit.">Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.</a> Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).</li><li>Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+and+cancer+metabolism+in+the+tumor+microenvironment:+markers,+models,+and+mechanisms.">Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).</li><li>&#352;krti&#263;, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+translation+as+a+therapeutic+strategy+for+human+acute+myeloid+leukemia.">Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).</li><li>Boczonadi, V., Horvath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+impaired+mitochondrial+translation+in+human+disease.">Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 48, 77-84 (2014).</li></ol>

وفيما يتعلق بمصدر ابتداء من المواد، على الرغم من توافر سهلة نسبيا من الأنسجة الحيوانية التي هي معروفة لتكون مصدرا غنيا من الميتوكوندريا، يجعلها خياراً شعبيا ل، ميتوريبوسوميس،من35،12 13، لا يمكن تعديلها والمستنسخة في المختبر بسهولة وراثيا. ومن ثم، هناك حاجة عملية واضحة لتطوير البروتوكولات التي تشمل خطوط الخلايا البشرية البلوتينيوم المستزرعة. والفرق الرئيسي بين البروتوكولات هو التعامل مع الأنسجة والخلايا المستزرعة طريقة تحلل والتجانس. للخلايا المستزرعة نمت كأحادي الطبقة، هو أسلوب نموذجي تفلون/الزجاج دونس التجانس14. تم وضع البروتوكولات الإعداد الأصلي بينما تتسم بالكفاءة لجداول صغيرة15. المباشر الارتقاء بتوظيف الخالطون بسعة 500 مل ممكن11، بيد أنه يتطلب ح ~ 2 من العمل اليدوي لتحقيق تحلل 80%. هذا وعرض القضايا على الأقل ثلاثة: تجميع العضيات بسبب أوقات الانتظار الطويلة، وتحلل غير متجانسة بسبب المواد الثقيلة غرق إلى الجزء السفلي من سفينة كبيرة، تدفئة العينة نظراً لضرورة ضربات متعددة. ولذلك، يستخدم أسلوب أفضل لتحلل التجويف النيتروجين، الذي يستند إلى الضغط من،من16سفينة مضغوط17. في هذا الأسلوب، يتم أولاً تضخم الخلايا في الغرفة الباردة من أجل تليين الخلايا وتجعلها أكثر عرضه لتحلل. كما أنها توضع في الجهاز التجويف النيتروجين يتم إضافة المخزن مؤقت الذي يحتوي على السكروز والمانيتول حفاظا ضغط الاسموزي التي سوف تساعد في الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا. ثم يتم الضغط الجهاز التجويف النيتروجين مع كمية كبيرة من النيتروجين خالية من الأكسجين، الذي يذوب في الخلايا. ما الضغط فقاعات النيتروجين المفرج عنهم من الحل أسفر عن تمزيق أغشية الخلايا. هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا الميكانيكية أساليب التماثل التي تنطوي على تشدد على القص والاحتكاك على النحو التالي: 1) هو تجنب أي الإجهاد البدني الخارجي على الخلايا؛ 2) توسع كظومه أن يبرد العينة، يضمن أي أضرار الحرارة العضيات؛ 3) المكونات خلية محمية من الأكسدة بغاز النيتروجين خامل؛ 4) تغيير درجة الحموضة أي تعليق المتوسطة؛ 5) عملية موحدة واستنساخه لأنه يتم تطبيق نفس القوى التخريبية داخل كل خلية وفي جميع أنحاء العينة؛ 6) هذه العملية بسرعة ويمكن أن تنجز في غضون 20-30 دقيقة.
وصف عزلة الميتوكوندريا من استزراع الخلايا والأنسجة في الأدب على نطاق واسع، وهو يستند إلى اضطراب خلية لطيف متبوعاً بسلسلة من سينتريفوجيشنز التفاضلية. معظم البروتوكولات المستخدمة حاليا اتبع الإجراءات الأصلية التي وضعت في منتصف القرن السابق18. في حين أن النهج البيوكيميائية الأساسية الصحيحة، وهناك العديد من المفاهيم الخاطئة التي سلط عليها الضوء في الأدب، وظلت غير مكتشفة. لتحسين بروتوكول ميتوريبوسوميس، نحن التحقيق في المبادئ العامة التي تم الإبلاغ عنها بشكل منتظم ونستنتج أن: 1) إدراج Mg2 + وك+ في المخزن المؤقت غير حاسمة. وقد قيل أن يساعد بوكل للحيلولة دون تشكيل جل19، غير أن البروتينات هيولى المقدمة إضعاف كافية على النحو المبين في البروتوكول، ولدينا لا تحدث هذه الظاهرة. وعلاوة على ذلك، استبعاد Mg2 + مفيدة لتقليل التلوث من ريبوسوم هيولى20؛ 2) ليس هناك حاجة إبقاء نسبة أقصى حجم ممكن من الخلايا إلى المتوسط لحماية العضيات المفرج عنهم من بيئة هيبو ناضح. بما فيه الكفاية وتقدم الدعم ناضح لدينا بروتوكول المخازن المؤقتة التي تحتوي على السكروز، وتمييع الخلايا مع المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا (الخطوة 2.II.5) أمر حاسم لفصل العضيات في تحضير على نطاق واسع كفاءة.
الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا قريبة من القيم الفسيولوجية، أي 7.5، وهو أيضا الرقم الهيدروجيني الأمثل لإعداد ميتوريبوسومي التالية. عوامل الربط يدتا وعطا تضاف إلى وسائل الإعلام العزلة يخلب أيونات تلويث، وأنهم يخلب الحرة المغنيسيوم والكالسيوم، على التوالي. قد سبق أن إدراج يدتا يمكن أن يؤدي إلى أضرار غشاء الميتوكوندريا الداخلية14، ولذلك يقتصر التركيز على 1 مم كإجراء وقائي. وقد لاحظنا لا أي فرق عند استخدام 5 مم يدتا في الخطوة النهائية تنقية من السكروز الكثافة المتدرجة.
هنا يستخدم بروتوكول وصف الخلايا البشرية المستمدة من HEK293S لتنقية ميتوريبوسومي. يسمح نوعية الإعداد العينة التي تم الحصول عليها التحقيق المتحلل وهيكليا للقرار الذري. هذا يسمح لأحد بتطبيق الأسلوب على ميتوريبوسومال البشرية ترجمة المجمعات ومجالس مراقبة الجودة، ووسيطة مفارز ميتوريبوسومال. وعلاوة على ذلك، حيث قد تتضخم الخلايا السرطانية قدرة أوكسفوس وترجمة البروتين المتقدرية مرتفعة بالمقارنة مع النسيج المجاور stromal21، ميتوريبوسوميس أهداف المخدرات المنشأة للسرطان22. ولذلك، سوف يكون استخدام هذا البروتوكول لتنقية محددة من ميتوريبوسوميس في وجود مثبطات التطبيقات الطبية. أيضا، قد ربطت الطفرات ميتوريبوسومال بأمراض وراثية المتقدرية23. نظراً لهذه الطفرات لها آثار مباشرة على الهيكل، النهج الذي قدم هنا ستكون مفيدة لتكييفها الهيكلي. يمكن توسيع نطاق البروتوكول تجريبيا وتطبيقها على مجموعة متنوعة من المسائل العلمية معالجة فهم أساسي للترجمة في الميتوكوندريا البشرية وأهميتها الطبية.

تستند عملية تخليق البروتين المتقدرية 13 طن متري-مرناس الأساسية التي يتم ترجمتها بواسطة ميتوريبوسومي المرفقة بغشاء متخصصة تشكل جوهر السلسلة التنفسية الحفاز. الجينوم المتقدرية غيرت والحاجة للبروتينات لإدراج كوترانسلاتيونالي في الغشاء شكلت إلى حد كبير هيكل ريبوسوم المتقدرية1. أظهرت مؤخرا هياكل ميتوريبوسومي الثدييات ذات الدقة العالية مظهر العام مختلفة لافت للنظر إلى نظيره البكتيرية2،3. خاصة، إضافة على الأقل 36 الخاصة الميتوكوندريا البروتينات، المساهمة ~ 1 جمعية نجمة داود الحمراء الكتلة الجزيئية إضافية، في حين خفضت من شقين الرنا الريباسي طن متري واختلفت بدرجة عالية. تغيير ترتيبات هيكلية جديدة تقريبا كافة الميزات الفنية الحاسمة سابقا المقبولة عموما أن يكون عالمياً حفظت4.
العناصر الرئيسية الجديدة قد اكتسبت بكل واحد من الوحدات الفرعية ميتوريبوسومال، على سبيل المثال، أدمجت وحدة فرعية صغيرة mS29 بروتين GTPase جوهرية في منطقتها 'رأس'. لم يتم اكتشاف نشاط GTPase في أنظمة الترجمة الأخرى، والهيكل يشير إلى أن جتباسي قد يكون دور في فرعية للجمعية2. مفقود في ميتوريبوسومي الثدييات الرنا الريباسي 5S الذي يعتقد أنه معلما من جميع مفارز كبيرة ريبوسومال المعروفة، تشكل جوهر الناشزة المركزية، وقد اعتمدت طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Val كلبنة لا يتجزأ بدلاً من2. الحظر والزملاء وأظهرت أن ميتوريبوسومي الخنزير طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-الفنيل ألانين ولا – فال5. تشرزانووسكا-لايتووليرس، مينكزوك، والزملاء بمتابعة هذه البيانات ووجدت أن ميتوريبوسوميس من المرضى مع الشبهة طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Val الاستقرار يمكن أن تستوعب في المبدأ6طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Phe،7. لماذا أدرجت ميتوريبوسوميس هذه العناصر المحددة والمسارات و عبر-عوامل مطلوبة من أجل هذه التجميعات فريدة لا تزال غير معروفة.
إجمالاً، يعني تعقيد عالية ميتوريبوسومي البشرية ومكونات البروتين جديدة، ورابطة فريدة من نوعها للحمض الريبي النووي النقال طن متري كعنصر هيكلي مشاركة الميتوكوندريا على حدة كحتى الآن-المجهول عبر-العوامل. ومع ذلك، نظراً لأن العديد من ميزات هذا النظام فريدة من نوعها إلى الميتوكوندريا، التي كانت تقليديا صعبة التحقيق8، يعرف الكثير عن الآلية الجزيئية ومراقبة الجودة. مع وضع تحليل الجسيمات مفردة ذات الدقة العالية بالإلكترون cryo-مجهرية (cryo-م)20، تنشأ الفرص الآن لدراسة شاملة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الجمعية، والعمل ومراقبة الجودة للإنسان ميتوريبوسومي. يقدم تقريرنا لهيكل الجمعية العامة ميتوريبوسومي البشرية الوسيطة الأولى الاعتراف بأنه من الممكن تصور كيف يتم تشكيل ميتوريبوسومي البشرية ويظهر أن البرد-م دور أساسي في تحديد هوية جديدة عبر- العوامل الجمعية بالإنابة9.
لتوسيع نطاق هذا الجهد الأولى، يصف لنا بروتوكول سريع لتنقية ميتوريبوسومي البشرية بالتفصيل. ويرد في الجزء الأول من البروتوكول، عزلة على نطاق واسع من الميتوكوندريا سليمة نقية جداً من الخلايا تعليق. هذا الإجراء يتطلب ح 9 ويمكن تعديلها بسهولة وتكييفها لأنواع مختلفة من الخلايا والنطاقات. خطوة هامة في هذا البروتوكول هو استخدام النتروجين التجويف كسر فتح الخلايا. تم وضع الجزء الثاني من البروتوكول لتنقية ميتوريبوسوميس. هذا الإجراء يتطلب ح 7 وينتج كمية كافية من ميتوريبوسوميس للدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية. استخدام الميتوكوندريا نقية كانطلاق مادة يقدم الاستعدادات النهائية عالية الجودة ويمكن استقراء للجزيئات الأخرى المتقدرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin selection reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R25001</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12338026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks with vented cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml conical bottle tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eve automated cell counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>E1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen cavitation cell disruption vessel</td>
			<td>Parr Instruments</td>
			<td>4635, 4639</td>
			<td>safety volume: 40ml, 600ml respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (RNA-free)</td>
			<td>HT Biotechnology</td>
			<td>N401a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon/glass dounce homogenizers</td>
			<td>Cambridge Glassblowing Limited</td>
			<td></td>
			<td>Size designed upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW40 tubes for mitochondria gradient</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344060</td>
			<td>Polypropylene, thin wall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA 120.2 tubes for cushion</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>343778</td>
			<td>Polycarbonate, thick wall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLS-55 tubes for gradient</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>347356</td>
			<td>Ultra-clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Station IP</td>
			<td>BioComp</td>
			<td>153-002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid isolation of the mitoribosome from hek cells

الميتوكوندريا البشرية تمتلك مجموعة مخصصة من ريبوسوم (ميتوريبوسوميس) أن ترجمة مكونات البروتين الضروري 13 من المجمعات الفسفرة المشفرة بواسطة الجينوم المتقدرية. منذ جميع البروتينات تصنيعه من قبل ميتوريبوسوميس البشرية بروتينات الغشاء لا يتجزأ، المربوطة ميتوريبوسوميس البشرية للغشاء الداخلي المتقدرية أثناء الترجمة. بالمقارنة مع الريبوسوم سيتوسوليك ميتوريبوسومي لديه معامل ترسب 55S ونصف محتوى الرنا الريباسي، لا الرنا الريباسي 5S والبروتينات الإضافية 36. ولذلك، أعلى نسبة البروتين للجيش الملكي النيبالي وبنية شاذة تجعل ميتوريبوسومي البشرية متميزة إلى حد كبير من نظيرتها في سيتوسوليك.
وعلى الرغم من الأهمية المركزية ميتوريبوسومي للحياة، لا يوجد أية بروتوكولات متاحة لتنقية المجمع سليمة من خطوط الخلايا البشرية. تقليديا، كانت ميتوريبوسوميس المعزولة من الأنسجة الحيوانية الغنية الميتوكوندريا التي تتطلب كيلوغراما من ابتداء من المواد. نحن مسبب أن الميتوكوندريا في تقسيم الخلايا البشرية المستمدة من HEK293 التي نمت في المتوسط التعبير الغنية بالمغذيات سيكون بترجمة المتقدرية نشطة، ولذلك يمكن أن يكون مصدر مناسب من المواد لدراسات هيكلية والبيوكيميائية ميتوريبوسومي. للتحقيق في هيكلها، قمنا بتطوير بروتوكول لتنقية ميتوريبوسوميس سليمة من خلايا HEK على نطاق واسع. وهنا، نقدم أسلوب التجويف النيتروجين كأسرع وأقل البديلة ذات العمالة الكثيفة وأكثر كفاءة بالطرق الميكانيكية التقليدية المستندة إلى القص لتحلل الخلية. وادي هذا إلى الأعمال التحضيرية ميتوريبوسومي التي سمحت لتصميمها الهيكلي بدقة عالية، والكشف عن تكوين ميتوريبوسومي الإنسان سليمة والوسيطة في الجمعية. هنا، علينا متابعة هذا العمل ويقدم محسنة وأكثر طريقة فعالة من حيث التكلفة التي تتطلب فقط 10 ~10 استزراع الخلايا HEK. الطريقة التي يمكن أن تستخدم لتنقية ميتوريبوسومال البشرية ترجمة المجمعات وطفرات وجمعيات مراقبة الجودة ووسيطة مفارز ميتوريبوسومال. التنقية يمكن أن يكون خطيا الارتقاء بعشرة إضعاف إذا لزم الأمر، وتنطبق أيضا على أنواع أخرى من الخلايا.

خلايا الفاصل وناجعة جداً نقطة انطلاق أساسية لتنقية ميتوريبوسوميس النشطة. ينطبق هذا البروتوكول على أي خلايا تعليق HEK293. ونحن نستخدم خط الخلية الداخلية T501، التي تعرب عن ستابلي الناقل تحت سيطرة التتراسيكلين إيندوسيبلي. خط الخلية الأبوية هو HEK293S-GnTI– الخلايا (جدول المواد)10. خلال نمو الخلايا، والتوسع في "الأجلين المتوسط والتعبير 293 حرة" يجب أن يبقى الحد الأدنى كثافة على 1.5 × 106 خلية/مل، بغية ضمان مضاعفة معدل كل يومين، بينما الخلية الأعلى كثافة لا ينبغي أن تتجاوز ~ 5 × 106 خلية/ مل عند بلوغ كثافة خلية أعلاه 3 × 106 خلية/مل القريبون الخلايا وحراكه في وسائل الإعلام الطازجة، مسخن في وحدة تخزين موسعة لتحقيق كثافة الخلية الحد الأدنى من 1.5 × 106 خلية/مل. تقسيم هذا يتم تنفيذ مرارا وتكرارا كل 2-3 أيام حتى يتم تحقيق كتلة خلايا المطلوب لهذا الإجراء. يمكن أن تختلف كثافة الخلية الأخيرة في النطاق من 3-4.5 × 106 خلية/مل، وعلى الأقل 2 لتر مطلوب كنقطة انطلاق لعزل الميتوكوندريا. ينبغي الحفاظ على بقاء الخلية عموما > 90%، وللثقافة النهائية التي يتم حصادها > 95%. لا ينصح بعلاج ثقافة الخلية على نطاق واسع مع المضادات الحيوية.
بعد سلسلة سينتريفوجيشنز التفاضلية، حجم تعليق المتقدرية بعد الخطوة 2.2.20 عادة في المدى من 3-5 مل. ثم يتم فصل الميتوكوندريا على التدرج السكروز (الشكل 1) من العضيات الأخرى. التدرج السكروز التدرجي على استعداد أن حجم التدرج وحجم تعليق المتقدرية معا ملء الأنبوب الطرد المركزي إلى حجمه الأقصى. هنا هو الرعاية الخاصة اللازمة لجمع الفرقة براون الترحيل إلى 60 ٪/واجهة 32% مع الحد الأدنى من التلوث من المخزن المؤقت المحيطة بها. هذا أمر مهم للحفاظ على نسبة ثابتة من البروتين: المنظفات في الخطوة التالية من solubilization الميتوكوندريا. ينصح بتقييم تركيز البروتين المتقدرية في هذه المرحلة، ويتوقع عائد نموذجية من مجموع البروتين المتقدرية 15-20 ملغ من ~ 1010 مثقف HEK الخلايا.
عند عزل الميتوكوندريا ناجحة، يتم تفكيك بإضافة البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل خماسي البروم ثنائي الفينيل، ويتم فصل ميتوريبوسوميس عن طريق وسادة سكروز (الشكل 2). لفصل ميتوريبوسوميس عن مضمون الغشائي مسعور، هي حراكه الكريات في المخزن المؤقت الذي لا يحتوي على مواد التنظيف، وهم القريبون مجمعات مسعور بالطرد المركزي. يتم تكرار هذا الإجراء، وهو كمياً درجة تنقية ميتوريبوسوميس قبل A260/نسبة280 ألف، والذي من المتوقع أن يكون ~ 1.3. عائد نموذجي هو 7 A260 من ل 2 ابتداء من الثقافة. كما يتضمن هذا الكسر ميتوريبوسومال إضافية مجمعات المتقدرية القابلة للذوبان الكبيرة، مثل نازعة بيروفات ونازعه غلوتامات. لفصل ميتوريبوسوميس من مجمعات المتقدرية القابلة للذوبان، يتم تطبيق المادة طافية على تدرج كثافة سكروز. الكسور التي تحتوي على ميتوريبوسومي تقع عادة في الجزء السفلي الثالث من الأنبوب. ثم يمكن أن يتم تجزئة التدرج السكروز مع مكبس الآلي أو يدوياً بعناية مع أخذ 50 ميليلتر الكسور مع ماصة أو باللكم أسفل الأنبوبة بإبرة ز 21 وجمع القطرات.
اثنين من السكان ميتوريبوسومال الرئيسية المحددة في التدرج: مونوسومي 55S ووحدة فرعية كبيرة 39S، كما هو مبين في الشكل 3 و 4 الشكل. وتقترح وجود الكسر وحدة فرعية كبيرة أن يتم حصاد الخلايا في حالة تقسيم نشطة للغاية11. قد تتغير النسبة بين مونوسومي وقمم فرعية كبيرة. قد تظهر ذروة إضافية الموجودة أقرب إلى الأسفل في الأعمال التحضيرية بتلويث هيولى ريبوسوم 80S. يرجى ملاحظة أن التدرج السكروز الصغيرة استخدام يتأرجح دلو الدوار TLS-55 يسمح لتنقية السريع ~ 1 مل من ميتوريبوسوميس في بكثافة بصرية من 0.4-1 260. فصل مونوسومي وقمم فرعية كبيرة قد تختلف بشكل طفيف اعتماداً على تجزئة، ولكن عادة ما يكون هناك بعض التداخل بين قمم اثنين. ومن ثم، الكسور التي جمع، وتجمع ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار من أجل ضمان أعلى نسبة من مونوسومي، أو وحدة فرعية كبيرة بدلاً من ذلك، في العينة. لدراسات م البرد عالية الدقة، والفصل بين الشعبين ميتوريبوسومال غير مطلوب على الإطلاق (بسبب عمليات إضافية في السيليكون ). ومع ذلك، إذا كان من الضروري فصل أفضل، يوصي باستخدام أنابيب أكبر وما يقابلها من تشغيل مرات.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig1.jpg"> الشكل 1 : تنقية الميتوكوندريا على تدرج سكروز. كان مجزأ العضيات سوبسيلولار من ل 2 ابتداء من الثقافة من خلال سلسلة من سينتريفوجيشنز التفاضلية كما هو موضح في البروتوكول، وتم فصل الميتوكوندريا على تدرج سكروز متقطع. وتوجد الميتوكوندريا المنقاة في الشريط السفلي في الواجهة 32/60%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig2.jpg"> الشكل 2 : تنقية ميتوريبوسوميس على وسادة سكروز. ميتوريبوسوميس النفط الخام من ثقافة انطلاق ل 2 رسابة من خلال وسادة السكروز 1 متر. الكريات هي حراكه في منطقة عازلة خالية من المنظفات، ويتم توضيح ميتوريبوسوميس من سينتريفوجيشنز اثنين كما هو مبين في البروتوكول. يتم تسجيلها امتصاص لتقييم الجودة وإعداد ونموذجي أ260/نسبة280 ~1.3 (اللوحة اليمنى) يشهد كسر غنية ميتوريبوسومي. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig3.jpg"> الشكل 3 : تنقية ميتوريبوسوميس على تدرج سكروز بشكل جيد- تتبع امتصاص من ل 2 ابتداء من الثقافة. يتم ترقيم الكسور من الأعلى إلى أسفل التدرج. يتم التعرف على اثنين ميتوريبوسومال الرئيسية السكان: فرعية كبيرة (الذروة 1) ومونوسومي 55S (الذروة 2). قد تتغير النسبة بين السكان. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig4.jpg"> الشكل 4 : صورة مجهرية إلكترون وفئات 2D و 3D التعمير- اللوحة اليسرى: صورة مجهرية مع العينة من ذروة مونوسومي 2 في تكبير معايرة من 1.23 A/بكسل. الفريق الأوسط: بيانات بعد معالجة ممثل (2D) فصول تكشف مونوسوميس سليمة. اللوحة اليمنى: 3D التعمير. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells at JoVE.com

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

عزل ميتوريبوسومي من الخلايا HEK السريع

الميتوكوندريا المتخصصة ريبوسوم التي تختلف عن نظيراتها البكتيرية وحشوية. هنا نعرض كيف يمكن الحصول على ميتوريبوسوميس من تلك المقصورة الأصلية في الخلايا HEK. الأسلوب الذي ينطوي على عزل الميتوكوندريا من تعليق الخلايا وما يترتب عليها من تنقية ميتوريبوسوميس.

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو تنقية الريبوسومات من الميتوكوندريا من خطوط الخلايا البشرية على نطاق واسع يكفي للدراسات الهيكلية. هذه الطريقة تنقية الريبوسوم الميتوكوندريا تمكن من توصيف المجمعات المترجمة، المسوخ، جمعيات مراقبة الجودة، والمتوسطات الوحدة الفرعية الميتوسيبوسكال. ويمكن استخدام هذه للإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تخليق البروتين في الميتوكوندريا.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التجويف النيتروجيني يستخدم لتحلل الخلايا وهناك حاجة فقط إلى 10 خلايا الثقافة لإعداد mitoribosomes لتحديد بنية عالية الدقة. يمكن أن يؤدي هذا الأسلوب في اكتشاف مكونات جديدة من آلات ترجمة الميتوكوندريا ويمكن استخدامها كذلك لتطوير علاجات جديدة لعلاج السرطان. بعد زراعة خلايا HEK293S وفقا لبروتوكول النص، حصاد اثنين من أنابيب لتر واحد من الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة سبع دقائق.بعناية طهر من عظمى وسرعة resuspend كل بيليه في 100 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم تجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في تعليق 1، 200 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. المقبل ، بعد اطهر بعناية من افرا ، وزن بيليه.ثم، استخدم 120 ملليلتر من المخزن المؤقت MIB لإعادة تعليقها وترك الخلايا التي تم إيقافها لتنتفخ في الغرفة الباردة لمدة 20 دقيقة. نقل الخلايا المنتفخة إلى غرفة التجويف النيتروجينية قبل التبريد على الجليد. ثم، إضافة 45 ملليلتر من المخزن المؤقت SM4 إلى الخلايا.قم بربط غرفة التجويف النيتروجيني وملئها بالنيتروجين حتى يصل الضغط إلى 500 PSI. ثم، أغلق الصنابير وابقيها على الجليد لمدة 20 دقيقة. تمنع طريقة تحلل خلايا التجويف النيتروجيني الضغط البدني الخارجي على الخلايا ، وتتجنب تلف الحرارة في العضيات ، ويحمي غاز النيتروجين الخلايا من الأكسدة.بالإضافة إلى ذلك، إنها طريقة قابلة للاستنساخ للغاية. الإفراج ببطء الضغط في الغرفة وجمع lysate. ثم، لإزالة حطام الخلية والنوى، الطرد المركزي المواد lysed في 800 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.جمع عظمى عن طريق صب من خلال قطعة مطوية من القماش الموسلين في منقار أبقى على الجليد. لا تتخلى عن البيليه. Resuspend بيليه في 90 ملليلتر من العازلة MiBSM.ثم، باستخدام الزجاج تفلون أسفل التجانس، التجانس العينة وتكرار الطرد المركزي في 800 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. مرة أخرى، وجمع الماكر عن طريق صب من خلال قطعة مطوية من القماش الموسلين في منقار أبقى على الجليد. ثم، الجمع بين هذا مُتطّر مع المُتَبّع الأول.أجهزة الطرد المركزي العينة في 1،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، وجمع الماسخ كما كان من قبل. بعد التخلص من بيليه، الطرد المركزي الماحتَج الذي يحتوي على الميتوكوندريا الخام في 10، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.غسل بعناية أي بيليه فضفاضة دون إزعاج الجزء ضيق. ثم, استخدام 10 ملليلتر من العازلة MiBSM لإعادة تعليق بيليه ضيق. إضافة 200 وحدة من RNase-الخالية من DNase إلى العينة لإزالة الحمض النووي الجينومي وتدوير الأنبوب على الأسطوانة في غرفة باردة لمدة 20 دقيقة لهضم العينة بالتساوي.الطرد المركزي العينة في 10، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة واستخدام مليلتر اثنين من العازلة SEM لإعادة تعليق بيليه. قم بتحميل نظام التعليق الميتوكوندريا بالكامل فوق تدرج السكروز. بعد الغزل التدرج وفقا لبروتوكول النص، وذلك باستخدام ماصة نقل، وجمع بعناية الفرقة البني المهاجرة في واجهة 32٪ و 60٪ السكروز.يستخدم هذا البروتوكول التجويف النيتروجيني لكسر الخلايا. مرة واحدة يتقن, يمكن أن يتم عزل واسعة النطاق من الميتوكوندريا نقية للغاية, سليمة في غضون تسع ساعات ويمكن بسهولة تعديل وتكييفها لأنواع الخلايا المختلفة والمقاييس. بعد إزالة الجليد الميتوكوندريا المجمدة على الجليد، إضافة اثنين من وحدات التخزين المؤقت إلى ثلاثة ملليلتر من الميتوكوندريا.تخلط على الفور عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. استخدام الزجاج تفلون صغيرة أسفل التجانس للمساعدة مع التحلل واحتضان التجانس على الجليد لمدة خمس إلى 10 دقائق لإكمال رد الفعل. الطرد المركزي في 30، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لإزالة المواد غير قابلة للذوبان.ثم، جمع بعناية فائقة وتجاهل بيليه. كرر الطرد المركزي لضمان توضيح من عظمى. ثم، جمع بعناية فائقة وتجاهل بيليه.لكل ملليلتر من المواد lysed، وإعداد وسادة السكروز في أنبوب TLA-120.2 واضحة جدا عن طريق إضافة 0.4 ملليلتر من وسادة السكروز إلى الأنابيب. طبقة ما يقرب من ملليلتر واحد من الميتوكوندريا lysed على كل وسادة السكروز مما أدى إلى نسبة lysate إلى وسادة من 2.5 إلى واحد. ثم، الطرد المركزي العينة في TLA-120.2 الدوار في 231، 550 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.تجاهل supernatant واستخدام 100 ميكرولترات من العازلة resuspension لشطف الأنبوب وإزالة السكروز المتبقية. إعادة تعليق الكريات والجمع بينها في ما مجموعه 100 ميكرولترات من عازلة resuspension. في حين resuspending بيليه وسادة، فمن الضروري أن تؤدي على الجليد لتجنب تسخين العينة وأيضا لتجنب رغوة العينة من أجل ضمان السلامة الهيكلية للريبوسوم الميتوكوندريا.دوامة العينة على سرعة بطيئة لمدة 30 ثانية إلى حل المجاميع المتبقية وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 17، 949 مرات ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. جمع بعناية عظمى وتكرار الطرد المركزي. بعد قياس الامتصاص الميتوريبوب في A260، تحميل العينة بأكملها على أنبوب تدرج السكروز خطية واحدة.أجهزة الطرد المركزي العينة في دوار TLS-55 في 213، 626 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 120 دقيقة. لكسر التدرج ، وثقب الجزء السفلي من الأنبوب وجمع عينة قطرة الحكمة في لوحة 96 جيدا. وينبغي أن تنقية ميتوريبوبوس لا يستغرق أكثر من سبع ساعات لكمية كافية من mitoribosomes.كما هو موضح في هذا التدرج السكروز متقطع، mitochondria تنقية تهاجر إلى الفرقة السفلي البني في واجهة 32-60٪. بعد فصل المتوريبومات من مجمعات الميتوكوندريا القابلة للذوبان على تدرج السكروز ، يتم تحديد اثنين من المجموعات الميتوريبوسومية الرئيسية ، 55S أحادية اللون وununit 39S كبيرة. يشير وجود كسر الوحدات الفرعية الكبيرة إلى أن الخلايا يتم حصادها في حالة تقسيم نشطة.تُظهر هذه اللوحة ميكروجراف مع العينة من ذروة أحادية اللون في تكبير محسوب يبلغ 1.23 انجستروم لكل بكسل. تظهر هنا بيانات بعد المعالجة الأولية التي تكشف عن monosomes سليمة. وأخيراً، يتم توضيح إعادة بناء ثلاثية الأبعاد أحادية الأبعاد في هذه اللوحة.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد الميتوريوبوسومات البشرية سليمة للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية. يقدم بروتوكولنا تحضيرات نهائية عالية الجودة يمكن استقراءها للجزيئات الميتوكوندرية الأخرى.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من<em&gt; ريبيسفالوس ميكروبلوس</em&gt; الخلايا الظهارية الظهارية

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

عزل و1-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...