Name: rapid isolation of the mitoribosome from hek cells
Uploaded: 2018-10-04T12:30:00
Duration: 9 min 33 s
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Este trabalho foi financiado pela Fundação sueca para a investigação estratégica (futuro líderes Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Foundation (Fellowship em medicina M44/16), Conselho de pesquisa Sueco (Grant começando NT × 2015-04107), FEBS Long-Term Fellowship (SA) , Projeto H2020-ACEM-ITN-2016 721757 (VS).

Todo trabalho de cultura de células de mamíferos deve ser realizado dentro de uma câmara de segurança biológica. Use equipamento estéril se contato com as células. Utilizar luvas de nitrilo e um jaleco e siga a cultura de tecidos de boa prática.
1. cultura de pilha
<ol><li>Manter HEK293S células de suspensão em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal livre de tetraciclina (FBS), 5 blasticidin μg/mL e 200 μg/mL azitromicina, em 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Escala até 9 frascos de x T175. Na confluência de 90%, colher células e girá-los para baixo a 500 x g durante 5 min. Ressuspender as células peletizadas Freestyl suplementado com 5% FBS livre de tetraciclina. Contar as células usando um contador automatizado de células e ajustar a concentração de células de 1,5 x 106 células/mL em balão tremendo exalada. Nota: Isto normalmente irá corresponder a um volume inicial de 300 mL num balão de 1.000 mL exalada.</li>
	<li>Incube as células em uma tremendo incubadora a 37 ° C e 5% CO2 a 120 rpm (agitação de 50 mm de diâmetro).</li>
	<li>Depois de 2 dias conta as células e prosseguir para dividir as células se a densidade de células está acima de 3,0 x 106 células/mL. Dividir as células girando para baixo a cultura de pilha 2 x 150 mL em frascos de Erlenmeyer 2 x 250 mL a 500 g durante 5 min. os eritrócitos na mídia fresco 2 x 10 mL e transferir para um 2 x 1, 000 mL exalados frascos contendo o volume apropriado para uma densidade de final de célula de 1.5 x 106 células/mL, por exemplo, 2 x 300 mL de uma densidade inicial de célula de 3,0 x 106 células/mL.</li>
	<li>Incube as células em uma tremendo incubadora a 37 ° C e 5% CO2 a 120 rpm (agitação de 50 mm de diâmetro).</li>
	<li>Depois de dois dias, conta as células e prosseguir para dividir as células se a densidade de células está acima de 3,0 x 106 células/mL. Divisão das células por rotação para baixo da cultura de pilha 4 x 150 mL em frascos cônicos de 4 x 250 mL a 500 g durante 5 min. Ressuspender as células em mídia fresco 2 x 10 mL e transferir para balão exalada 2 x 2.000 mL, contendo o volume apropriado para uma densidade de final de célula de 1,5 x 6 células/mL 10, por exemplo, 2 x 700 mL de uma densidade inicial de célula de 3,0 x 106 células/mL.</li>
	<li>Incube as células em uma tremendo incubadora a 37 ° C e 5% CO2 a 120 rpm (agitação de 50 mm de diâmetro).</li>
	<li>Depois de dois dias, conta as células e prosseguir para dividir as células se a densidade de células está acima de 3,0 x 106 células/mL. Dividir as células derramando o 2 x 700 mL cultura celular em 2 x 2800 mL ventilados frascos e desponta com mídia fresco de 2 x 300 mL para atingir um volume de 2 x 1 L.</li>
	<li>Incube as células em uma tremendo incubadora a 37° C e 5% CO2 a 120 rpm (agitação de 50 mm de diâmetro).</li>
	<li>Após 24 h contar as células e as células da colheita se a densidade celular é entre 3.0-4.0 x 106 células/mL.</li>
</ol>2. as mitocôndrias isolamento
<ol><li>Buffers de necessária Nota: As quantidades são dadas para uma preparação de células de 2 L. Prepare as seguintes soluções estoque antes do tempo para o buffer de isolamento mitocondrial (MIB), buffer de sacarose/manitol (SM4), reserva experimental (MIBSM), buffer de ressuspensão (SEM).<ol>
<li>Fazer reserva MIB de 0,5 L: 50mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 1 milímetro DTT, inibidores da protease.</li>
		<li>Fazer reserva de 100 mL SM4: 280 mM de sacarose, manitol 840 mM, 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 1 m M DTT, inibidores da protease.</li>
		<li>Faça 160 mL de tampão MIBSM: 120 mL de tampão MIB + SM4 de 40 mL de tampão.</li>
		<li>Armazenar 200 mL de PBS a 4 ° C.</li>
		<li>Fazer 5 mL SEM tampão: sacarose de 250 mM, 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA.</li>
		<li>Fazer 4 x 10 mL soluções estoque para o gradiente de sacarose em etapas contendo 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA e 60% / 32% 23% e 15% de sacarose, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento de mitocôndrias Nota: É importante trabalhar rapidamente e manter tudo no gelo durante todo o procedimento.</li>
	<li>Precool o nitrogênio cavitação câmara antes da utilização.<ol>
<li>Colher células L 2 x 1 (3-4 x 109 células por tubo de centrifugação) por centrifugação a 1.000 x g durante 7 minutos, 4 ° C.</li>
		<li>Decante o sobrenadante cuidadosamente e ressuspender as células peletizadas rapidamente em 2 x 100 mL de PBS. As células do pool.</li>
		<li>Centrifugar as células ressuspensa em 1.200 x g durante 10 minutos, 4 ° C.</li>
		<li>Decante o sobrenadante cuidadosamente e pesar a pelota (~ 20 g).</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 120 mL de tampão MIB.</li>
		<li>Permitir que as células a inchar agitando suavemente em uma sala fria por 10 min.</li>
		<li>Coloque a câmara de cavitação de nitrogênio no gelo e transferir as células expandidas para a câmara de cavitação de nitrogênio. Adicionar SM4 de 45 mL de tampão (1/3 do volume final de células ressuspensão, cerca de 140 mL, produzindo uma concentração final de manitol sacarose e 210 mM de 70 mM).</li>
		<li>Fixe a câmara de cavitação de nitrogênio e enchê-lo com nitrogênio até que a pressão atinge 500 psi. Feche as torneiras e manter isolados no gelo por 20 min.</li>
		<li>Lentamente, solte a pressão na câmara de cavitação de nitrogênio e coletar o lisado (cerca de 185 mL).</li>
		<li>Centrifugar o material lisado para remover os detritos celulares e núcleos em 800 x g, durante 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recolha o sobrenadante por coloca-lo através da gaze de algodão em um béquer mantido no gelo. Não jogue fora a pelota.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 90 mL de tampão MIBSM (1/2 do volume anterior). Homogeneizar usando Teflon/vidro homogenizacao homogenizador e repetir a centrifugação a 800 x g durante 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recolha o sobrenadante por coloca-lo através da gaze de algodão em um béquer mantido no gelo. Combine esse sobrenadante com o sobrenadante da etapa 2.2.11.</li>
		<li>Centrifugue os sobrenadantes combinados a 1.000 x g durante 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recolha o sobrenadante por coloca-lo através da gaze de algodão em um béquer mantido no gelo.</li>
		<li>Descartar a pelota e centrifugar o sobrenadante contendo mitocôndria bruta a 10.000 x g, durante 15 min, 4 ° C. Nota: A pelota tipicamente consistirá de duas partes: solto e apertado.</li>
		<li>Lave cuidadosamente a pelota solta sem perturbar a porção apertada. Resuspenda o pellet apertado em 10 mL de tampão MIBSM.</li>
		<li>Realize um ensaio de concentração da proteína usando um Kit de ensaio de proteína comercial ou método semelhante. Rendimentos de concentração típica de 2 L, começando a cultura são ~ 2 mg/mL.</li>
		<li>Adicionar 200 unidades de RNase livre DNase e deixar para rodar em um rolo no quarto frio por 20 min misturar uniformemente o DNase para remoção do DNA genômico.</li>
		<li>Centrifugar a 10.000 x g, durante 15 min, 4 ° C e resuspenda o pellet em 2 mL SEM tampão. Homogeneizar suavemente usando um homogeneizador de Teflon/vidro homogenizacao pequena para Ressuspender qualquer restantes agregados. Realize não mais de cinco passagens de altos e baixos para evitar a ruptura. Manter-se no gelo.</li>
		<li>Prepare o gradiente de sacarose em 14 mL SW40 tubos pipetando cuidadosamente 1,5 mL de 60% de sacarose estoque tampão na parte inferior do tubo. Adicione cuidadosamente 4,5 mL de tampão de estoque do sacarose de 32% em cima da banda de 60% sem perturbá-la. Repita com 1,5 mL de tampão de estoque de 23% de sacarose e, novamente, com 1,5 mL de tampão de estoque de 15% de sacarose.</li>
		<li>Carrega toda suspensão mitocondrial (aproximadamente 3 mL) na parte superior do gradiente de sacarose.</li>
		<li>Centrifugue em SW40 rotor no 139, 065 x g durante 60 minutos.</li>
		<li>Recolha cuidadosamente a banda marrom migrar para a interface de 32% e 60% de sacarose utilizando uma pipeta de transferência, normalmente 2-3 mL.</li>
		<li>Snap-congelar as mitocôndrias purificadas em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Mitoribosome preparação
<ol><li>Buffers de necessária Nota: Prepare as seguintes soluções estoque antes do tempo de Lise, coxim/gradiente de sacarose e buffer de ressuspensão.<ol>
<li>Fazer 10 mL de tampão de Lise: 25mm HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM KCl, 50mm MgOAc, 2% polietileno glicol octilfenil éter, 2 mM DTT, inibidores da protease.</li>
		<li>Fazer 10 mL de tampão de coxim sacarose: 1 M de sacarose (34% p/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM KCl, 20mm MgOAc, 1% de polietileno glicol octilfenil éter, 2 mM DTT.</li>
		<li>Fazer 5 mL de tampão de ressuspensão: 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM KCl, 20mm MgOAc, 2mm TDT</li>
		<li>Fazer 15% - 30% de gradientes de sacarose linear com buffer de ressuspensão em tubos de policarbonato de TLS-55.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificação de Mitoribosome<ol>
<li>Descongele as mitocôndrias congeladas no gelo.</li>
		<li>Adicione 2 volumes da lise,por exemplo, adicionar 6 mL de tampão de lise de mitocôndrias de 3 mL. Misture imediatamente o tubo várias vezes por inversão.</li>
		<li>Homogeneizar com um pequeno Teflon/vidro homogenizacao homogenizador para auxiliar a Lise e incubar durante 5-10 min no gelo para completar a Lise.</li>
		<li>Centrifugar o material lisado (cerca de 9 mL) a 30.000 x g por 20 min, 4 ° C para remover o material insolúvel. Decantar o sobrenadante cuidadosamente a pelota e descartar a pelota.</li>
		<li>Repeti a centrifugação a 30.000 x g por 20 min a 4 ° C para garantir a clarificação do líquido sobrenadante. Decantar o sobrenadante cuidadosamente a pelota e descartar a pelota.</li>
		<li>Preparar a almofada de sacarose em TLA 120,2 tubos (ultra claros): almofada de sacarose 0,4 mL por tubo. Prepare um tubo de material lisado por mL.</li>
		<li>Lisados mitocôndrias sobre as almofadas de sacarose de camada: cerca de 1 mL por tubo, resultando em um lisado: proporção de coxim de 2.5: 1.</li>
		<li>Centrifugar a amostra no 231, 550 x g durante 45 minutos no rotor TLA120.2 a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e lavar os tubos sequencialmente com 100 µ l de buffer ressuspensão remover sacarose residual.</li>
		<li>Resuspenda as pelotas em total 100 µ l tampão de ressuspensão.</li>
		<li>Vórtice em velocidade lenta por 30 s para dissolver os restantes agregados e centrifugar a 17.949 x g por 10 min em microtubo centrifugação a 4 ° C.</li>
		<li>Cuidadosamente, recolher o sobrenadante e repetir a centrifugação.</li>
		<li>Medir a absorção de mitoribosome em A260. Nota: O rendimento típico é 7 A260, com A260:280 de umaratio de 1.3.</li>
		<li>Carrega a amostra inteira um tubo gradiente de sacarose linear único. Centrifugue em rotor de TLS-55 no 213, 626 x g durante 120 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Fractionate o gradiente, determinar a densidade óptica em A260 e piscina a fração correspondente ao pico de ácido nucleico juntos. Nota: A típica A260: é umaratio de280 do pico > 1.6.</li>
		<li>Troca o buffer se necessário, usando um método de escolha. Calcular a concentração final usando a conversão 1 A260 = 0,1 mg/mL.</li>
		<li>Snap congelar a amostra mitoribosome purificado no buffer de ressuspensão e loja a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ott, M., Amunts, A., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+mitochondrial+protein+synthesis.">Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis.</a> Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).</li><li>Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+human+mitochondrial+ribosome.">The structure of the human mitochondrial ribosome.</a> Science. 348 (6230), 95-98 (2015).</li><li>Greber, B. 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Sobre a origem do material, começar, apesar da relativamente fácil disponibilidade de tecidos animais que são conhecidos por serem uma fonte rica de mitocôndrias, faz uma escolha popular para mitoribosomes3,5,12, 13, eles não podem ser geneticamente modificados e reproduzidos no laboratório facilmente. Portanto, há uma necessidade clara prática para o desenvolvimento de protocolos envolvendo linhas de células humanas homogénea cultivados. A principal diferença entre os protocolos de lidar com os tecidos e células cultivadas é o modo de Lise e homogeneização. Para pilhas cultivadas crescidas como uma monocamada, um método típico é Teflon/vidro homogenizacao homogeneização14. Os protocolos de preparação original enquanto eficientes foram desenvolvidos para pequenas escalas15. Um reforço direto empregando um homogenizador com capacidade de 500 mL é possível11, no entanto, requer ~ 2 h de trabalho manual para alcançar 80% de Lise. Este introduzido pelo menos três questões: agregação de organelas devido a longos períodos de espera, não homogéneo lise devido ao material pesado afundar até o fundo de um grande navio, aquecimento da amostra devido a necessidade de múltiplos acidentes vasculares cerebrais. Portanto, um método preferível de Lise utiliza a cavitação de nitrogênio, que é baseada na descompressão de um recipiente pressurizado16,17. Neste método, as células são primeiro inchou na sala fria para amolecer as células e torná-los mais suscetíveis a Lise. Como eles são colocados no dispositivo de cavitação de nitrogênio um buffer que contém sacarose e manitol é adicionado a fim de manter uma pressão osmótica que ajudará a manter as mitocôndrias intactas. O dispositivo de cavitação de nitrogênio é então pressurizado com um grande volume de nitrogênio livre de oxigênio, que dissolve as células. Como a pressão é bolhas de nitrogênio lançado fora da solução, resultando em ruptura de membranas celulares. Este método oferece diversas vantagens sobre os métodos de homogeneização mecânicas envolvendo tensões de cisalhamento e a fricção da seguinte forma: 1) é evitar qualquer esforço físico externo nas células; 2) uma expansão adiabática que resfria a amostra, não garante que nenhum dano de calor de organelas; 3) célula componentes são protegidos da oxidação pelo gás inerte nitrogênio; 4) nenhuma alteração do pH do meio de suspensão; 5) o processo é uniforme e reprodutível, pois as mesmas forças disruptivas são aplicadas dentro de cada célula e por toda a amostra; 6) o processo é rápido e pode ser concluído dentro de 20-30 min.
Isolamento de mitocôndrias de culturas de células e tecidos tem sido descrito na literatura extensivamente, e é baseado em um rompimento da pilha gentil seguido por uma série de centrifugações diferenciais. A maioria dos protocolos usados siga os procedimentos originais desenvolvidos no meio o anterior do século18. Enquanto as abordagens bioquímicas básicas estão corretas, há vários equívocos que são destaque na literatura e permaneceu sem ser detectado. Para otimizar o protocolo para mitoribosomes, nós sistematicamente investigado os princípios gerais relatados e concluir que: 1) inclusão de Mg2 + e K+ no buffer não são crucial. Tem sido argumentado que o KCl ajuda a impedir a formação de um gel de19, no entanto, proteínas citoplasmáticas fornecido uma diluição suficiente como descrito em nosso protocolo, este fenômeno não ocorre. Além disso, a exclusão de Mg2 + é útil para reduzir as contaminações por ribossomas citoplasmáticos20; 2) não há nenhuma necessidade de manter a proporção de volume máximo possível de células ao meio para proteger as organelas lançadas do ambiente de hipo-osmótica. O suporte osmótico em nosso protocolo suficientemente é fornecido por buffers contendo sacarose e a diluição das células com o tampão de isolamento de mitocôndrias (etapa 2.II.5) é fundamental para a separação eficiente de organelas em uma preparação em grande escala.
O pH do tampão de isolamento de mitocôndrias perto valores fisiológicos, ou seja, 7,5, que é também o pH ideal para a preparação de mitoribosome a seguir. Agentes ligantes EDTA e EGTA são adicionados para a mídia de isolamento de quelato íons contaminantes, e eles quelato livre magnésio e cálcio, respectivamente. Isso tem sido discutido que a inclusão de EDTA pode levar ao dano da membrana mitocondrial interna14, portanto a concentração é limitada a 1 mM por precaução. Não observamos nenhuma diferença quando usando EDTA 5mm na etapa de purificação final do gradiente de densidade de sacarose.
O protocolo descrito neste documento usa HEK293S-derivado de células humanas para a purificação do mitoribosome. A qualidade da preparação permite a amostra obtida ser investigadas bioquimicamente e estruturalmente a resolução atômica. Isto permite aplicar o método de mitoribosomal humana, traduzindo complexos, conjuntos de controle de qualidade e intermediários de mitoribosomal subunidades. Além disso, uma vez que as células cancerosas ampliaram a capacidade OXPHOS e tradução de proteína mitocondrial elevado em comparação com o tecido do estroma adjacente21, mitoribosomes são alvos de drogas estabelecido para câncer22. Portanto, usar esse protocolo para purificação específica de mitoribosomes na presença de inibidores terá aplicações médicas. Além disso, mutações de mitoribosomal têm sido associadas a doenças mitocondriais hereditárias23. Desde que estas mutações têm efeitos directos sobre a estrutura, a abordagem apresentada aqui será útil para a sua caracterização estrutural. O protocolo pode ser experimentalmente expandido e aplicado a uma variedade de questões científicas, combater a compreensão fundamental da tradução nas mitocôndrias humanas e sua importância médica.

O processo de síntese proteica mitocondrial baseia-se 13 mt-mRNAs essenciais que são traduzidos por um mitoribosome especializado conectado à membrana para formar o núcleo catalítico da cadeia respiratória. Os genomas mitocondriais alterados e a necessidade das proteínas inserir co-translationally a membrana substancialmente moldaram a arquitetura do ribossomos mitocondriais1. Estruturas de alta resolução recentes do mamíferos mitoribosome mostraram uma aparência geral surpreendentemente diferente à contraparte bacteriana2,3. Particularmente, pelo menos 36 proteínas específicas de mitocôndrias são adicionadas, contribuindo ~ 1 MDa massa extra molecular, enquanto mt-rRNA é reduzida pela dupla e altamente divergiram. Os rearranjos estruturais alteram quase todos os recursos funcionais críticos que anteriormente eram geralmente aceite ser universalmente conservadas4.
Novos elementos principais foram adquiridos por cada uma das subunidades mitoribosomal, por exemplo, a subunidade pequena incorporou um mS29 de proteínas GTPase intrínseca em sua região de 'cabeça'. Atividade GTPase não foi encontrada em outros sistemas de tradução, e a estrutura indica que a GTPase pode ter um papel na subunidade montagem2. O rRNA 5S que foi acreditado para ser um marco de todas as subunidades ribossomais conhecidos grandes, formando o núcleo da protuberância da central, está faltando no mitoribosome de mamíferos e tem adotado mt-tRNA-Val como um bloco de construção integral em vez de2. Proibição e colegas mostraram que o mitoribosome suína tem mt-tRNA-Phe e de Val não –5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk e colegas acompanharam estes dados e encontraram que mitoribosomes de pacientes com estabilidade de mt-tRNA-Val comprometido em princípio acomoda mt-tRNA-Phe6,7. Por isso os mitoribosomes incorporaram esses elementos específicos e quais caminhos e trans-fatores são necessários para estes conjuntos originais permanecem desconhecidos.
Em geral, a alta complexidade do mitoribosome humano, novos componentes de proteína e a única associação do mt-tRNA como um elemento estrutural implica o envolvimento de factores específicos de mitocôndrias, como ainda desconhecida trans. No entanto, porque muitas das características deste sistema são exclusivas para as mitocôndrias, que têm sido tradicionalmente difícil investigar8, pouco se sabe sobre o mecanismo molecular e controle de qualidade. Com o desenvolvimento da análise de partícula única de alta resolução por elétron cryo-microscopia (cryo-EM)20, oportunidades surgem agora para estudar exaustivamente os mecanismos moleculares subjacentes a montagem, ação e controle de qualidade do ser humano mitoribosome. Nosso relatório da primeira estrutura da Assembleia mitoribosome humano intermediária fornece o reconhecimento de que é possível visualizar como a mitoribosome humana é formada e mostra que isso cryo-EM é fundamental para a identificação da nova trans- exercício conjunto factores9.
Para expandir sobre este esforço inicial, descrevemos um protocolo rápido para a purificação de mitoribosome humana em detalhes. Na primeira parte do protocolo, é descrito um isolamento em larga escala de mitocôndrias intactas altamente puros de células de suspensão. Este procedimento requer 9 h e pode ser facilmente modificado e adaptado para diferentes tipos e escalas. Um passo significativo neste protocolo é o uso da cavitação de nitrogênio para abrir as células. A segunda parte do protocolo foi desenvolvida para purificar mitoribosomes. Este procedimento requer 7 h e produz uma quantidade suficiente de mitoribosomes para estudos bioquímicos e estruturais. Uso de mitocôndrias puras como matéria-prima oferece os preparativos finais de alta qualidade e pode ser extrapolada para outras macromoléculas mitocondriais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S HCl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin selection reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R25001</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12338026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks with vented cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml conical bottle tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eve automated cell counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>E1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen cavitation cell disruption vessel</td>
			<td>Parr Instruments</td>
			<td>4635, 4639</td>
			<td>safety volume: 40ml, 600ml respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (RNA-free)</td>
			<td>HT Biotechnology</td>
			<td>N401a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon/glass dounce homogenizers</td>
			<td>Cambridge Glassblowing Limited</td>
			<td></td>
			<td>Size designed upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW40 tubes for mitochondria gradient</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344060</td>
			<td>Polypropylene, thin wall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA 120.2 tubes for cushion</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>343778</td>
			<td>Polycarbonate, thick wall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLS-55 tubes for gradient</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>347356</td>
			<td>Ultra-clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Station IP</td>
			<td>BioComp</td>
			<td>153-002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid isolation of the mitoribosome from hek cells

As mitocôndrias humanas possuem um conjunto dedicado de ribossomos (mitoribosomes) que traduzem 13 componentes de proteínas essenciais dos complexos fosforilação oxidativa codificados pelo genoma mitocondrial. Uma vez que todas as proteínas sintetizadas por mitoribosomes humano são proteínas integrais da membrana, mitoribosomes humanas estão amarrados a membrana mitocondrial interna durante a tradução. Comparado ao ribosome citosólica o mitoribosome tem um coeficiente de sedimentação de 55 anos, metade do conteúdo de RNA ribossomal, nenhum rRNA 5S e 36 proteínas adicionais. Portanto, uma maior taxa de proteína-para-RNA e uma estrutura atípica fazem o mitoribosome humano substancialmente diferente de sua contraparte citosólica.
Apesar da importância central a mitoribosome a vida, não há protocolos estavam disponíveis para purificar o complexo intacto de linhas de células humanas. Tradicionalmente, mitoribosomes foram isoladas em tecidos de animais ricos em mitocôndrias que exigia quilogramas de material começar. Nós raciocinou que mitocôndrias em dividir HEK293-derivado em células humanas cultivadas em meio nutriente-rica expressão teriam uma tradução mitocondrial ativa e, portanto, poderiam ser uma fonte adequada de material para os estudos estruturais e bioquímicos da o mitoribosome. Para investigar a sua estrutura, desenvolvemos um protocolo para a purificação em larga escala de mitoribosomes intacto de células HEK. Neste documento, apresentamos um método de cavitação de nitrogênio como um mais rápido, menos trabalhosa e mais eficiente alternativa aos tradicionais métodos baseados em cisalhamento mecânicos para lise celular. Isto resultou em preparações da mitoribosome que permitiram sua determinação estrutural de alta resolução, revelando a composição da mitoribosome humana intacta e seus intermediários de montagem. Aqui, vamos acompanhar este trabalho e apresentar um otimizado e mais cost-effective método exigindo apenas 10 ~10 cultivadas as células HEK. O método pode ser empregado para purificar mitoribosomal humano traduzindo complexos, mutantes, módulos (assemblies) de controle de qualidade e intermediários de mitoribosomal subunidades. A purificação pode ser linearmente escalada dez vezes se for necessário e também aplicado a outros tipos de células.

Células de divisão e altamente viáveis é um ponto de partida essencial para a purificação do ativo mitoribosomes. Este protocolo é aplicável a quaisquer células de suspensão HEK293. Nós estamos usando a linha de celular interna T501, que expressa estàvel um transportador sob controle tetraciclina-inducible. A linha da célula parental é HEK293S-– GnTI células (Tabela de materiais)10. Durante o crescimento celular e expansão no meio de expressão de 293 FreeStyle a densidade mínima deve ser mantida em 1,5 x 106 células/mL, a fim de assegurar uma taxa de duplicação de dois em dois dias, Considerando que a máxima densidade de pilha não deverá exceder 5 ~ x 106 células / mL. ao atingir uma densidade de célula acima de 3 x 106 células/mL, as células são peletizadas e resuspended em uma mídia nova, pré-aquecido em um volume expandido para atingir a densidade celular mínima de 1,5 x 106 células/mL. Esta divisão é executada repetidamente cada 2-3 dias até obter uma massa de células desejadas para o procedimento. A densidade celular final pode variar no intervalo de 3-4.5 x 106 células/mL, e pelo menos 2 L é necessária como ponto de partida para o isolamento de mitocôndrias. A viabilidade celular deve ser mantida em geral > 90% e para a cultura final que é colhida > 95%. Tratamento da cultura celular em grande escala com antibióticos não é recomendado.
Após a série de centrifugações diferenciais, o volume da suspensão mitocondrial após etapa 2.2.20 é tipicamente na faixa de 3 a 5 mL. As mitocôndrias são então separadas do gradiente de sacarose (Figura 1) de outras organelas. O gradiente de sacarose gradual é preparado tal que o volume do gradiente e o volume da suspensão mitocondrial junto encher o tubo de centrifugação ao seu volume máximo. Aqui o cuidado especial é necessário para coletar a banda marrom migrando para os 60% / 32% interface com contaminação mínima de buffer circundante. Isto é importante para manter a proporção de proteína: detergente constante na etapa seguinte da solubilização de mitocôndrias. Recomenda-se avaliar a concentração de proteína mitocondrial nesta fase, e espera-se um rendimento típico de 15-20 mg de proteína mitocondrial total de ~ 1010 cultivadas HEK células.
Ao isolamento de mitocôndrias bem sucedido, eles lysed pela adição de polietileno glicol octilfenil éter, e mitoribosomes são separados através de uma almofada de sacarose (Figura 2). Para separar a substância hidrofóbica membranosa, mitoribosomes, pelotas são resuspended no buffer não contendo detergente e complexos hidrofóbicos são peletizados por centrifugação. Este procedimento é repetido, e o grau de purificação de mitoribosomes é quantificado por A260/280 deumaratio, que deverá ser ~ 1.3. Rendimento típico é 7 A260 de um 2L começando a cultura. Esta fração de mitoribosomal também contém adicionais grandes solúveis mitocondriais complexos, tais como piruvato desidrogenase e glutamato desidrogenase. Para separar os complexos solúveis mitocondriais, mitoribosomes, o sobrenadante é aplicado a um gradiente de densidade de sacarose. Frações que contêm o mitoribosome são geralmente localizadas na parte inferior terceiro do tubo. O fracionamento do gradiente de sacarose, então pode ser feito com um pistão automatizado ou manualmente, cuidadosamente, tomando 50 frações µ l com uma pipeta ou pela parte inferior do tubo de perfuração com uma agulha 21G e recolher as gotas.
Dois mitoribosomal principais populações são identificadas no gradiente: monosome 55S e grande subunidade 39S, como ilustrado na Figura 3 e Figura 4. A presença da fração grande subunidade sugere que as células são colhidas em uma divisória altamente ativo estado11. A relação entre o monosome e grande subunidade picos pode mudar. Um pico adicional localizado próximo à parte inferior pode aparecer em preparações com contaminando os ribossomas citoplasmáticos dos anos 80. Por favor nota que o gradiente de sacarose pequeno usando o balanço balde rotor TLS-55 permite a rápida purificação de ~ 1 mL de mitoribosomes na densidade óptica de 0.4-1 por260. A separação do monosome e picos de grande subunidade pode variar ligeiramente dependendo do fracionamento, mas geralmente há alguma sobreposição dos dois picos. Portanto, quais frações para coletar, e piscina deve ser tomada em consideração para garantir a maior proporção de monosome, ou alternativamente grande subunidade, na amostra. Para estudos de cryo-EM alta resolução, a separação entre as duas populações de mitoribosomal não é absolutamente necessária (devido a operações adicionais em silício ). No entanto, se a melhor separação é necessária, é recomendável usar tubos e correspondente execução vezes maiores.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig1.jpg"> Figura 1 : Purificação da mitocôndria em um gradiente de sacarose. Organelas subcelulares de um 2L começando a cultura foram fraccionadas através de uma série de diferenciais centrifugações, conforme descrito no protocolo, e as mitocôndrias foram separadas em um gradiente descontínuo de sacarose. As mitocôndrias purificadas encontram-se na faixa inferior na interface 32 60%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig2.jpg"> Figura 2 : Purificação de mitoribosomes sobre uma almofada de sacarose. Mitoribosomes brutos de uma cultura de partida 2L são sedimentadas através da almofada de sacarose 1M. As pelotas são resuspended em um buffer livre de detergente, e mitoribosomes são esclarecidos por duas centrifugações, conforme descrito no protocolo. A absorvância é gravada para avaliar a qualidade da preparação e típica A260/280 deumaratio de ~1.3 (painel direito) certifica uma fração rica mitoribosome. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig3.jpg"> Figura 3 : Tudo bem a purificação de mitoribosomes em um gradiente de sacarose. Rastreamento de absorvância de um 2L começando a cultura. Frações são numeradas de cima para a parte inferior do gradiente. Duas populações de mitoribosomal principais são identificadas: grande subunidade (pico 1) e monosome 55S (pico 2). A relação entre as populações pode mudar. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig4.jpg"> Figura 4 : Micrografia eletrônica, classes 2D e reconstrução 3D. Painel esquerdo: uma micrografia com a amostra do pico em uma ampliação calibrado de 1.23 A monosome 2 / pixel. Painel médio: Um pós-processamento de dados representativos (classes 2D) revelando monosomes intactos. Painel direito: reconstrução 3D. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Isolamento rápido do Mitoribosome de células HEK

As mitocôndrias se especializaram ribossomas que divergiram de suas contrapartes bacterianas e citoplasmáticas. Aqui nós mostramos como mitoribosomes pode ser obtido em seu compartimento nativo em células HEK. O método envolve o isolamento de mitocôndrias de células de suspensão e consequente purificação de mitoribosomes.

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

O objetivo geral deste procedimento é purificar ribossomos de mitocôndrias de linhas celulares humanas em larga escala que são suficientes para estudos estruturais. Este método de purificação ribossomista mitocondrial permite a caracterização de complexos de tradução, mutantes, conjuntos de controle de qualidade e intermediários de subunidade mitoribosomal. Estes podem ser usados para responder a perguntas-chave sobre a síntese de proteínas nas mitocôndrias.A principal vantagem dessa técnica é que a cavitação de nitrogênio é usada para a lise celular e apenas 10 a 10 células de cultura são necessárias para preparar mitoribosomes para determinação da estrutura de alta resolução. Essa técnica pode resultar na descoberta de novos componentes da máquina de tradução mitocôndrias e pode ser ainda mais utilizada para o desenvolvimento de novas terapêuticas para o tratamento do câncer. Depois de esculpir células HEK293S de acordo com o protocolo de texto, colde dois tubos de um litro de células por centrifugação a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por sete minutos.Decante cuidadosamente o supernasce e resuspense rapidamente cada pelota em 100 mililitros de PBS. Em seguida, acumule as células e centrifugar a suspensão em 1.200 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, depois de decantar cuidadosamente o supernante, pese a pelota.Em seguida, use 120 mililitros de tampão MIB para resuspendá-lo e deixar as células resuspended para inchar na sala fria por 20 minutos. Transfira as células inchadas para uma câmara de cavitação de nitrogênio pré-resfriada no gelo. Em seguida, adicione 45 mililitros de tampão SM4 às células.Aperte a câmara de cavitação de nitrogênio e encha-a com nitrogênio até que a pressão atinja 500 PSI. Em seguida, feche as torneiras e mantenha-a no gelo por 20 minutos. O método de lise celular de cavitação de nitrogênio previne o estresse físico externo nas células, evita danos térmicos às organelas, e o gás nitrogênio protege as células da oxidação.Além disso, é um método altamente reprodutível. Solte lentamente a pressão na câmara e colete o lysate. Em seguida, para remover os detritos celulares e núcleos, centrifugar o material líssecido a 800 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos.Colete o supernatante despejando-o através de um pedaço dobrado de pano de musselina em um béquer mantido no gelo. Não descarte a pelota. Resuspende a pelota em 90 mililitros de tampão MiBSM.Em seguida, utilizando um vidro Teflon para baixo homogeneizador, homogeneize a amostra e repita a centrifugação a 800 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Mais uma vez, colecione o supernatante derramando-o através de um pedaço dobrado de pano de musselina em um béquer mantido no gelo. Então, combine este supernatante com o primeiro supernatante.Centrifugar a amostra a 1.000 vezes g e quatro graus celsius por 15 minutos. Então, recolha o supernatante como antes. Depois de descartar a pelota, centrifugar o supernacante contendo mitocôndrias brutas a 10.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos.Lave cuidadosamente qualquer pelota solta sem perturbar a porção apertada. Em seguida, use 10 mililitros de tampão MiBSM para resuspensar a pelota apertada. Adicione 200 unidades de DNase livre de RNase à amostra para remover o DNA genômico e girar o tubo em um rolo na sala fria por 20 minutos para digerir uniformemente a amostra.Centrifugar a amostra a 10.000 vezes g e quatro graus celsius por 15 minutos e usar dois mililitros de tampão SEM para resuspensar a pelota. Carregue toda a suspensão mitocondrial em cima do gradiente de sacarose. Depois de girar o gradiente de acordo com o protocolo de texto, usando uma pipeta de transferência, colete cuidadosamente a faixa marrom migrando na interface de 32% e 60% de sacarose.Este protocolo usa cavitação de nitrogênio para quebrar as células. Uma vez dominado, um isolamento em larga escala de mitocôndrias altamente puras e intactas pode ser feito dentro de nove horas e pode ser facilmente modificado e adaptado para diferentes tipos e escalas de células. Depois de descongelar mitocôndrias congeladas no gelo, adicione dois volumes de tampão de lise a três mililitros de mitocôndrias.Misture imediatamente invertendo o tubo várias vezes. Use um pequeno vidro Teflon para baixo homogeneizador para ajudar com a lise e incubar o homogeneizado no gelo por cinco a 10 minutos para completar a reação. Centrifugar o lise a 30.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos para remover o material insolúvel.Em seguida, colecione cuidadosamente o supernasce e descarte a pelota. Repita a centrifugação para garantir o esclarecimento do supernatante. Em seguida, colecione cuidadosamente o supernasce e descarte a pelota.Para cada mililitro de material lysed, prepare uma almofada de sacarose em um tubo ultra claro TLA-120.2 adicionando 0,4 mililitros de almofada de sacarose aos tubos. Camada aproximadamente um mililitro de mitocôndrias líssedas em cada almofada de sacarose resultando em uma relação lysate-cushion de 2,5 para um. Em seguida, centrifugar a amostra em um rotor TLA-120.2 a 231, 550 vezes g e quatro graus Celsius por 45 minutos.Descarte o supernatante e use 100 microliters do tampão de ressuspensão para enxaguar o tubo e remover sacarose residual. Resuspense as pelotas e combine-as em um total de 100 microliters de tampão de resuspensão. Enquanto ressumem a pelota da almofada, é essencial realizar no gelo para evitar o aquecimento da amostra e também evitar espuma da amostra, a fim de garantir a integridade estrutural dos ribossomos mitocondrial.Vórtice a amostra em velocidade lenta por 30 segundos para dissolver os agregados restantes e centrifugar os tubos a 17.949 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Colete cuidadosamente o supernatante e repita a centrifugação. Depois de medir a absorção mitoribosome em A260, carregue toda a amostra em um único tubo linear de gradiente de sacarose.Centrifugar a amostra em um rotor TLS-55 a 213, 626 vezes g e quatro graus Celsius por 120 minutos. Para fracionar o gradiente, puna a parte inferior do tubo e colete a amostra em uma placa de 96 poços. A purificação mitoribosome não deve levar mais de sete horas para uma quantidade suficiente de mitoribosomes.Como demonstrado neste gradiente de sacarose descontínuo, as mitocôndrias purificadas migram para a faixa inferior marrom na interface 32-60%. Após a separação de mitoribosomes de complexos mitocondriais solúveis em um gradiente de sacarose, duas grandes populações mitoribosomais são identificadas, a monosome 55S e a subunidade grande 39S. A presença da grande fração de subunidade sugere que as células são colhidas em um estado ativamente divisória.Este painel mostra um micrografo com a amostra do pico monosome dois em uma ampliação calibrada de 1,23 angstroms por pixel. Aqui estão dados após o processamento inicial revelando monossomos intactos. Finalmente, uma reconstrução 3D monossódia é ilustrada neste painel.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar mitoribosomes humanos intactos para estudos estruturais e bioquímicos. Nosso protocolo oferece preparações finais de alta qualidade que poderiam ser extrapoladas para outras macromoléculas mitocondriais.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Bioquímica

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolamento de F1-ATPase do Protista parasita Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...