Name: rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines
Uploaded: 2021-09-21T13:00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا جميع العاملين في معهد البحوث الطبية الحيوية في جامعة غراتس الطبية على مساعدتهم وتعاونهم، وكذلك كريستوفر جون رايتون على التدقيق في المخطوطة.

وقد وافقت السلطات المحلية على جميع الأساليب الموصوفة هنا (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (وزارة العلوم والبحوث النمساوية)؛ رقم الترخيص: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). تم إيواء الفئران DA الذكور البالغين (10-12 أسبوعا من العمر) في دورة خفيفة / مظلمة 12/12 ساعة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء.
1. إعداد المواد ملاحظة: تجرى الجراحة في ظل ظروف مطهرة. قبل البدء، تأكد من تنظيف جميع الأدوات الجراحية بما في ذلك بت الحفر بمطهر مناسب.
<ol><li>إعداد خليط مخدر: 0.02 ملغم/مل من الفنتانيل، 0.4 ملغم/مل من ميدازولام، و0.2 ملغم/مل من ميدتوميدين (تركيزات نهائية في الخليط). ملاحظة: راجع قسم المناقشة المعنية عن التخدير البديل.</li>
	<li>إعداد خليط الترياق: 0.07 ملغم/مل من فلومازينيل و0.42 ملغم/مل من الاتيباميزول (التركيزات النهائية في الخليط).</li>
	<li>تجميع القسطرة وغطاء القسطرة مع مدخل والمسمار. قطع القسطرة إلى طول 2 مم مع مشرط (الشكل 1). ملاحظة: لا تستخدم مقص لهذا، لأنها ضغط وتشويه شكل دائري المقطع العرضي من طرف القسطرة.</li>
</ol>2. التحضير الجراحي
<ol><li>تخدير الجرذ عن طريق إدارة داخل الصفاق (أي p.) من خليط مخدر (1.5 مل / كجم من وزن الجسم).</li>
	<li>حلق رأس الجرذ بين الأذنين باستخدام ماكينة الحلاقة الكهربائية. ضع بطانية منزلية على الإطار المجسم قبل وضع الحيوان ، لتجنب انخفاض حرارة الجسم طوال الجراحة.</li>
	<li>شل رأس الجرذ في الإطار المجسم باستخدام قضبان الأذن ولوحة اللدغة ، مما يضمن أن الرأس أفقي ومستقر. تحقق من الاستقرار عن طريق الضغط على الجمجمة بإصبع أو ملقط. ملاحظة: قد يتسبب تثبيت فضفاضة وتحديد المواقع غير الأفقية داخل الإطار المجسم انحراف عن الإحداثيات المقصودة.</li>
	<li>ضعي قطرات العين التشحيمية لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة. قم بتغطية العينين بمادة مبهمة لمنع أي تعرض جراحي للضوء.</li>
	<li>تنظيف منطقة حليق بالتناوب تطبيق الإيثانول 70٪ و 10٪ مركب بوفيدوني اليود. ملاحظة: اتبع جميع التدابير الوقائية أثناء الجراحة لتجنب العدوى. تجرى الجراحة في ظل ظروف مطهرة. إذا تم كسر الإنتان ، فيجب استبدال المادة الملوثة.</li>
</ol>3. زرع القسطرة
<ol><li>إجراء شق طولي من حوالي 2 سم من الطول في منتصف الجلد الرأس. استخدام المشابك بلدغ لعقد الجلد قبالة إلى الجانبين. للحصول على نظرة عامة حول هذه الخطوات، راجع الشكل 2.</li>
	<li>إزالة الدم باستخدام قضيب القطن يميل.</li>
	<li>إزالة غشاء المحيط بالجمجمة. تنظيف الأنسجة مع قضيب طرف القطن وفضح عظم الجمجمة. السماح للجمجمة لتجف لمدة دقيقة واحدة تقريبا.</li>
	<li>تحديد المعالم التشريحية، لامبدا، بريغما، وخياطة وسيطة. مع تثبيت الحفر على الإطار المجسم، ضع طرف الحفر في Bregma كنقطة انطلاق. نقل 2 مم الخلفي من Bregma والتحرك ~ 2.4 ملم أفقيا إلى خياطة وسيطة.</li>
	<li>حفر ثقب قطره 0.5 ملم للقسطرة في هذا الموقف. نفخة بلطف بعيدا أي غبار العظام. ملاحظة: من المهم أن تبقى الأم دورا سليمة أثناء الحفر. لضمان ذلك، 1) استخدام الحفر التي يمكن تثبيتها على الإطار المجسمة، 2) فحص الحفرة في كثير من الأحيان أثناء الحفر، و 3) حفر أسفل في خطوات صغيرة- إذا تم تطبيق الكثير من الضغط على الجمجمة، وسوف تستمر في تلميح الحفر، وتلف الدماغ عندما يتم اختراق الجمجمة تماما.</li>
	<li>حفر 3 ثقوب أخرى (~ 1.3 ملم في القطر) مسامير مرساة بضعة ملليمترات بعيدا عن الحفرة الأولى. ضربة بلطف الغبار العظام بعيدا. ملاحظة: حدد مواقع مسامير المرساة التي توفر مساحة كافية لأعلى القسطرة (قطرها 2 مم تقريبا) وقمم المسمار المرساة (~ 1 مم).</li>
	<li>إزالة غبار العظام عن طريق الري مع حوالي 1-2 مل من المحلول الملحي المعقم العازل بالفوسفات (PBS) أو المالحة الفسيولوجية باستخدام حقنة. نظف الجمجمة تشديد مسامير مرساة من قبل 2 - 3 يتحول الكامل. ملاحظة: مسامير مرساة ضرورية لتحقيق الاستقرار في إعداد عن طريق عقد الاسمنت الأسنان، وبالتالي، القسطرة، في مكان. في حين تشديد المسمار مرساة، وضمان أنه ليس من السهل إزالتها عن طريق رفع بلطف صعودا مع ملقط. منذ زرع القسطرة نفسها يسبب صدمة الأنسجة، إصابة دورا إضافية أثناء الحفر ل، أو تشديد مسامير مرساة سيؤدي إلى إصابات متعددة، وربما تعوق المقارنة داخل مجموعة. تشديد مسامير مرساة أولا وإدراج القسطرة الماضي.</li>
	<li>أدخل القسطرة بطول 2 مم من خلال الثقب الأول، عموديا على سطح الجمجمة. في حين لا يزال عقد القسطرة في، وتطبيق القليل من الاسمنت الأسنان والسماح لها بلمرة مع التعرض وجيزة (~ 5 ق) إلى ضوء علاج الأسنان لتحقيق الاستقرار في القسطرة، مما يسمح باستخدام كلتا يديه في الخطوة التالية. تنبيه: أثناء العمل مع ضوء معالجة الأسنان، تجنب النظر مباشرة إلى الطرف، أو في الضوء المنعكس من منطقة التطبيق، حيث أن الكثافة العالية لهذا الضوء يمكن أن تسبب تلف الشبكية. استخدام نظارات واقية مناسبة.</li>
	<li>تطبيق المزيد من الاسمنت الأسنان حول القسطرة، مرساة مسامير، وترسيخ الاسمنت الأسنان مع ضوء علاج الأسنان (~ 15 -30 ق). تأكيد تصلب الاسمنت مع غيض من ملقط.</li>
</ol>4. إغلاق الجرح و استعداء التخدير
<ol><li>أغلق جلد الرأس بخيوط قابلة للتكسير، وقرب القسطرة، والخلفية. ملاحظة: نظرا لأنه سيكون هناك إعداد وعر فوق الجمجمة في نهاية عملية الزرع ، قم بإغلاق الجرح وفقا لذلك. رفع الجلد أكثر من اللازم سيؤدي إلى عدم الراحة للحيوان.</li>
	<li>حقن خليط الترياق تحت الجلد (1.5 مل/كغ من وزن الجسم) باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 26 غرام.</li>
	<li>إعطاء enrofloxacin (2.5٪) عن طريق الحقن تحت الجلد (7.5 ملغ / كجم وزن الجسم) للعلاج بالمضادات الحيوية الوقائية. إعطاء carprofen (1 ملغ / مل؛ 5 ملغ / كغ وزن الجسم) وbuprenorphine (1.2 ملغ / كغ) لتخفيف الألم عن طريق الحقن تحت الجلد.</li>
</ol>5. الرعاية بعد العملية الجراحية والأدوية
<ol><li>إعادة الحيوان إلى القفص المعدل وإبقائه تحت الملاحظة لمدة 1 -3 ساعة ، مع تطبيق ضوء الأشعة تحت الحمراء لتجنب انخفاض حرارة الجسم. مراقبة الحيوان وإعادة وضعه باستمرار كل 5 إلى 10 دقائق حتى التعافي بعد العملية الجراحية. رعاية خاصة لتجنب التعرض المستمر للضوء للعيون حتى الانتعاش.</li>
	<li>كرر enrofloxacin (7.5 ملغ / كغ وزن الجسم) وكاربروفين (1 ملغ / مل؛ 5mg / كجم وزن الجسم) الإدارات عن طريق الحقن تحت الجلد في اليوم التالي للجراحة. البوبرينورفين ليس من الضروري أن يتم تحديثه حيث أن العلاج السابق فعال لمدة 72 ساعة.</li>
</ol>6. إعداد خليط التحصين (في أقرب 14 يوما بعد زرع القسطرة)
ملاحظة: ضع المحاقن على الثلج أثناء إجراء التحضير.
<ol><li>ربط اثنين من 10 مل لوير قفل طرف المحاقن الزجاجية إلى أذرع قصيرة من stopcock 3-way وإغلاق منفذ الثالث مع الذراع الطويلة.</li>
	<li>تأكد من أن الاتصالات آمنة وخالية من التسرب: أضف ما يقرب من 4 مل من برنامج تلفزيوني معقم إلى الحقنة المفتوحة أثناء حمل المكبس 2. إدراج المكبس 1 ودفع كل من المكابس ذهابا وإيابا أثناء التحقق من وجود تسرب. إذا لم يحدث تسرب، تجاهل برنامج تلفزيوني وإزالة المكبس 1 مرة أخرى.</li>
	<li>ماصة 1 مل من IFA و 50 ميكروغرام من rMOG1-125 معا وضبط الخليط إلى حجم نهائي من 2 مل مع برنامج تلفزيوني معقم (درجة الحموضة 7.4) في أنبوب مناسب. ملاحظة: بسبب فقدان مستحلب على نصائح أو جدران المحاقن أثناء التحضير، وإعداد حجم أكبر مما هو مخصص للإدارة. وبالمثل أكثر عملية للتحضير لأكثر من واحد في وقت واحد.</li>
	<li>ضع خليط IFA و rMOGالمخفف 1-125 في الحقنة المفتوحة. إدراج المكبس بلطف مع الحفاظ على ضغط فضفاض على المكبس المعاكس (الشكل 3A).</li>
	<li>استحلاب inoculum عن طريق قيادتها من حقنة واحدة إلى أخرى عن طريق دفع المكابس ذهابا وإيابا، حتى يكون أبيض ولزج(الشكل 3B).</li>
	<li>إصلاح 1 مل لوير قفل حقنة إلى الذراع قصيرة مفتوحة من stopcock 3-way وملئه مع inoculum (الشكل 3C). توزيع جميع الحقن inoculum إلى 1 مل. يبقيه على الجليد حتى الحقن. إدارة الخليط في يوم التحضير.</li>
</ol>7. التحصين
<ol><li>تخدير الفئران مع الايزوفلوران في غرفة (~ 2 دقيقة، مختلطة مع الأكسجين 2 لتر / دقيقة) ومن ثم الحفاظ على التخدير من خلال قناع (مختلطة مع الأكسجين 1.5 لتر / دقيقة).</li>
	<li>حقن 200 ميكرولتر من inoculum تحت الجلد في قاعدة الذيل باستخدام إبرة 21 G. ملاحظة: إدارة الحقن ببطء كما الحل لزج.</li>
</ol>8. تحديد الأجسام المضادة تيترز
<ol><li>سحب ~ 200 ميكرولتر من الدم بعد 4 أسابيع من التحصين من أجل تحديد المضادة لل MOG الثدي الأجسام المضادة.</li>
	<li>معطف آبار لوحة 96 جيدا مع MOG (5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) واحتضانها لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>كتلة لوحة مع 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>احتضان لوحة مع مصل الفئران (1:50) ومعيار لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية. غسل لوحة 3x مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / Polysorbate 20.</li>
	<li>احتضان لوحة مع الفجل peroxidase-المقترنة المضادة للفئران IgG الأجسام المضادة الثانوية (1:10,000). غسل لوحة 3x مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / Polysorbate 20.</li>
	<li>إضافة 100 ميكرولتر من محلول الركيزة peroxidase لكل بئر واحتضانه لمدة 20-30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قياس الكثافة البصرية في الطول الموجي 405 نانومتر وحساب titer الأجسام المضادة من الكثافة البصرية باستخدام منحنى قياسي.</li>
</ol>9. حقن السيتوكين داخل المخ
<ol><li>ضبط طول قنية الموصل (2 مم). (انظر الشكل 4 للاطلاع على خطوات الإعداد).</li>
	<li>ملء حقنة 1 مل مع خليط السيتوكين (500 نانوغرام / ميكرولتر من TNF-ألفا، 300 U/μL من الفئران المؤتلف IFN-غاما في برنامج تلفزيوني عقيم). قم بتوصيل المحاقن بقنية موصل. ملء القنية مع خليط السيتوكين. تجنب أي فقاعات.</li>
	<li>قم بتركيب المحاقن على مضخة الحقن القابلة للبرمجة وبرمجتها لحقن 0.2 ميكرولتر/دقيقة(الشكل 5أ). بدء تشغيل المضخة والحفاظ على العمل من أجل تجنب تشكيل فقاعة الهواء في غيض من القنية. ملاحظة: يجب أن تأخذ سرعة الحقن في الاعتبار القطر الداخلي للمحقنة المحددة المستخدمة؛ وبالتالي، يجب تسجيل قطر المحاقن أثناء إعداد المضخة.</li>
	<li>تخدير الفئران مع isoflurane في غرفة (~ 2 دقيقة، مختلطة مع 2 لتر / دقيقة من الأوكسجين) ومن ثم الحفاظ على التخدير من خلال قناع (مختلطة مع 1.5 لتر / دقيقة من الأوكسجين) (الشكلين 5B و 5C). تطبيق قطرات العين التشحيم كما سيتم تخدير الحيوان لمدة 30 دقيقة على الأقل.</li>
	<li>قم بإزالة غطاء القسطرة بالمدخل. إدراج قنية الموصل في القسطرة والمسمار وتشديد عليه (الشكلين 5D و 5E). ملاحظة: لا تبالغ في إحكامها، لأن هذا سيدمر الطرف العلوي من القسطرة.</li>
	<li>السماح للحقن للمضي قدما لمدة 10 دقيقة (الحجم الإجمالي للحقن يجري 2 ميكرولتر). أوقف المضخة اترك القنية داخل القسطرة لمدة 20 دقيقة للسماح للحجم المحقون بالانشراء الكامل.</li>
	<li>فك قنية الموصل وإزالتها ببطء لتجنب تأثير فراغ.</li>
	<li>إعادة ربط غطاء القسطرة مع مدخل والمسمار عليه. السماح للحيوان للتعافي من التخدير في قفص.</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

طريقتنا تستخدم فئران DA. التكيف مع الفئران من المرجح أن تتطلب استخدام قسطرة أصغر ومسامير. وينبغي أيضا أن يوضع في الاعتبار أن مسار المرض، والاستجابة الالتهابية، ومدى إزالة الميالين قد تختلف عما هو معروض هنا إذا تم استخدام نوع مختلف / سلالة. وقد لوحظت مثل هذه الاختلافات مع نماذج EAE الكلاسيكية باستخدام سلالات مختلفة من الفئران. MOG92-106 من أصل الفئران، على سبيل المثال، أدى إلى EAE التقدمية أو الثانوية الأولية في الفئران A.SW، في حين أنه تسبب في الانتكاس تحويل EAE في الفئران SJL / J46. ولذلك ينبغي استخدام الحيوانات من نفس السلالة. كما تم الإبلاغ عن الاختلافات بين الجنسين في مظهر EAE في مختلف الدراسات السابقة24. وقد يتوقع حدوث مثل هذه الآثار الجنسانية بالنسبة للبروتوكول الموصوف هنا، ومع ذلك لا يزال يتعين التحقق من صحته في تجارب أخرى.
يتم استخدام الإدارة داخل الصفاق (IP) لخليط مخدر يتكون من 0.02 ملغم / مل من الفنتانيل ، و 0.4 ملغ / مل من ميدازولام ، و 0.2 ملغم / مل من ميدتوميدين للتدخل الجراحي. الفئران DA الذكور البالغين وزنها 270 - 300 غرام تتطلب حوالي 0.4 - 0.6 مل من هذا الخليط (أي، ~ 1.5 مل / كجم) للحث على تخدير دائم 60 - 90 دقيقة. بعد الجراحة ، يتم استعداء التخدير عن طريق حقن تحت الجلد من ترياق يتكون من 0.07 ملغ / مل من فلومازينيل و 0.42 ملغم / مل من الاتيباميزول في المالحة الفسيولوجية (0.9٪ NaCl). جرعة من 1 - 1.5 مل / كغ يعادي التخدير في غضون 5 دقائق. بدلا من ذلك ، يمكن السماح للحيوانات بالاستيقاظ تلقائيا عند الغسيل الفسيولوجي من التخدير ، ولكن في هذه الحالة ، يجب إبقاء الحيوانات تحت الملاحظة حتى تصبح واعية تماما.
خيارات التخدير الأخرى المستخدمة في كثير من الأحيان للجراحة الحيوانية، مثل حقن IP من الكيتامين وإكسيلازين47 أو بنتوباربيتال الصوديوم48،أو استنشاق التخدير المتطايرة مثل الإيزوفلوران49 وهالوثان50،ويمكن أيضا النظر في الجراحة المقدمة هنا. ومع ذلك، من الأهمية بمكان اختيار عامل مخدر لا يتعارض مع التدخلات (التدخلات) المقصودة في المصب.
أثناء التطعيم وحقن السيتوكين داخل الرحم ، يتم استخدام 5٪ isoflurane للتخدير. تم إنشاء النموذج الموصوف هنا باستخدام الفئران ، وبالتالي فإن التفاصيل التجريبية المذكورة تنطبق على الفئران على وجه التحديد. تم اختيار إحداثيات زرع القسطرة لتمكين التحليل المتزامن للتغيرات المحتملة للمادة البيضاء (طرف القسطرة في كالوسوم الجسم). في حين يمكن أن تختلف موقع إدخال القسطرة فيما يتعلق بالموقف الأمامي الجانبي، واختيار كبريتوس المركزية يتطلب تجنب الضرر إلى الجيوب الأنفية القوس متفوقة.
وهناك سمة أخرى للطريقة الموصوفة هي إزالة الميالين المكافئ لكل من نصفي الكرة الأرضية ipsi و contralateral hemispheres ، ربما ينتج عن نقل خليط السيتوكين المحقون إلى الفضاء تحت العنكبوتية عن طريق التدفق الفسيولوجي للسائل الخلالي من المناطق القشرية51. وضع الحقن، وليس موقع القسطرة، وبالتالي، يسبب إزالة الميالين في جميع أنحاء قشرة الدماغ، واختيار القشرة الجدارية اليمنى أو اليسرى ينبغي، وبالتالي، أن تكون غير مادية في هذا الصدد.
يستخدم البروتوكول قسطرة 26 G ، وهي صغيرة بما يكفي لتجنب الإصابات الرضية الواسعة وكبيرة بما يكفي لتجنب زيادة معدل انسداد طرف القسطرة على مدار فترة طويلة من التجربة. بالتأكيد، زرع ووجود القسطرة نفسها تسبب تنشيط الفلكية والميكروية، وأيضا في الحيوانات السيطرة تلقي زرع القسطرة فقط. ومع ذلك ، فإن هذا بسيط بالمقارنة مع الحيوانات التي تحقن بالسيتوكين. 43 لتجنب أي تداخل مع التحليلات اللاحقة، استخدمنا القسطرة المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي المصنوعة من البولي إيثر-إيثر كيتون (PEEK).
في الواقع ، يتم إنشاء عمق مماثل من إزالة الميالين في كل من المناطق ipsi - و contralateral مع الطريقة المعروضة. وهذا يعني أن عمق/طول القسطرة قد لا يلعب دورا رئيسيا في نمط ومدى إزالة الميالين في القشرة. لذلك ، يمكن النظر في تعديل طول القسطرة من أجل تقليل حجم الآفة الناجمة عن القسطرة. ومع ذلك، قد يسبب طول القسطرة أقصر بكثير إزالة المزيلين القشرية أقل وضوحا قليلا، في حين أن الإجابة القاطعة لن يتم الحصول عليها إلا من خلال التجارب التي تختبر على وجه التحديد لطول القسطرة.
إحدى مزايا النموذج هي أن القسطرة المزروعة تسمح باختبار العلاجات المحتملة التي تدار على القشرة عن طريق القسطرة للسماح بإعادة الايلين في أو بعد ذروة إزالة الزيلين القشرية القابلة للكشف عن الهستولوجيا (اليوم 15 أو في وقت لاحق) ، بينما في وضع ما قبل المعالجة سيكون هذا بعد التحصين ولكن قبل حقن السيتوكين. ولذلك فإن القرار بشأن الإطار الزمني الذي ستدار فيه العلاجات سيعتمد على مسألة البحث الخاصة والمخدرات ذات الأهمية.
بعد زرع القسطرة، من المهم أن إيواء الحيوانات واحدة في أقفاص تعديل (ويفضل أن تكون أعلى عالية) من أجل تجنب إزالة القسطرة حتىنهاية الدراسة (الشكل 8). قد تفك الحيوانات أيضا غطاء القسطرة بالمدخل ، على الرغم من أن هذا نادرا ما يحدث. يجب ملاحظة الحيوانات يوميا وينبغي استبدال القبعات إزالتها بأخرى طازجة ، لتجنب انسداد طرف القسطرة في حالة عدم وجود مدخل ، وضمان تسليم دقيق إلى parenchyma بعد الحقن داخل المخ. يتم تحصين الحيوانات في أقرب وقت 2 أسابيع بعد زرع القسطرة للسماح للشفاء وإغلاق حاجز الدم في الدماغ.
يجب قياس الثدي المضادة للمصل المضادة للموغ بعد التحصين. وأظهرت تجربة الاستجابة للجرعة أن 5 ميكروغرام من MOG1-125 (في IFA) وفرت تحصينا كافيا في غضون 4 أسابيع في الفئران DA الذكور البالغين. وسيكون التتر الذي تبلغ 5000 ميكروغرام/مل وما فوق كافيا، ولكنه سيعتمد بالتأكيد على عدة عوامل، بما في ذلك إعداد MOG وسلالة الحيوان، وبالتالي سيتعين تحديده بشكل فردي. من المهم تجنب جرعات مستضد عالية بشكل مفرط مما قد يؤدي إلى النمط الظاهري EAE الكلاسيكي مع الأطراف الخلفية المشلولة حتى قبل حقن السيتوكين.
يتم تحصين كل مع 5 ميكروغرام من المايلين المؤتلف oligodendrocyte جليكوبروتين (rMOG1-125)مستحلب في 200 ميكرولتر من Adjuvant فرويند غير مكتملة (IFA). نظرا لأن بعض المستحلب يفقد داخل الحقنة أثناء التحضير ، فمن المستحسن إعداد أكثر من هذه الكمية لكل. استخدمنا موج المؤتلف (1-125 من N-terminus من موج الفئران)، والتي أعرب عنها في الإشريكية القولونية ثم تنقيتها إلى التجانس عن طريق الكروماتوغرافيا chelate، حل في 6 M اليوريا، و dialyzed ضد برنامج تلفزيوني للحصول على إعداد الفسيولوجية52،53. غير أنه يمكن أيضا استخدام هذه الماوغ المتاحة تجاريا.
وتستخدم الاستعدادات مستضد أخرى، مثل MOG1-116،MOG35-55 أو PLP139-151 في نماذج EAE مختلفة، ومن المعروف مستضد والاختلافات سلالة الحيوان للحث على الأنماط الظاهرية مرض متميزة في هذه النماذج20. لم يتم اختبار هذه الاستعدادات مستضد في الفئران DA و, إذا استخدمت في تفضيل لrMOG1-125, قد تحفز على النمط الظاهري المرض أو نتائج الأنسجة تختلف عما هو معروض هنا.
يتم إعداد قنية موصل بنفس طول القسطرة قبل الحقن داخل المخ. ويمكن القيام بذلك عن طريق تجميعها مع القسطرة قالب وقطع عليه إلى نفس الحجم (2 ملم في الطول) (الشكل 4). من المهم أن تكون قنية الموصل خالية من فقاعة الهواء أثناء حقن السيتوكين - لأن حجم الحقن هو 2 ميكرولتر فقط ، حتى فقاعة الهواء الصغيرة في طرف القنية ستقلل بشكل كبير من حجم السائل الذي يتم تسليمه بنجاح إلى الدماغ. ويتحقق ذلك عن طريق الحفاظ على تشغيل المضخة وإدراج القنية فقط عندما يكون هناك قطرة متزايدة من سائل الحقن في الطرف. بعد إدخال القنية ، يتم تثبيت الموصل في القسطرة مع تجنب الإفراط في التصعيد حتى لا يضر الطرف العلوي من القسطرة ، مما سيجعل من الصعب تلخيصه بعد الحقن. تستخدم سرعة حقن 0.2 ميكرولتر/دقيقة لتجنب الصدمات الناجمة عن الحقن. وعلاوة على ذلك، حقن بطيء، جنبا إلى جنب مع فترة انتظار 20 دقيقة بعد الحقن، ويضمن نشر السائل المحقون في السائل الخلالي واستنزاف فعالة في CSF. ثم تتم إزالة القنية ببطء لتجنب تأثير الفراغ.
تتضمن الطريقة المبلغ عنها التدخل الجراحي ، وبالتالي تتطلب من الموظفين القادرين على إجراء جراحة البقاء على قيد الحياة المجسمة. كان يجب على الموظفين الذين على اتصال مباشر مع الحيوانات أن يأخذوا دورات التجارب الحيوانية المناسبة. ويمكن تنفيذ ما تبقى من البروتوكول من قبل أعضاء المختبر المختصين.
وتهدف هذه الطريقة إلى إنتاج إزالة البيلينات الناجمة عن الالتهاب في قشرة الدماغ ولا تستنسخ جميع ميزات مرض التصلب العصبي المتعدد البشري(على سبيل المثال، حدوث آفات المادة البيضاء الالتهابية البؤرية ، والتي هي السمة المميزة لمرض التصلب العصبي المتعدد البشري).

مرض التصلب العصبي المتعدد هو مرض التهابي بوساطة المناعة في الجهاز العصبي المركزي ، والذي يضر في المقام الأول بصحائف المايلين ، ولكنه يؤدي في النهاية إلى فقدان أكسنال وتلف دائم في الخلايا العصبية. مرض التصلب العصبي المتعدد هو المرض الأكثر شيوعا بوساطة المناعة في الجهاز العصبي المركزي مع انتشار يقدر بنحو 2.3 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، وفقا للجمعية الوطنيةلمرض التصلبالعصبي المتعدد 1 ، ويمثل عبئا شخصيا واجتماعيا واقتصاديا كبيرا. ويبلغ متوسط عمر المرض 30 سنة ويؤدي إلى فقدان سنوات الإنتاج عن طريق التسبب في إعاقة شديدة. مرض التصلب العصبي المتعدد غير قابل للشفاء حاليا، وتهدف طرائق العلاج الحالية إلى إدارة الأعراض أثناء الانتكاس الحاد في مرض التصلب العصبي المتعدد الانتكاسي وتعديل مسار المرض لتقليل تكرار الانتكاس عن طريق العلاج المناعي2،3. لم يثبت أي خيار علاجي حتى الآن فعاليته للأنواع التقدمية4، باستثناء تجربة سريرية حديثة للعلاج المستنفد للخلايا B ، والتي ثبت أنها فعالة في مجموعة فرعية من مرضى التصلب المتعدد التقدمي الأولي (PPMS) الذين يعانون من التهاب نشط5. وفي حين تم تحديد عدة عوامل خطر وراثية6 وبيئية محتملة7، فإن مسببات مرض التصلب العصبي المتعدد لا تزال غير معروفة.
يتميز مرض التصلب العصبي المتعدد لويحات كبيرة التهابية إزالة اليليناتينغ في، وإصابات منتشرة إلى، المادةالبيضاء 8،9. وقد ارتبطت الآفات البؤرية بهجوم واسع النطاق بوساطة الخلايا التائية ، وتدمير oligodendrocyte ، وastrogliosis التفاعلي ، والانحطاط المحوري ، مما يؤدي إلى انخفاض الخلايا العصبية الحركية. وقد اكتسبت إزالة المزيلين المادة الرمادية وضمور الاعتراف كسمات الهسهولوجية إضافية من المرض9,10,11. وقد اقترح هذا الأخير للمساهمة في الخلل العصبي والتدهور المعرفي في المرضى12,13. وقد تم التمييز بين ثلاثة أنماط من إزالة الميالين القشرية، وهي 1) اللوكوكرتية، والمتصلة بآفات المادة البيضاء (34٪)، و2) الصغيرة، والحيوية (16٪)، و3) الفرعية (50٪). على عكس آفات المادة البيضاء البؤرية ، تم الإبلاغ عن هذه الآفات المادة الرمادية تفتقر إلى هجوم بوساطة تي الخلية وتتميز بدلا من ذلك بتنشيط microglial تعزيز ، موت الخلايا المبرمج ، وفقدان الخلايا العصبية12.
وحتى الآن، لم يكن من الممكن تلخيص مرض التصلب العصبي المتعدد البشري في نموذج حيواني واحد، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى تعقيد المرض. مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية مرض التصلب العصبي المتعدد، كل محاكاة جوانب مختلفة من مرض الأمراض المسببة للأمراض والتقدم، بدلا من ذلك، وضعت14،15. تحاكي النماذج الحيوانية الحالية ثلاث عمليات أمراض مختلفة: 1) الآفات الالتهابية البؤرية ، 2) إصابة المادة البيضاء المنتشرة ، و3) أمراض المادة الرمادية المنتشرة.
أجريت الدراسات الحيوانية لويحات المادة البيضاء MS في الغالب في نماذج التهاب الدماغ القوارض (EAE). يتم تحصين الحيوانات اختبار بنشاط مع مستحلب يحتوي على مستضد المايلين [عادة ما يكون المايلين oligodendrocyte جليكوبروتين (MOG)16،17، بروتين المايلين الأساسي (MBP)18، أو بروتين بروتيوليبيد (PLP)19] ، جنبا إلى جنب مع adjuvant فرويند كاملة (CFA)20. ويمكن أيضا أن يكون المرض الناجم بشكل سلبي عن طريق نقل بالتبني من الخلايا التائية المايلين محددة21. مسار المرض يعتمد على مزيج سلالة مستضد / الماوس التي يتم استخدامها. MOG35-55 في C57BL/6، على سبيل المثال، يؤدي إلى مرض مزمن أحادي الطور22، في حين PLP139-151 في السويسري جيم لامبرت (SJL) الفئران يؤدي إلى مسار المرض الانتكاس تحويل23 بطريقة خاصة بنوع الجنس24. الجرذ MOG35-55, كذلك, يحفز استجابة الخلية التائية الدماغ, في حين أن الإنسان MOG35-55 يحفز التهاب تعتمد على الخلايا B في C57BL/6 الفئران25. نماذج EAE المختلفة توفر أداة ممتازة لدراسة التهاب بوساطة الخلية في المقام الأول في الحبل الشوكي والمخيخ، ولكن هياكل الدماغ الأمامي مثل القشرة، كالوسوم الجسم، والهياكل تحت القشرية لا تزال بمنأى إلى حد كبير26. لا تنتشر إصابة المادة البيضاء ولا إزالة اليلين المادة الرمادية، وعلاوة على ذلك، تتكرر بشكل كاف في نماذج EAE26،27. وقد تم الإبلاغ عن إزالة المزيل القشرية المرتبطة التعريفي EAE النشطة في marmosets28،29 وفي بعض سلالات الفئران الفرعية لويس ، في الحالة الأخيرة يعزى إلى المجموعات السائدة من الفئة الأولى MHC والفئة الثانية isotypes والاليل30.
نموذج cuprizone31 هو أداة مفيدة لدراسة إزالة المايلين المادة البيضاء المنتشرة وعلم الأمراض المادة الرمادية مع إزالة المايلين واسعة من القشرية, شبه القشرية32, وفرس النهر33 المناطق, فضلا عن كالوسوم الجسم34 وبوتامين caudate35. التسمم Cuprizone، الذي، من حيث المبدأ، يؤدي إلى الخلايا المبرمج الناجمة عن الإجهاد الأيضي من oligodendrocytes، يحاكي بعض خصائص الآفات القشرية إزالة الميالين من أدمغة مرض التصلب العصبي المتعدد مثل تنشيط microglia، astrogliosis، وعدم وجود نسبيا من اختراق الخلايا المناعية الطرفية. عدم وجود الخلايا العصبية الخلايا المبرمج وضمور الثالامي, فضلا عن القرار الكامل لإزالة الميالين مع remyelination قوية لوحظ عند وقف مكملات كيوبريزون الغذائية32, ومع ذلك, الحد من استخدام التسمم cuprizone كنموذج مرض التصلب العصبي المتعدد قبل السريرية. يمكن أيضا أن يسبب إزالة المزيل السامة عن طريق الحقن البؤري لليسوليثيثين أو بروميد الإيثيديوم في مساحات المادة البيضاء36،37، ولكن نادرا ما يتم استخدام هذه الأساليب. نماذج إزالة المزيلات السامة مناسبة بشكل خاص لتحليل الآليات المعقدة لإعادة الايلين ، مثل متطلبات خلايا السلف oligodendrocyte والخلايا الفلكية38،39. يتم توفير معلومات مفصلة عن EAE ونماذج التسمم في استعراضين الأخيرة15،40.
تم تطوير إزالة المايلين الناجم عن السيتوكين في البداية لدراسة آفات المادة البيضاء الشوكية في EAE41. في وقت لاحق ، تم تعديله لدراسة أمراض المادة الرمادية القشرية في MS. Dark Agouti (DA) أو يتم إعداد فئران لويس لأول مرة عن طريق تحصين دون سريري مع MOG1-12542،43 أو MOG1-11644 في المساعد غير المكتمل ل Freund (IFA). على عكس نماذج EAE الكلاسيكية ، لا تظهر هذه الحيوانات الأولية أعراضا سريرية للآفات الالتهابية البؤرية في الحبل الشوكي. بدلا من ذلك ، يتم تحقيق استجابة التهابية وإزالة البيلين في الدماغ في وقت لاحق عن طريق الإدارة داخل الدماغ لخليط السيتوكين المؤيد للالتهابات [عامل نخر الورم ألفا (TNFα) وinterferon gamma (IFNа)] بمجرد أن تصل الحيوانات إلى تتر مستقر من الأجسام المضادة المضادة للموغ في الدم.
دراسات ميركلر وآخرون. 42 وغاردنر وآخرون. 44 وقد أثبتت فعالية التعريفي إزالة المزيلين القشرية تحت الحيوية عن طريق التطعيم MOG دون السريرية وحقن السيتوكين داخل المخ أو تحت العنكبوتية. ومع ذلك، كانت المدة المبلغ عنها لإزالة الميالين قصيرة جدا، وحدث إعادة ايلينية كاملة في 14 يوما أو أقل، مما حد من النافذة لأي اختبار تدخل دوائي. كلا النموذجين، وعلاوة على ذلك، الاستفادة من طريقة حقن مؤلمة، والتي يمكن أن تسبب في حد ذاتها صدمة حقن وانهيار حاجز الدم في الدماغ (BBB) وبالتالي يؤدي إلى تجنيد غير المنضبط من الخلايا الالتهابية في parenchyma. وعلاوة على ذلك، أظهرت كلتا الدراستين إزالة البيلين التي تقتصر على منطقة محدودة، في قشرة ipsilateral، أو في المنطقة المجاورة لموقع حقن السيتوكين.
للتغلب على هذه القيود، زرعنا قسطرة في القشرة الجدارية اليمنى للفئران DA، مع طرف القسطرة الموجود فوق كالوسوم الجسم. للسماح بالشفاء التام لسلامة BBB ، سمح للحيوانات بفترة راحة مدتها أسبوعان بعد زرع القسطرة. وفي وقت لاحق، تم تحصين الفئران دون السريرية مع 5 ميكروغرام من MOG المؤتلف1-125 في IFA. بعد تحقيق مستقرة المضادة للموغ الأجسام المضادة التيتر بعد حوالي 4 أسابيع، تم حقن 2 ميكرولتر من خليط السيتوكين عن طريق القسطرة في غضون 10 دقيقة باستخدام مضخة حقنة قابلة للبرمجة. أثار هذا الإجراء إزالة الزيلين القشرية على نطاق واسع من كل من نصفي الكرة الدماغي ipsi و contralateral في 15 يوما ، مع إعادة ايلين جزئية حوالي 30 يوما بعد حقن السيتوكين43. ويمكن، علاوة على ذلك، أن تكون المراحل المتعددة لإزالة الميالين ناتجة عن الإدارة المتكررة للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات من خلال القسطرة، وضمور الدماغ العالمي، وهي سمة شائعة للأنواع الفرعية التقدمية من مرض التصلب العصبي المتعدد45،يمكن تحريضها في وقت مبكر بعد مرحلة إزالة المايلين الثانية43. والأهم من ذلك، يمكن أيضا استخدام القسطرة المزروعة لاختبار التدخلات الدوائية.
يقدم البروتوكول الموصوف أدناه شرحا مفصلا للخطوات التجريبية لجيل قابل للاستنساخ من إزالة المزيلات القشرية على نطاق واسع في نصفي الكرة الدماغي من فئران DA باستخدام قسطرة داخل الدماغ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Adult male Dark Agouti rats (300 &#177;25 g)&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fentanyl</td>
			<td style="width:267px;">Hameln pharma plus, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">&#160;as Fentanyl-Citrate, 50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Midazolam</td>
			<td style="width:267px;">ERWO Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;">50039017</td>
			<td style="width:267px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Medetomidin&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Orion Pharma, Finland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Flumazenil&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Roche, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">0.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Atipamezol&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Orion Pharma, Finland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10% povidone-iodine complex&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Mundipharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dental cement&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus Kulzer, Germany</td>
			<td style="width:145px;">6603 7633</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Physiological saline solution&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fresenius Kabi, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">P3813</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:267px;">AbbVie, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lubricating eye drops&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Thea Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:269px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:267px;">Merck, Germany</td>
			<td style="width:145px;">1070172511</td>
			<td style="width:267px;">Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">2.5% enrofloxacin</td>
			<td style="width:267px;">Bayer, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Prophylactic antibiotics&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">carprofen</td>
			<td style="width:267px;">Pfizer, USA</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Painkillers, 50 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">P9416</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pentobarbital&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Richter Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">pentobarbital sodium, 400 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Interferon gamma&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PeproTech, USA</td>
			<td style="width:145px;">&#160;400-20</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tumor necrosis factor alfa</td>
			<td style="width:267px;">R&#38;D Systems, USA</td>
			<td style="width:145px;">510-RT-050/CF</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="107">
			<td height="107" style="height:107px;width:269px;">rMOG1-125</td>
			<td style="width:267px;">own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Anti-MOG antibody&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan</td>
			<td style="width:145px;">AS-555157</td>
			<td style="width:267px;">Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Incomplete Freund&#8217;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">&#160;F5506</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan</td>
			<td style="width:145px;">AS-555157</td>
			<td style="width:267px;">Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">A9576</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Peroxidase substrate solution</td>
			<td style="width:267px;">Vector Laboratories, USA</td>
			<td style="width:145px;">SK-45000</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Stereotactic frame&#160;</td>
			<td style="width:267px;">David Kopf Instruments, USA</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Catheters, MRI suitable&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC315GPKXXC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dummy cannulas&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC315DCNSPC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plastic screws, MRI suitable&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8L080X093N01</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Connector cannula&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC313CXSPCC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Screw driver with 2mm tip-size</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill with flexible shaft extension&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Proxxon, Germany</td>
			<td style="width:145px;">NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,&#160;&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill bit, round, 0.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td style="width:145px;">REF310 104 001 001 009</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill bit, twisted, 1.3 mm&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td style="width:145px;">REF350 104 417 364 013</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">BB510</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scalpel handle&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">91003-12</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cotton tip applicator&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Henry Schein Medical, Austria</td>
			<td style="width:145px;">900-3155</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">14101-14, 14088-10&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">11002-12, 11251-35</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bulldog clamps&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">18050-35</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Homoeothermic blanket&#160;</td>
			<td style="width:267px;">TSE systems, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Infrared Lamp</td>
			<td style="width:267px;">Beurer, Germany</td>
			<td style="width:145px;">616.51</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dental curing light&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Guilin Woodpecker Medical, China</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Absorbable suture&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Johnson &#38; Johnson, Belgium</td>
			<td style="width:145px;">V792E</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Programmable syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:267px;">World Precision Instruments, USA</td>
			<td style="width:145px;">AL-1000</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Exam gloves</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical gown</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Electric Shaver</td>
			<td style="width:267px;">Aesculap, Germany</td>
			<td style="width:145px;">GT420</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Volatile anesthetic vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">CV 30-301-D</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:267px;">Air Liquide, Austria</td>
			<td style="width:145px;">19,113</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Volatile anesthesia chamber&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">PS-0347</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Anesthesia mask for rats&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">PS-0307-A</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1 ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Codan, Denmark</td>
			<td style="width:145px;">REF 62.1612</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">26 Gauge needle for injection&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">4657683</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">20 Gauge needle for cytokine injection and immunization&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">4657519</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Luer lock tip glass syringes&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Poulten &#38; Graf, Germany</td>
			<td style="width:145px;">7.140-37</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">3 way stopcock&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Becton Dickinson, Sweden</td>
			<td style="width:145px;">394600</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well plate&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:145px;">442404</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plate reader&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Cole-Parmer, USA</td>
			<td style="width:145px;">EW-1396-00</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">37&#176;C incubator</td>
			<td style="width:267px;">Kendro, Germany</td>
			<td style="width:145px;">50042301</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Micropipettes&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gilson, USA</td>
			<td style="width:145px;">F167350</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines

التصلب المتعدد (MS) هو المرض الأكثر شيوعا بوساطة المناعة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ويؤدي تدريجيا إلى الإعاقة الجسدية والموت ، الناجم عن آفات المادة البيضاء في الحبل الشوكي والمخيخ ، وكذلك عن طريق إزالة الميالين في المادة الرمادية. في حين أن النماذج التقليدية لالتهاب الدماغ التحسسي التجريبي مناسبة للتحقيق في الالتهاب بوساطة الخلية في المادة البيضاء الشوكية والمخيخية ، فإنها تفشل في معالجة أمراض المادة الرمادية. هنا ، نقدم البروتوكول التجريبي لنموذج الفئران الجديد لإزالة الزيلين القشري مما يسمح بالتحقيق في الآليات المرضية والجزيئية التي تؤدي إلى الآفات القشرية. يتم تحريض إزالة الميالين عن طريق التحصين بجرعة منخفضة من بروتين غليكوبروتين المايلين oligodendrocyte (MOG) في المساعد غير المكتمل لفويند يليه تسليم داخل المخ بوساطة القسطرة للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات. القسطرة، وعلاوة على ذلك، تمكن جولات متعددة من إزالة الميالين دون التسبب في صدمة الناجمة عن الحقن، فضلا عن التسليم داخل الدماغ من الأدوية العلاجية المحتملة التي تخضع لتحقيق ما قبل السريرية. الطريقة هي أيضا مواتية أخلاقيا كما يتم التحكم في آلام الحيوانات والضيق أو الإعاقة والحد الأدنى نسبيا. الإطار الزمني المتوقع لتنفيذ البروتوكول بأكمله حوالي 8-10 أسابيع.

يمكن تقييم إزالة المايلين القشرية في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن السيتوكين عن طريق الكيمياء المناعية لبروتين بروتيوبيبيد (PLP) (الشكل 6). الشكل 6A يظهر النشاط المناعي PLP سليمة في اليوم 15 في التحكم المحصنة MOG التي تلقت برنامج تلفزيوني عقيم فقط من خلال القسطرة المزروعة. في اليوم الأول بعد حقن السيتوكين ، يمكن اكتشاف إزالة الميالين بالفعل في الحيوانات التي تستعد MOG ، وإن كان ذلك فقط في المنطقة القريبة من منطقة القسطرة(الشكل 6B). يبقى النشاط المناعي PLP سليما في القشرة الكونترالاتية لمدة يوم واحد بعد حقن السيتوكين. في اليوم الثالث، يمكن ملاحظة زيادة تدريجية في فقدان النشاط المناعي ل PLP، والذي ينتشر في قشرة ipsilateral (الشكل 6C). ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن إزالة المزيل القشرية الكونترالاتية في اليوم 3(الشكل 6D)،ولكن يقتصر بدلا من ذلك إلى المنطقة تحت مسامير مرساة، وربما يرجع ذلك إلى منطقة منخفضة التدفق من السائل الخلالي الناجم عن مسامير مرساة43. غياب ملاحظة مماثلة في الحيوانات التحكم عن طريق الحقن PBS يستبعد إمكانية إزالة الميالين الناجمة عن الصدمة الناجمة عن المسمار مرساة.
بين أيام 9 - 15، يؤثر إزالة الميالين على أجزاء كبيرة من قشرة نصفي الكرة الأرضية(الأرقام 6E، 6F،و 6G). هذا يتزامن مع ملاحظة السلوك البطيء ، على الرغم من دون انخفاض كبير إحصائيا في المهارات الحركية في اختبارالدوارة 43. يتم الحفاظ على إزالة المزيل القشرية لمدة تصل إلى 30 يوما بعد حقن السيتوكين في نصفي الكرة الأرضية(الشكلان 6H و 6I)مع إعادة ايلينين جزئي فقط. ويبين الشكل 6ياء كمية فقدان PLP في المادة الرمادية القشرية بعد حقن السيتوكين داخل المخ. وتجدر الإشارة إلى أن النشاط المناعي ل PLP لم يتم تقييمه بعد فترات أطول من 30 يوما؛ وبالتالي، فإن الحل الفوري لإعادة الإعادة، إن وجد، يبقى أن يقيم بمزيد من التجريب. الإدارة الثانية من خليط السيتوكين من خلال القسطرة المزروعة بعد 30 يوما من نتائج الحقنة الأولى في ضمور الدماغ ملحوظ في اليوم 15(الشكل 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig1.jpg"> الشكل 1: إعداد القسطرة. (A و B) يتم تجميع قنية الدليل والقنية الوهمية (غطاء القسطرة مع مدخل) ثمل. (ج) ثم يتم قطع القسطرة إلى 2 مم في الحجم بمساعدة مشرط. وأظهرت الملاحظة المجهرية أن استخدام المقص لهذا الغرض يشوه الشكل الدائري لطرف القنية، وبالتالي يجب تجنبه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig2.jpg"> الشكل 2: زرع القسطرة. (أ) تبدأ الجراحة بشق طولي وإزالة الغشاء المحيطي. (ب, ج) تظهر هذه اللوحة وضع علامة على مكان القسطرة عند 2 مم من الخلف من بريغما و2.4 مم الجانبي إلى اليمين من خياطة القوس. فضلا عن أماكن للثقوب المخصصة لالمسامير مرساة ثلاثة مع مسافة مناسبة من القسطرة ولامدا. (د)بعد حفر حفرة القسطرة (قطر 0.5 ملم، مع طرف الحفر المستدير) والثقوب مسامير مرساة (1.3 مم قطرها مع طرف الحفر الملتوية)، يتم تشديد مسامير مرساة. (E, F) ثم يتم إدخال القسطرة ويتم تثبيت الإعداد كله مع أسمنت الأسنان البلمرة. (G) يتم خياطة الجرح مع اثنين أو ثلاثة عقدة الأمامي والخلفي للقسطرة. ب = بريغما؛ L = لامبدا; C = القسطرة; S1، S2 و S3 = أماكن للثقوب مسامير مرساة ثلاثة. أشرطة المقياس = 1 سم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig3.jpg"> الشكل 3: إعداد مستحلب rMOG / IFA. (أ) يتم استحلاب خليط rMOG ، PBS ، و IFA عن طريق الضغط على inoculum من حقنة إلى أخرى عن طريق دفع المكابس ذهابا وإيابا ،(ب)حتى يكون أبيض ولزج. (ج)في وقت لاحق، يتم توزيع inoculum إلى 1 مل المحاقن للحقن. 5 ميكروغرام من rMOG يستخدم في 200 ميكرولتر من خليط PBS / IFA لتحصين الفئران سريريا دون واحد; ومع ذلك ، بسبب الخسائر في نصائح وجدران المحاقن أثناء التحضير ، يجب إعداد حجم أكبر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig4.jpg"> الشكل 4: إعداد قنية الموصل. (A - D) هذه اللوحات تظهر كيف يتم تجميع موصل والداخلية مع قنية دليل قالب 2 ملم. (ه) يتم قطع الداخلية إلى نفس حجم قنية دليل بمساعدة مشرط (F) ثم يتم فك دليل القالب. (G) يتم تثبيت الطرف الآخر من قنية الموصل إلى حقنة 1 مل، والتي تحتوي على مزيج الحقن، مع إبرة 20 G. أشرطة المقياس = 3 سم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig5.jpg"> الشكل 5: الحقن داخل الخلايا. (أ) يتم تعديل مضخة حقنة قابلة للبرمجة لسرعة حقن 2 ميكرولتر / دقيقة ، ويتم تركيب حقنة 1 مل مليئة بمزيج السيتوكين (أو برنامج تلفزيوني معقم للضوابط) إلى المضخة. (ب)يتم تخدير الحيوان أولا في الغرفة باستخدام 5٪ isoflurane مع تدفق الأكسجين 2 لتر / دقيقة ثم (C) يتم الحفاظ على التخدير من خلال القناع باستخدام 2.5٪ isoflurane مع تدفق الأكسجين 1.5 لتر / دقيقة. (د)يتم شد غطاء القسطرة مع مدخل (قنية وهمية) قبالة ويتم إدخال قنية الحقن من خلال القسطرة المزروعة. نظرا لأن حجم الحقن صغير جدا ، يجب على المحقق توخي الحذر لتجنب فقاعات الهواء في طرف القنية. لهذا السبب، من المهم أن تبدأ الإدراج أثناء تشغيل المضخة وفقط عندما يكون هناك فقاعة السائل المتزايد في الطرف. حجم إضافي لن يذهب إلى الدماغ على أي حال، كما أنه ينهار على رأس القسطرة قبل الإدراج. (ه) ثم يتم تشديد قنية الموصل، ويتم السماح للمضخة للعمل لمدة 10 دقيقة. بعد 10 دقيقة من الحقن ، يتم إيقاف المضخة ، وتترك القنية في الداخل لمدة 15 - 20 دقيقة للسماح بنشر الحجم المحقون إلى السائل الخلالي. أشرطة المقياس = 5 سم، ما لم يذكر خلاف ذلك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig6.jpg"> الشكل 6: النشاط المناعي PLP في أقسام الدماغ التاجي. (أ) تظهر هذه اللوحة الدماغ التحكم (MOG-primed) مع حقنة PBS (اليوم 15), الذي لا يؤدي إلى إزالة المزيلين القشرية. (ب) في وقت مبكر من اليوم 1 حقن ما بعد السيتوكين، إزالة البيلين واضح في منطقة القسطرة. (ج)لوحظ فقدان أوسع من النشاط المناعي PLP في قشرة ipsilateral في اليوم 3،(D)وكذلك في الجانب المقابل. ويلاحظ فقدان واسع النطاق من النشاط المناعي PLP في نصفي الكرة الأرضية في اليوم 15، كما (ه) هذه اللوحة يظهر قشرة ipsilateral و (F) هذه اللوحة يظهر القشرة الكونترالتيرية. (G)يتم إعطاء لمحة عامة عن نصفي الكرة الأرضية في إظهار الخسارة الواسعة النطاق ل PLP في اليوم 15. في اليوم 30، كما (H) هذه اللوحة يظهر قشرة ipsilateral و (I) هذه اللوحة يظهر لقشرة الكونترالاتال، لا يزال هناك إزالة الزيلين ملحوظا، ولكن أيضا بعض المناطق remyelinated يمكن ملاحظتها. (J)هذه اللوحة يبين كمية إزالة الميالين (PLP خسارة في مم2/ نصف الكرة الأرضية). 1.5 - 2 ميكرومتر تم استخدام أقسام الدماغ التاجية للكشف عن PLP مع MS المضادة PLP مع عامل تخفيف 1:500. كانت المقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين لنوى الخلية. للحصول على معلومات مفصلة عن الكيمياء المناعية، راجع Ucal وآخرون. 43- وعدل الفريق زاي وJ من أوكال وآخرين. 43. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig7.jpg"> الشكل 7: ضمور الدماغ بعد حقن السيتوكين الثاني. (أ) تظهر هذه اللوحة دماغ التحكم (MOG-primed) مع حقنة PBS (اليوم 15). (ب) في اليوم 15 بعد حقن السيتوكين الأول، حقنة ثانية يؤدي إلى ضمور الدماغ في غضون 15 يوما. 1.5 - 2 ميكرومتر تم استخدام أقسام الدماغ التاجية للكشف عن PLP مع MS المضادة PLP مع عامل تخفيف 1:500. كانت المقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين لنوى الخلية. للحصول على معلومات مفصلة عن الكيمياء المناعية، راجع بليكمور37. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig8.jpg"> الشكل 8: أقفاص معدلة لمنع إزالة القسطرة من قبل الحيوان. في الأقفاص القياسية ، تقع مساحة حامل الطعام على الشبكة أقرب إلى قاع القفص ، مما يخلق مساحة ضيقة محفوفة بالمخاطر تزيد من فرصة القسطرة للتشابك مع الشبكة ، وبالتالي إزالتها. لتجنب هذا، يجب تعديل القفص. تم حظر هذه المساحة الضيقة بطائرة شفافة ، مما يسمح بمراعاة الحيوان. يجب إعطاء الطعام داخل القفص في هذه الأقفاص المعدلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig8large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines at JoVE.com

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

يسمح البروتوكول المعروض هنا بإعادة إنتاج مادة رمادية واسعة الانتشار لإزالة الميالين من نصفي الكرة الأرضية القشرية في فئران أغوتي الداكنة الذكور البالغين. وتتألف هذه الطريقة من زرع داخل الدماغ من القسطرة, التحصين دون السريري ضد المايلين oligodendrocyte بروتين غليكوبروتين, وحقن داخل الدماغ من خليط السيتوكين الموالية للالتهابات من خلال القسطرة المزروعة.

نموذج الفئران من إزالة المزيل القشرية الدماغية على نطاق واسع الناجمة عن الحقن داخل الدماغ من السيتوكينات الموالية للالتهابات

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو توليد إزالة البيلين على نطاق واسع من قشرة نصفي الكرة الدماغي في نموذج الفئران باستخدام التحصين دون السريري ضد المايلين oligodendrocyte glycoprotein، تليها حقن الدماغ الفائدة من السيتوكينات من خلال القسطرة المزروعة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أمراض إزالة الميالين الالتهابية في الدماغ، مثل التصلب المتعدد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تولد التهاب تسبب إزالة البيلين المادة الرمادية في قشرة نصفي الكرة الدماغي دون أن يؤدي إلى المقابس المادة البيضاء.تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم أفضل لآليات إزالة المايلين القشرية التي لوحظت في الغالب في الأنواع التدريجية من التصلب المتعدد. لبدء هذا الإجراء، قم بتجميع القسطرة وغطاء القسطرة بالمدخل. بعد ذلك، قطع القسطرة إلى طول ملليمترين مع مشرط.ثم حلق رأس فأر مخدر بين الأذنين باستخدام ماكينة الحلاقة الكهربائية. ضع الجرذ في الإطار المجسم وأمن رأسه باستخدام قضبان الأذن ولوحة العض. تأكد من أن الرأس أفقي وتحقق من استقراره عن طريق الضغط عليه بإصبع أو ملقط.بعد ذلك، ضعي قطرات العين التشحيمية لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة، وغطي العينين بمادة مبهمة لمنع أي تعرض جراحي للضوء. بعد ذلك ، قم بتنظيف منطقة الحلاقة بالتناوب تطبيق 70٪ الإيثانول و 10 ٪ povidone اليود المعقدة. لزرع القسطرة، قم بعمل شق طولي بطول حوالي سنتيمترين على طول خط الوسط.ثم استخدم المشابك بلدغ لعقد الجلد على الجانبين. إزالة الدم باستخدام قضيب طرف القطن. بعد ذلك، قم بإزالة البيريوستوم، وتنظيف الأنسجة باستخدام قضيب طرف القطن، وفضح الجمجمة والسماح لها بالجفاف لمدة دقيقة واحدة تقريبا.بعد ذلك ، حدد المعالم التشريحية ، لامبدا ، البريغما والخياطة الوسيطة. مع الحفر المثبتة على الإطار المجسمة، ضع طرف بت الحفر في bregma كنقطة انطلاق. نقل اثنين ملليمتر الخلفي من bregma، و 2.4 ملليمتر أفقيا إلى خياطة وسيطة.ثم حفر ثقب قطره 0.5 ملليمتر للقسطرة في هذا الموضع. حفر ثلاثة ثقوب أخرى من قطر 1.3 ملليمتر مسامير مرساة بضعة ملليمترات بعيدا عن الحفرة الأولى. إزالة غبار العظام عن طريق الري مع حوالي 1-2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم وتنظيف الجمجمة.في وقت لاحق، تشديد مسامير مرساة من قبل اثنين إلى ثلاثة يتحول الكامل. أدخل قسطرة بطول ملليمترين عبر الثقب الأول عموديا على سطح الجمجمة. في حين لا يزال عقد القسطرة، وتطبيق القليل من الاسمنت الأسنان والسماح لها بلمرة مع التعرض لفترة وجيزة لضوء علاج الأسنان من أجل تحقيق الاستقرار في القسطرة.ثم تطبيق المزيد من الاسمنت الأسنان حول القسطرة، مرساة مسامير، وترسيخ الاسمنت الأسنان مع ضوء علاج الأسنان لمدة 15 إلى 30 ثانية، تأكد من أن تصلب الاسمنت. بعد الزرع، أغلق الجلد بخيوط قابلة للتكسير الأمامي، والخلفي للقسطرة. ثم حقن خليط الترياق تحت الجلد.بعد ذلك، إدارة 2.5٪ enrofloxacin عن طريق الحقن تحت الجلد للعلاج بالمضادات الحيوية الوقائية. أعد الحيوان إلى القفص المعدل وأبقه تحت الملاحظة لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات مع تطبيق ضوء الأشعة تحت الحمراء لتجنب انخفاض حرارة الجسم. كرر علاج enrofloxacin وإدارة carprofen في مليغرام واحد لكل ملليلتر تحت الجلد لتخفيف الألم عن طريق الحقن في اليوم التالي للجراحة.لإعداد خليط التحصين، قم بتوصيل اثنين من المحاقن الزجاجية ذات الحافة السفلية ذات القفل 10 ملليلتر بأذرع قصيرة من stopcock ثلاثي الاتجاه، وإغلاق المنفذ الثالث بالذراع الطويلة. بعد ذلك، ماصة ملليلتر واحد من IFA و 50 ميكروغرام من rMOG معا. وضبط الخليط إلى حجم النهائي من اثنين من ملليلتر مع برنامج تلفزيوني عقيمة.ضع خليط IFA و rMOG المخفف في المحقنة المفتوحة ، ثم أدخل المكبس برفق مع الحفاظ على ضغط فضفاض على المكبس المقابل. استحلاب inoculum عن طريق قيادتها من حقنة واحدة إلى أخرى عن طريق دفع المكابس ذهابا وإيابا حتى يكون أبيض ولزج. بعد ذلك ، قم بإصلاح حقنة قفل أقل ملليلتر واحدة إلى الذراع القصيرة المفتوحة للتوقف الثلاثي وملئها ب inoculum.توزيع جميع الحقن inoculum إلى واحد ملليلتر والاحتفاظ بها على الجليد حتى الحقن. في وقت لاحق، حقن 200 ميكرولتر من خليط IFA و rMOG تحت الجلد في قاعدة الذيل تحت تخدير isoflurane مؤقت باستخدام إبرة قياس 21. لحقن السيتوكين داخل المخ، ضبط طول قنية الموصل إلى ملليمترين.ملء حقنة ملليلتر واحد مع خليط السيتوكين. ثم قم بتوصيل المحقنة بقنية الموصل. بعد ذلك، ملء القنية مع خليط السيتوكين، وتجنب خلق أي فقاعات.ثم، قم بتركيب المحاقن على مضخة الحقن القابلة للبرمجة وبرمجتها لحقن بمعدل 0.2 ميكرولتر في الدقيقة. بدء تشغيل المضخة والحفاظ على العمل من أجل تجنب تشكيل فقاعة الهواء في غيض من القنية. بعد ذلك، قم بإزالة غطاء القسطرة بالمدخل.أدخل قنية الموصل في القسطرة، ثم قم بشدها وشدها. ثم السماح للحقن للمضي قدما لمدة 10 دقائق قبل وقف المضخة. اترك القنية داخل القسطرة لمدة 20 دقيقة للسماح للحجم المحقون بالانشراء الكامل.في وقت لاحق، فك قنية موصل وإزالتها ببطء لتجنب تأثير فراغ. إعادة ربط غطاء القسطرة مع مدخل والمسمار عليه. السماح للحيوان للتعافي من التخدير في قفص.يمكن تقييم إزالة المايلين القشرية في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن السيتوكين عن طريق الكيمياء الهستولوجية المناعية ل PLP. الشكل 6A يظهر سليمة PLP النشاط المناعي في اليوم 15 في التحكم المحصنة moggy التي تلقت برنامج تلفزيوني عقيم فقط من خلال القسطرة المزروعة. في اليوم الأول بعد حقن السيتوكين ، يمكن بالفعل اكتشاف إزالة المايلين في MOG الرئيسية.وإن كان، فقط في المنطقة القريبة من منطقة القسطرة. يبقى النشاط المناعي PLP سليما في القشرة الكونترالاتية بعد يوم واحد من حقن السيتوكين. في اليوم الثالث ، يمكن ملاحظة زيادة تدريجية في فقدان التفاعل المناعي ل PLP ، والذي ينتشر في قشرة ipsilateral.يمكن أيضا اكتشاف إزالة المزيل القشرية الكونترالاتية في اليوم الثالث ، ولكنها تقتصر إلى حد ما على المنطقة الواقعة تحت مسامير المرساة. بين الأيام من 9 إلى 15، يؤثر إزالة المايلين على أجزاء كبيرة من قشرة نصفي الكرة الأرضية. يتم الحفاظ على إزالة الميالين القشرية لمدة تصل إلى 30 يوما بعد حقن السيتوكين في نصفي الكرة الأرضية مع إعادة ايلين جزئيا فقط.الشكل 6J يظهر كمية من فقدان PLP في المادة الرمادية القشرية بعد حقن السيتوكين داخل المخ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد إزالة الميالين من المادة الرمادية باستخدام التحصين تحت السريري ضد بروتينات المايلين، تليها الحقن داخل الدماغ من السيتوكينات من خلال القسطرة المزروعة. هذا النموذج الحيواني يمكن أن تساعد الباحثين في دراسة أنواع التدريجي من التصلب المتعدد، طبقة رمادية المادة إزالة الميالين هو علامة كاملة.القسطرة المزروعة تمكن جولات متعددة من إزالة الميالين أو التسليم بين الخلايا من الأدوية العلاجية المحتملة التي تخضع لتحقيق ما قبل السريرية دون التسبب في صدمة الناجمة عن الحقن.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

التنسيق النموذجي نقص تروية الدماغ عن طريق خياطة اللف انسداد الشريان الدماغي الأوسط في الجرذ

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

تسليم الجينات إلى الدماغ الجرذ بعد الولادة من غير البطين حقن البلازميد وElectroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

حقن الدم ذاتي النزيف الدماغي الداخلي النموذجي لالعفوي في الفئران

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

التجريبية إزالة الميالين وعودة الميالين من الحبل الشوكي الفئران عن طريق حقن البؤري من ليزوليسيتين

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

البصري مستدعى تسجيل المحتملين في نموذج الفئران التجريبية العصب البصري إزالة الميالين

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

إنشاء نماذج الماوس للاضطرابات العصبية التي يسببها فيروس Zika استخدام استراتيجيات حقن Intracerebral: الأجنة والأطفال حديثي الولادة والكبار

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...