Name: rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines
Uploaded: 2021-09-21T13:00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines at JoVE.com

作者要感谢格拉茨医科大学生物医学研究所的所有人员的帮助与合作，以及克里斯托弗·约翰·赖特恩对手稿的校对。

这里描述的所有方法都已得到地方当局的批准（奥地利科学和研究部）：许可证号： 66.010/0132-WF/V/3b/2014）。成年雄性DA大鼠（10-12周大）被安置在12/12小时的光/暗周期，可以免费获得食物和水。
1. 材料准备 注：手术是在无菌条件下进行的。在开始前，请确保所有手术器械（包括钻头）都用适当的消毒剂进行清洁。
<ol><li>准备麻醉混合物：0.02毫克/毫升芬太尼，0.4毫克/mL米达佐兰，0.2毫克/毫升的甲基肌氨酸（混合物中的最终浓度）。 注：请参阅相关 讨论 部分，了解替代麻醉剂。</li>
	<li>准备解毒剂混合物：0.07毫克/毫升氟马泽尼尔和0.42毫克/毫升阿提帕梅索（混合物中最终浓度）。</li>
	<li>用入口和螺丝组装导管和导管盖。用手术刀将导管切成2毫米长（图1）。 注意：不要为此使用剪刀，因为它们挤压和扭曲导管尖端的圆形横截面形状。</li>
</ol>2. 手术准备
<ol><li>麻醉混合物（1.5 mL/kg）的腹内（即p.）管理，对大鼠进行麻醉。</li>
	<li>用电动剃须刀在耳朵之间剃光老鼠的头。在定位动物之前，在立体结构框架上放置一个家用热毯，以避免整个手术过程中体温过低。</li>
	<li>使用耳塞和咬板将鼠头固定在立体结构框架中，确保头部水平稳定。通过用手指或钳子对头骨施加压力来检查稳定性。 注：立体定向帧内的松散固定和非水平定位可能导致偏离预期坐标。</li>
	<li>在手术过程中涂抹润滑眼药水，以防止角膜干燥。用不透明的材料遮住眼睛，防止任何手术光线暴露。</li>
	<li>通过交替使用 70% 乙醇和 10% 的波维酮碘复合物来清洁剃须区。 注意：在手术过程中遵循所有预防措施，避免感染。手术是在无菌条件下进行的。如果麻痹被打破，那么污染的材料必须更换。</li>
</ol>3. 导管植入
<ol><li>在头部皮肤中间做一个长约2厘米的纵向切口。使用斗牛犬夹子将皮肤保持在两侧。有关这些步骤的概述，请参阅图 2。</li>
	<li>使用棉尖施用器去除血液。</li>
	<li>取出头骨腹膜。用棉尖施用器清洁组织，露出头骨骨。让头骨干燥约1分钟。</li>
	<li>识别解剖地标、兰姆达、布雷格玛和中缝合线。将钻头安装在立体战术框架上，将钻头放置在布雷格玛作为起点。从布雷格玛移动 2 毫米后，横向移动 +2.4 mm 到中缝合线。</li>
	<li>在此位置为导管钻一个直径为 0.5 mm 的孔。轻轻吹走任何骨尘。 注：重要的是，杜拉母校在钻探过程中保持完好无损。为了确保这一点，1） 使用可以安装在立体战术框架上的钻头，2） 在钻孔过程中频繁检查孔洞，3） 在小步骤中向下钻孔 - 如果对头骨施加了太大的压力，钻头将继续进入，并在头骨完全穿透时损坏大脑。</li>
	<li>再钻3个孔（直径1.3毫米），使锚螺钉离第一个孔几毫米远。轻轻吹去骨头灰尘。 注意：选择锚螺钉位置，为导管顶部（直径+2 mm）和锚螺钉顶部（+1 mm）提供足够的空间。</li>
	<li>使用注射器用大约 1 - 2 mL 的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或生理盐水灌溉去除骨尘。清洁头骨。将锚螺丝拧紧 2 - 3 个全圈。 注：锚螺丝是必要的，以稳定设置通过举行牙科水泥，从而，导管，到位。在拧紧锚螺丝的同时，通过用钳子轻轻向上抬起来确保它不会轻易拆卸。由于植入导管本身会导致组织创伤，在钻探或拧紧锚螺丝时增加杜拉损伤会导致多处创伤，并可能妨碍组内的可比性。先拧紧锚螺丝，最后插入导管。</li>
	<li>将2毫米长的导管插入第一个孔，垂直于头骨表面。虽然仍然拿着导管，应用一点牙科水泥，让它聚合与一个简短的（+5s）接触牙科固化灯，以稳定导管，允许使用双手在下一步。 警告：在使用牙科固化灯时，避免直接查看尖端或应用区域反射的光线，因为这种光的高强度可能会导致视网膜损伤。使用适当的保护护目镜。</li>
	<li>在导管周围涂抹更多的牙科水泥，固定螺丝，然后用牙科固化灯（+15 - 30s）凝固牙齿水泥。用钳尖确认水泥的硬化。</li>
</ol>4. 麻醉伤口的愈合和对抗
<ol><li>用可重新吸附的缝合线、前部和后部的导管关闭头部皮肤。 注意：由于植入结束时头骨上会有一个凹凸不平的设置，因此要相应地关闭伤口。把皮肤抬起来太多会导致动物不适。</li>
	<li>使用 1 mL 注射器和 26 G 针头皮下注射解毒剂混合物（1.5 mL/kg 体重）。</li>
	<li>通过皮下注射（7.5毫克/千克体重）注射环氧沙星（2.5%）进行预防性抗生素治疗。通过皮下注射，管理卡洛芬（1毫克/毫升;5毫克/千克体重）和丁丙诺啡（1.2毫克/千克）以缓解疼痛。</li>
</ol>5. 术后护理和药物治疗
<ol><li>将动物送回改良后的笼子，并将其观察1-3小时，并应用红外光以避免体温过低。每5至10分钟不断观察和重新定位动物，直到术后恢复。特别小心，避免眼睛不断受到光线照射，直到恢复。</li>
	<li>手术后第二天通过皮下注射重复环丙素（7.5毫克/千克体重）和卡洛芬（1毫克/毫升;5毫克/千克体重）。丁丙诺啡不需要刷新，因为以前的治疗有效72小时。</li>
</ol>6. 免疫混合物的制备（在导管植入后最早14天）
注意：在准备过程中将注射器放在冰上。
<ol><li>将两个 10 毫升 Luer 锁尖玻璃注射器连接到 3 路停止公鸡的短臂上，用长臂关闭第三个出口。</li>
	<li>确保连接安全无泄漏：在打开的注射器中加入约 4 mL 的无菌 PBS，同时保持活塞 2。插入活塞1，并推动两个活塞来回，同时检查泄漏。如果没有泄漏，丢弃 PBS 并再次删除活塞 1。</li>
	<li>皮佩特 1 mL 的 IFA 和 50 μg 的 rMOG1-125 在一起，并调整混合物到 2 mL 与无菌 PBS （pH 7.4） 在合适的管子的最终体积。 注：由于准备过程中注射器尖端或墙壁上的乳液丢失，准备的体积大于预期的管理量。同样，同时为1种以上的动物做准备也更实用。</li>
	<li>将稀释后的 IFA 和 rMOG1-125混合物放入开放式注射器中。轻轻插入活塞，同时保持对相反活塞的松动压力（图3A）。</li>
	<li>通过将活塞来回推动活塞，使其从一个注射器驱动到另一个注射器，直到它变白和粘稠（图3B）。</li>
	<li>修复一个1mL Luer锁注射器到3路停止公鸡的开放短臂，并填补它与接种（图3C）。将所有注射器分发到 1 mL 注射器中。将其放在冰上直到注射。在准备当天管理混合物。</li>
</ol>7. 免疫接种
<ol><li>在室内用异氟烷麻醉大鼠（+2分钟，与氧气混合2 L/分钟），然后通过面罩（与氧气混合1.5升/分钟）维持麻醉。</li>
	<li>使用 21 G 针头在尾部底座皮下注射 200 μL 的阴性。 注：由于溶液粘性，请缓慢地管理注射。</li>
</ol>8. 抗体滴答器的确定
<ol><li>免疫接种后 4 周提取 +200 μL 的血液，以确定抗 MOG 抗体滴答声。</li>
	<li>用 MOG（PBS 中的 5 μg/mL）将 96 井板的井涂上，在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>在室温下，用PBS中1%的牛血清白蛋白（BSA）块板1小时。</li>
	<li>用鼠血清（1：50）孵育板，并在37°C下将其标准为2小时。 用 200 μL 的 PBS/聚苯二醇清洗盘子 3 倍。</li>
	<li>用马萝卜过氧化酶结合抗鼠IgG二级抗体（1：10，000）孵育板。用 200 μL 的 PBS/聚苯二醇清洗盘子 3 倍。</li>
	<li>每口井加入100微升过氧化酶基板溶液，在室温下在黑暗中孵育20-30分钟。</li>
	<li>以 405 nm 波长测量光学密度，并使用标准曲线从光学密度中计算抗体滴答声。</li>
</ol>9. 细胞因子注射
<ol><li>调整连接器管的长度（2 毫米）。（请参阅 图 4 的准备步骤。</li>
	<li>将 1 mL 注射器与细胞因子混合物（TNF-alpha 的 500 ng/μL，无菌 PBS 中的重组鼠 IFN-伽马的 300 U/μL）填充。将注射器连接到连接器管。用细胞因子混合物填充管子。避免任何气泡。</li>
	<li>将注射器安装到可编程注射器泵上，并编程注入 0.2 μL/min（图 5A）。启动泵并保持其工作，以避免在管尖形成气泡。 注：注射速度必须考虑所用特定注射器的内径：因此，注射器直径必须在泵设置期间进行注册。</li>
	<li>在室内用异黄酮麻醉大鼠（+2分钟，与2升/分钟的氧气混合），然后通过面罩（与1.5升/分钟的氧气混合）（图5B 和 5C）维持麻醉。涂抹润滑眼药水，因为动物将麻醉至少30分钟。</li>
	<li>用入口取下导管盖。将连接器管插入导管并拧紧它（图5D和5E）。 注意：不要过度紧张，因为这会破坏导管的上端。</li>
	<li>允许注射进行 10 分钟（注射总容量为 2 μL）。停止泵。将管子留在导管内20分钟，让注射的体积充分扩散。</li>
	<li>拧开连接器罐，慢慢取出，以避免真空效应。</li>
	<li>用入口重新连接导管盖并拧紧它。让动物从笼子里的麻醉中恢复过来。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

我们的方法使用DA大鼠。适应小鼠可能需要使用较小的导管和螺丝。还应记住，如果使用不同的物种/菌株，疾病过程、炎症反应和脱叶程度可能与这里提出的不同。这种差异已经观察到与经典的EAE模型使用不同的小鼠菌株。例如，大鼠起源的MOG92-106 导致A.SW小鼠的原发性渐进或继生EAE，而它诱导SJL/J小鼠46的复发性EAE。因此，应使用相同菌株的动物。EAE表现中的性别差异也报告在各种以前的研究24。对于这里描述的协议来说，这种性别影响的发生很可能是预料之中的，但还有待进一步实验的验证。
麻醉剂混合物的腹膜（IP）管理包括0.02毫克/毫升芬太尼，0.4毫克/mL的米达佐兰，和0.2毫克/毫升的美甲酰胺用于手术干预。体重为270-300克的成年雄性DA大鼠需要大约0.4-0.6mL的这种混合物（即1.5mL/kg），以诱导持续60-90分钟的麻醉。手术后，麻醉通过皮下注射一种解毒剂，包括0.07毫克/毫升的氟苯和0.42毫克/毫升的阿提帕梅佐尔在生理盐水（0.9%NaCl）。剂量为1 - 1.5 mL/kg，在5分钟内对抗麻醉。或者，动物可以在麻醉剂的生理洗净后自发地醒来，但在这种情况下，动物需要被观察，直到他们完全清醒。
动物手术中常用的其他麻醉方案，如氯胺酮和西拉津47 或五巴比妥钠48的IP注射，或吸入挥发性麻醉剂，如异黄烷49 和光环烷50，也可以考虑在这里提出的手术。然而，选择不干扰预期下游干预的麻醉剂至关重要。
在免疫和腹腔细胞因子注射期间，5%异黄素用于麻醉。此处描述的模型是使用大鼠建立的，因此列出的实验细节特别适用于大鼠。选择了导管植入坐标，以便同时分析可能的白质变化（语料库卡洛苏姆中的导管尖端）。虽然导管插入部位可以因前体和横向位置而异，但中央磺化液的选择需要避免对上垂鼻窦的损害。
所述方法的另外一个特点是，无论是叶西半球还是反半球的等效脱叶，可能是由于从皮质区域51的间质流体的生理流动将注入的细胞因子混合物输送到亚拉希诺德空间。因此，注射模式，而不是导管的位置，会导致整个大脑皮层脱叶，因此，选择右或左皮层皮层在这方面应该无关紧要。
该协议使用26G导管，它足够小，以避免广泛的创伤性损伤，大到足以避免在实验的漫长过程中导管尖端堵塞率增加。当然，植入和导管本身的存在会导致星体细胞和微胶质活化，也只接受导管植入的对照动物：然而，与细胞因子注射动物相比，这是次要的。43 为了避免对后续分析有任何干扰，我们使用了由多乙醚醚酮 （PEEK） 制成的与 MRI 兼容导管。
事实上，在 ipsi 和反向区域中，使用呈现的方法创建了类似的分化深度。这意味着导管深度/长度可能不会在皮层脱皮的模式和程度中起主要作用。因此，可以考虑修改导管长度，以减少导管引起的病变大小。然而，导管长度明显缩短可能导致皮质脱位稍微不那么明显，而最终答案只能通过专门测试导管长度的实验获得。
该模型的一个优点是，植入导管允许测试 通过 导管管理到皮层的潜在治疗，允许在组织学上可检测的皮质脱髓（第15天或更晚）的高峰期或之后进行再髓化，而在预处理设置中，这将是在免疫接种后，但在细胞因子注射之前。因此，关于治疗时间框架的决定将取决于特定的研究问题和感兴趣的药物。
导管植入后，重要的是将动物单体安置在经过改良的（最好是高顶）笼子中，以避免导管切除，直到研究结束（图8）。动物也可能用入口拧开导管盖，尽管这种情况很少发生。应每天观察动物，取出的帽应替换为新鲜的，以避免在没有入口时导管尖端堵塞，并确保在腹腔注射后准确输送到帕伦奇马。这些动物最早在植入导管后2周接种疫苗，以便愈合和关闭血脑屏障。
免疫接种后应测量血清抗MOG抗体滴答声。剂量反应实验表明，5微克的MOG1-125（IFA） 在4周内为成年雄性DA大鼠提供了足够的免疫接种。5，000微克/mL及以上就足够了，但肯定取决于几个因素，包括MOG制备和动物菌株，因此，必须单独确定。重要的是要避免过高的抗原剂量可能导致一个经典的 EAE 表型与瘫痪的后肢，甚至在细胞因子注射之前。
每只动物接种5微克重组骨髓细胞糖蛋白（rMOG1-125）乳化在200μL不完整的弗伦德的辅助剂（IFA）。由于一些乳液在制备过程中会丢失在注射器内，因此建议为每只动物准备超过此量的乳液。我们使用重组MOG（1-125从大鼠MOG的N总站），这是在Escherichia大肠杆菌表达，然后被纯化成同质的夹层色谱，溶解在6M尿素，并透析对PBS获得生理准备52，53。但是，可能还会使用商用 MOG。
其他抗原制剂，如MOG1-116，MOG35-55或PLP139-151用于各种EAE模型，抗原和动物菌株的差异已知诱导这些模型20中不同的疾病表型。这些抗原制剂没有在DA大鼠身上测试，如果优先使用rmOG1-125，可能会诱发疾病表型或组织学结果与这里所呈现的结果不同。
在腹腔注射之前，准备了与导管长度相同的连接器管。这可以通过用模板导管组装并切割到相同尺寸（长度为2毫米）（图4）来完成。在细胞因子注射过程中，连接器管不能无气泡，因为注射体积只有2微升，即使是在管尖的微小气泡也会显著减少成功输送到大脑的液体体积。只有当尖端的注射液滴越来越多时，才能保持泵的运行和插入管子。插入管子后，连接器拧到导管上，同时避免过度紧固，以免损坏导管的上端，从而在注射后难以重新盖上。0.2 μL/min 的注射速度用于避免注射引起的创伤。此外，缓慢注射，加上注射后20分钟的等待期，可确保注射液体扩散到间歇性液体中，并有效排入CSF。然后慢慢去除管子以避免真空效应。
报告的方法包括手术干预，因此，要求工作人员能够进行立体定向生存手术。与动物直接接触的人员应参加适当的动物实验课程。协议的其余部分可以由称职的实验室成员执行。
该方法旨在产生炎症触发的脑皮层脱叶，不重现人类MS的所有特征（例如，焦点炎白质病变的发生，这是人类MS的标志）。

MS是CNS的免疫介导，炎症性疾病，主要损害骨髓表，但最终导致轴向丧失和永久神经元损伤。根据国家MS协会1，MS是CNS最常见的免疫介质疾病，估计全世界约有230万人患病，是个人和社会经济的主要负担。疾病发病的平均年龄为30岁，导致严重残疾，导致生产年数的丧失。MS目前是无法治愈的，目前的治疗方式旨在管理复发性MS急性复发期间的症状，并通过免疫调节疗法2，3来改变疾病的疗程，以降低复发频率。除了最近对B细胞耗竭疗法的临床试验外，目前还没有证明对渐进型4的治疗方案有效，该疗法在活跃炎症5的初级渐进MS（PPMS）患者的亚组中被证明是有效的。虽然已经确定了几个潜在的遗传6和环境危险因素7，但MS的病因仍然未知。
MS的特点是大炎症脱叶斑块在，并扩散伤害，白质8，9。焦变与广泛的T细胞介导攻击、寡头细胞破坏、反应性星体胶质疏松和轴向退化有关，导致运动神经元下降。灰质脱皮和萎缩已得到承认，作为该病的其他组织病理特征9，10，11。后者已被建议促成神经功能障碍和认知衰退的患者12，13。皮质脱皮的三种模式已经得到区分，即：i） 白皮质，与白质病变（34%）相邻，ii） 小，近视（16%），和iii）亚皮质（50%）。与焦点白质病变不同，据报道这些灰质病变缺乏T细胞介质攻击，而是具有增强微胶质活化、凋亡和神经元损失12。
迄今为止，还无法在单一动物模型中重新概括人类MS，这主要是由于疾病的复杂性。各种MS动物模型，每个模拟疾病发病机理和进展的不同方面，相反，已经开发了14，15。目前的动物模型模拟三种不同的疾病过程：i） 焦炎病变，ii） 扩散性白质损伤，和 iii） 扩散性灰质病理学。
对MS白质斑块的动物研究大多在啮齿动物脑脊髓炎（EAE）模型中进行。试验动物积极免疫乳液含有骨髓抗原[通常骨髓细胞糖蛋白（MOG）16，17，骨髓基本蛋白（MBP）18，或蛋白蛋白（PLP）19]，以及一个完整的氟德的辅助剂（CFA）20。这种疾病也可以被动地诱发通过采用转移骨髓特异性T细胞21。疾病过程取决于使用的抗原/小鼠菌株组合。例如，在C57BL/6中，MOG 35-55会导致单相慢性病22，而PLP139-151在瑞士吉姆兰伯特（SJL）小鼠导致复发性复发疾病课程23以性别特定的方式24。鼠MOG35-55，进一步诱导脑原性T细胞反应，而人类MOG35-55诱导C57BL/6小鼠25的B细胞依赖性炎症。各种EAE模型提供了一个很好的工具，研究细胞介导炎症主要在脊髓和小脑，但前脑结构，如皮层，语料库卡洛苏姆和皮下结构仍然基本上幸免于26。此外，在 EAE 型号26、27中，既没有扩散的白质损伤，也没有灰质脱化。与活性EAE诱导相关的皮质脱叶已报告在马莫塞特28，29和某些刘易斯鼠子菌株，在后一种情况下归因于MHC一级和II类同位素类型和等位基因30的普遍组合。
茶几模型31是研究弥漫性白质脱叶和灰质病理学的有用工具，具有广泛的皮质、亚皮质32和海马33区域，以及语料库卡洛苏姆34和烧碱普塔门35。Cuprizone中毒，原则上导致寡头细胞代谢应激诱发的凋亡，模仿MS大脑皮质脱髓病变的一些特征，如微胶质激活、天体胶质化和相对缺乏渗透的周围免疫细胞。然而，缺乏神经元凋亡和丘脑萎缩，以及完全解决脱髓与强大的再髓质观察停止饮食杯状素补充剂32，但是，限制了茶杯中毒作为临床前MS模型的使用。有毒脱叶剂也可以由将利索西丁或溴化物注射到白质36、37的白质区引起，但这些方法很少使用。毒性脱髓模型特别适合分析复髓的复杂机制，如寡核细胞祖细胞和星核细胞38，39的要求。关于EAE和醉酒模型的详细信息，在最近两次评论15，40中提供。
细胞因子诱发脱髓最初是为了研究EAE41中的脊髓白质病变而开发的。后来，它被修改为研究皮质灰质病理在M.黑暗阿古提（DA）或刘易斯大鼠首先由亚临床免疫与MOG1-12542，43或MOG1-11644在不完整的弗伦德的辅助（IFA）。与传统的 EAE 模型不同，这些原始动物不会表现出脊髓中焦点炎症病变的临床症状。相反，一旦动物在血液中获得了稳定的抗MOG抗体，大脑中的炎症反应和脱皮随后通过对促炎细胞因子混合物（肿瘤坏死因子α（TNF+）和干扰素伽马（IFN+）的内腔管理来实现。
默克勒 等人的研究。42 和加德纳 等人。44 已通过亚临床 MOG 免疫接种和腹腔内或亚拉氏细胞因子注射证明了亚皮质脱叶诱导的功效。然而，所报告的脱髓期太短，完全再骨髓化发生在14天或更短的时间内，从而限制了任何药理干预测试的窗口。此外，这两种模型都采用创伤性注射模式，这 本身 就可能导致注射创伤和血脑屏障（BBB）崩溃，从而导致炎症细胞不受控制地进入巴伦奇马。此外，这两项研究都表明，除化仅限于有限的区域、益普西拉特皮层或细胞因子注射部位附近。
为了克服这些限制，我们在DA大鼠的右皮层植入导管，导管尖位于体外。为了让BBB完整性完全恢复，允许动物在导管植入后休息2周。随后，这些大鼠在IMO中用5微克重组MOG1-125 进行亚临床免疫接种。大约4周后，在获得稳定的抗MOG抗体滴答声后，使用可编程注射器泵在10分钟内 通过 导管注射了2微升的细胞因子混合物。这个过程在15天内引起ipsi-和反脑半球的皮质脱髓，在细胞因子注射后30天左右出现部分再髓脱髓。此外，多重脱叶阶段可以通过导管反复施用促炎细胞因子来诱导，而全球脑萎缩，一种渐进性MS亚型45的常见特征，最早可能在第二个脱炎阶段43之后诱发。重要的是，植入的导管也可用于测试药理干预。
下文所述协议详细解释了使用内侧导管在DA大鼠的两个大脑半球中可重复产生广泛皮质脱叶的实验步骤。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Adult male Dark Agouti rats (300 &#177;25 g)&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fentanyl</td>
			<td style="width:267px;">Hameln pharma plus, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">&#160;as Fentanyl-Citrate, 50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Midazolam</td>
			<td style="width:267px;">ERWO Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;">50039017</td>
			<td style="width:267px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Medetomidin&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Orion Pharma, Finland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Flumazenil&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Roche, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">0.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Atipamezol&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Orion Pharma, Finland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10% povidone-iodine complex&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Mundipharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dental cement&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus Kulzer, Germany</td>
			<td style="width:145px;">6603 7633</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Physiological saline solution&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fresenius Kabi, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">P3813</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:267px;">AbbVie, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lubricating eye drops&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Thea Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:269px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:267px;">Merck, Germany</td>
			<td style="width:145px;">1070172511</td>
			<td style="width:267px;">Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">2.5% enrofloxacin</td>
			<td style="width:267px;">Bayer, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Prophylactic antibiotics&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">carprofen</td>
			<td style="width:267px;">Pfizer, USA</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Painkillers, 50 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">P9416</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pentobarbital&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Richter Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">pentobarbital sodium, 400 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Interferon gamma&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PeproTech, USA</td>
			<td style="width:145px;">&#160;400-20</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tumor necrosis factor alfa</td>
			<td style="width:267px;">R&#38;D Systems, USA</td>
			<td style="width:145px;">510-RT-050/CF</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="107">
			<td height="107" style="height:107px;width:269px;">rMOG1-125</td>
			<td style="width:267px;">own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Anti-MOG antibody&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan</td>
			<td style="width:145px;">AS-555157</td>
			<td style="width:267px;">Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Incomplete Freund&#8217;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">&#160;F5506</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan</td>
			<td style="width:145px;">AS-555157</td>
			<td style="width:267px;">Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">A9576</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Peroxidase substrate solution</td>
			<td style="width:267px;">Vector Laboratories, USA</td>
			<td style="width:145px;">SK-45000</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Stereotactic frame&#160;</td>
			<td style="width:267px;">David Kopf Instruments, USA</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Catheters, MRI suitable&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC315GPKXXC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dummy cannulas&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC315DCNSPC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plastic screws, MRI suitable&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8L080X093N01</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Connector cannula&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC313CXSPCC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Screw driver with 2mm tip-size</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill with flexible shaft extension&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Proxxon, Germany</td>
			<td style="width:145px;">NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,&#160;&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill bit, round, 0.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td style="width:145px;">REF310 104 001 001 009</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill bit, twisted, 1.3 mm&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td style="width:145px;">REF350 104 417 364 013</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">BB510</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scalpel handle&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">91003-12</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cotton tip applicator&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Henry Schein Medical, Austria</td>
			<td style="width:145px;">900-3155</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">14101-14, 14088-10&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">11002-12, 11251-35</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bulldog clamps&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">18050-35</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Homoeothermic blanket&#160;</td>
			<td style="width:267px;">TSE systems, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Infrared Lamp</td>
			<td style="width:267px;">Beurer, Germany</td>
			<td style="width:145px;">616.51</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dental curing light&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Guilin Woodpecker Medical, China</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Absorbable suture&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Johnson &#38; Johnson, Belgium</td>
			<td style="width:145px;">V792E</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Programmable syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:267px;">World Precision Instruments, USA</td>
			<td style="width:145px;">AL-1000</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Exam gloves</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical gown</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Electric Shaver</td>
			<td style="width:267px;">Aesculap, Germany</td>
			<td style="width:145px;">GT420</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Volatile anesthetic vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">CV 30-301-D</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:267px;">Air Liquide, Austria</td>
			<td style="width:145px;">19,113</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Volatile anesthesia chamber&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">PS-0347</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Anesthesia mask for rats&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">PS-0307-A</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1 ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Codan, Denmark</td>
			<td style="width:145px;">REF 62.1612</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">26 Gauge needle for injection&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">4657683</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">20 Gauge needle for cytokine injection and immunization&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">4657519</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Luer lock tip glass syringes&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Poulten &#38; Graf, Germany</td>
			<td style="width:145px;">7.140-37</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">3 way stopcock&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Becton Dickinson, Sweden</td>
			<td style="width:145px;">394600</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well plate&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:145px;">442404</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plate reader&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Cole-Parmer, USA</td>
			<td style="width:145px;">EW-1396-00</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">37&#176;C incubator</td>
			<td style="width:267px;">Kendro, Germany</td>
			<td style="width:145px;">50042301</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Micropipettes&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gilson, USA</td>
			<td style="width:145px;">F167350</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines

多发性硬化症 （MS） 是中枢神经系统 （CNS） 最常见的免疫介导疾病，由脊髓和小脑的白质病变以及灰质脱髓引起的逐渐导致身体残疾和死亡。虽然实验性过敏性脑脊髓炎的传统模型适合研究脊髓和小脑白质中的细胞介导炎症，但它们不能解决灰质病理问题。在这里，我们提出了一种新的皮质脱叶大鼠模型的实验协议，允许对导致皮质病变的病理学和分子机制进行调查。脱皮是由低剂量骨髓细胞糖蛋白（MOG）免疫引起的，在不完整的Freund的辅助剂中，随后用导管介导的动脉内输送促炎细胞因子。此外，导管可进行多轮脱叶，而不会造成注射引起的创伤，以及进行临床前调查的可能治疗药物的腹腔内输送。由于动物疼痛、痛苦或残疾得到控制且相对较少，这种方法在道德上也是有利的。执行整个协议的预期时间约为8-10周。

细胞因子注射后，可在不同时间点对蛋白质蛋白（PLP）进行免疫造血化学评估（图6）。图6A显示在 MOG 免疫控制动物的第 15 天保持完整的 PLP 免疫反应，该动物仅通过植入导管接收无菌 PBS。在细胞因子注射后的第1天，虽然只能在导管区域附近（图6B），但在MOG的动物中已经可以检测到脱叶。PLP 免疫反应在细胞因子注射后 1 天的逆向皮层中保持不变。在第3天，可以观察到PLP免疫反应的丧失逐渐增加，这种损失在皮层（图6C）中扩散。逆侧皮质脱位也可以在第3天（图6D）检测到，但它相当局限于锚螺丝下方的区域，可能是由于锚螺钉43造成的间质液的低流动区域。在PBS注射的对照动物中缺乏类似的观察，排除了锚螺丝引起的创伤引起的脱叶的可能性。
在9-15天之间，脱叶影响两个半球皮层的很大一部分（图6E、6F和6G）。 这与观察缓慢的行为相吻合，尽管在旋转测试43中运动技能没有统计学上显著下降。皮质脱髓在两个半球（图6H和6I）中持续长达30天的细胞因子注射后，只有部分再髓。图6J显示了在细胞内细胞因子注射后皮质灰质中PLP损失的量化。应当指出，在超过30天的时间内，尚未评估PLP免疫反应：因此，再髓化的即时分辨率（如果有的话）仍有待进一步实验评估。第一次注射后30天通过植入导管对细胞因子混合物进行第二次施用，结果在第15天（图7）出现明显的脑萎缩。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig1.jpg"> 图1：导管的制备（A和B）导管和假管（带入口的导管盖）组装和拧紧。（C） 然后在手术刀的帮助下将导管切成 2 毫米大小。微观观察表明，为此目的使用剪刀会扭曲管尖的圆形，因此必须避免。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig2.jpg"> 图2：导管的植入。（A）手术从纵向切口和切除腹膜开始。（B， C）此面板显示导管的位置标记，从布雷格玛到右侧的 2 毫米后部，从下垂缝合线向右 2.4 mm;以及用于与导管和兰姆达保持适当距离的三个锚螺丝的孔的位置。（D） 钻孔（直径0.5毫米，带圆钻尖）和锚螺钉孔（1.3毫米直径，带扭曲钻尖）后，锚螺丝拧紧。（E， F）然后插入导管，用聚合牙科水泥稳定整个设置。（G） 伤口用两到三个结缝合前导管，后部缝合到导管上。B = 布雷格玛;L = 兰姆达;C = 导管;S1、S2 和 S3 = 三个锚螺丝孔的位置。刻度条 = 1 厘米。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig3.jpg"> 图3：rMOG/IFA乳液的制备。（A ）rMOG、PBS和IVI的混合物通过将活塞来回推动活塞（B）来将接种液从一个注射器压到另一个注射器，直到它变成白色和粘稠。（C） 随后，注射液被分配到1mL注射器中。5微克的rMOG用于200微升的PBS/IFA混合物，以亚临床免疫一只大鼠;但是，由于准备过程中注射器的尖端和壁部出现损失，应准备更大的体积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig4.jpg"> 图4：连接器罐的制备（A-D）这些面板显示了连接器和内部是如何用2毫米大小的模板导引管组装的。（E） 内部被削减到相同的大小作为指南管的帮助下，手术刀（F） 和模板指南然后拧开。（G） 连接器的另一端固定在一个1mL注射器上，该注射器包含注射混合，针头为20G。刻度条 = 3 厘米。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig5.jpg"> 图5： 内脑注射（A） 可编程注射器泵调整为 2 μL/分钟注射速度，1 mL 注射器充满细胞因子混合物（或用于对照组的无菌 PBS）安装在泵上。（B） 动物首先在室内麻醉，使用5%的异黄素，2 L/min氧流，然后（C）麻醉通过面罩持续使用2.5%的异黄酮与1.5升/分钟氧气流。（D） 带入口的导管盖（假管）拧掉，注射管通过植入导管插入。由于注射量非常小，调查人员应谨慎避免在管尖出现气泡。因此，在泵运行期间，只有当尖端的液体气泡增加时，才必须开始插入。无论如何，额外的体积都不会进入大脑，因为它在插入前会在导管顶部分解。（E） 然后连接器管被拧紧，泵可以运行10分钟。注射10分钟后，泵停止，管子留在里面15-20分钟，以便将注射体积扩散到间歇液中。秤杆 = 5 厘米，除非另有说明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig6.jpg"> 图6：冠心脑部分的PLP免疫反应。（A ）这个面板显示一个控制大脑（MOG-primed）与PBS注射（第15天），这不会导致皮质脱位。（B） 早在细胞因子注射后的第一天，导管区域就明显脱皮。（C） 在第3天（D）以及反向侧观察到PLP免疫反应性更广泛的丧失。在第15天观察到两个半球普遍丧失PLP免疫反应，因为（E）这个面板显示益普氏皮层和（F）这个面板显示反向皮层。（G） 概述两个半球显示PLP在第15天普遍损失。在第30天，由于（H）这个面板显示的虹膜皮层和（I）这个面板显示反侧皮层，仍然有显着的脱髓，但也有一些再髓区域可以观察到。（J） 此面板显示脱皮的量化（PLP 损失在 mm2/半球）。1.5 - 2 μm 日冕脑部分用于 PLP 检测，MS 抗 PLP 的稀释因子为 1：500。这些部分被细胞核的血氧素所抵消。有关免疫造血术的详细信息，请参阅 Ucal等人。43.小组G和J从Ucal等人修改。43.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig6large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig7.jpg"> 图7：第二次细胞因子注射后脑萎缩。 （A） 这个面板显示一个控制大脑（MOG-primed）与PBS注射（第15天）。（B） 在第一次细胞因子注射后的第15天，第二次注射可在15天内导致脑萎缩。1.5 - 2 μm 日冕脑部分用于 PLP 检测，MS 抗 PLP 的稀释因子为 1：500。这些部分被细胞核的血氧素所抵消。有关免疫造血化学的详细信息，请参阅布莱克莫尔37。刻度条 = 500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig7large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig8.jpg"> 图8：改良笼子，防止动物切除导管。 在标准笼子中，网格上的食物支架空间位于离笼底更近的地方，从而形成危险的狭窄空间，增加导管与网格缠绕并因此将其移除的机会。为了避免这种情况，必须修改笼子。这个狭窄的空间被透明的平面挡住了，允许动物的观察。食物必须放入这些改良笼子的笼子里。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig8large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines at JoVE.com

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

这里提出的协议允许成年雄性黑阿古提大鼠的皮质半球广泛脱皮。该方法包括导管的内腔植入、骨髓寡细胞糖蛋白的亚临床免疫，以及通过植入导管对促炎细胞因子混合物的内腔注射。

由亲炎细胞因子的内脑注射诱导的广度脑皮质脱叶的鼠模型

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

该程序的总体目标是在大鼠模型中利用对骨髓寡核细胞糖蛋白的亚临床免疫，产生大脑两个半球皮层的广泛脱皮，然后通过植入导管对细胞因子进行兴趣脑注射。这种方法可以帮助回答大脑炎症性脱叶疾病（如多发性硬化症）中的关键问题。该技术的主要优点是，它可以在两个大脑半球的皮层产生炎症引起的灰质脱叶，而不会导致白质塞。这种技术的影响延伸到更好地了解皮质脱叶机制，这是主要观察到的渐进型多发性硬化症。要开始此过程，将导管和导管盖与入口组装。接下来，用手术刀将导管切成两毫米长。然后用电动剃须刀在耳朵之间剃光麻醉老鼠的头。将鼠放在立体结构框架中，使用耳塞和咬板固定其头部。确保头部水平，并通过用手指或钳子对头部施加压力来检查其稳定性。之后，应用润滑眼药水，以防止手术过程中角膜干燥，用不透明的材料覆盖眼睛，以防止任何手术光线暴露。接下来，通过交替使用70%乙醇和10%的碘复合物来清洁剃须区。要植入导管，沿中线进行长约两厘米的纵向切口。然后使用斗牛犬夹子将皮肤保持在两侧。使用棉尖施用器去除血液。之后，取出腹膜，用棉尖施用器清洁组织，露出头骨，让它干燥约一分钟。接下来，确定解剖地标，兰姆达，布雷格玛和内缝合线。将钻头安装在立体战术框架上，将钻头的尖端放置在 bregma 作为起点。将两毫米后背从布雷格玛，和2.4毫米横向到中缝合线。然后，在这个位置为导管钻一个直径为0.5毫米的孔。在离第一个孔几毫米远的地方再钻三个直径为1.3毫米的锚螺钉。用大约一到两毫升的无菌PBS通过灌溉去除骨尘，并清洁头骨。随后，将锚螺丝拧紧两到三个满圈。插入一个两毫米长的导管，穿过垂直于头骨表面的第一个孔。在仍然拿着导管时，涂上一点牙科水泥，让它与牙齿固化灯短暂接触聚合，以稳定导管。然后在导管周围涂上更多的牙科水泥，固定螺丝，用牙科固化灯凝固牙齿水泥约15至30秒，确认水泥硬化。植入后，用可再吸附的缝合线前关闭皮肤，后向导管关闭。然后皮下注射解毒剂混合物。接下来，通过皮下注射2.5%的环丙沙星进行预防性抗生素治疗。将动物送回改良后的笼子，并应用红外光观察一到三个小时，以避免体温过低。重复环丙素治疗，并在手术后的第二天以每毫升一毫克的皮下施用卡洛芬，通过注射缓解疼痛。要准备免疫混合物，将两个 10 毫升的下锁尖玻璃注射器连接到三向停止孔的短臂上，并用长臂关闭第三个出口。接下来，移液器一毫升的IMO和50微克的rmA在一起。并将混合物调整到最后体积为两毫升，并配有无菌 PBS。将稀释后的 IFA 和 rMOG 混合物放入打开的注射器中，然后轻轻插入活塞，同时保持对相反活塞的松动压力。通过将活塞来回推动活塞，直到它变白和粘稠，将活塞从一个注射器驱动到另一个注射器，从而乳化了接种。接下来，将一毫升的下锁注射器固定在三向塞孔的开口短臂上，并填充接种。将所有接种接种液分配到一毫升注射器中，并将其放在冰上直到注射。随后，使用21度针头在临时异黄素麻醉下，皮下注射200微升的ITAI和rmofg混合物。对于细胞因子注射，将连接器管的长度调整到两毫米。用细胞因子混合物填充一毫升注射器。然后，将注射器连接到连接器管。接下来，用细胞因子混合物填充管子，避免产生任何气泡。然后，将注射器安装到可编程注射器泵上，并编程以每分钟 0.2 微升的速度注射。启动泵并保持其工作，以避免在管尖形成气泡。之后，用入口取下导管盖。将连接器管插入导管，拧紧并拧紧它。然后让注射进行10分钟，然后停止泵。将管子留在导管内20分钟，让注射的体积充分扩散。随后，拧开连接器管，慢慢取出，以避免真空效应。用入口重新连接导管盖并拧紧它。让动物从笼子里的麻醉中恢复过来。通过PLP的免疫组织化学注射细胞因子后，可在不同时间点评估皮质脱叶。图6A显示，在植入导管只接受无菌PBS的莫吉免疫控制动物中，第15天有完整的PLP免疫反应。在细胞因子注射后的第一天，在MOG主要动物中已经可以检测到脱叶。尽管如此，只在导管区附近。在细胞因子注射后的某一天，PLP免疫反应在反侧皮层中保持不变。第三天，可以观察到PLP免疫反应性损失的逐渐增加，这种反应在益普氏皮层中扩散。第三天也可以检测到反侧皮质脱位，但它仅限于锚螺丝下方区域。在第9天到第15天之间，脱叶影响两个半球皮层的很大一部分。皮质脱髓在两个半球注射细胞因子后持续长达30天，只有部分再髓。图6J显示了在细胞内细胞因子注射后皮质灰质中PLP损失的量化。观看此视频后，您应该很好地了解如何使用对骨髓蛋白的亚临床免疫来产生灰质脱叶，然后通过植入导管进行细胞因子的细胞因子的内脑注射。这种动物模型可以帮助研究人员研究渐进型多发性硬化症，层灰质脱皮是一个整体标记。植入导管可进行多轮脱皮或内膜间输送，进行临床前调查，而不会造成注射引起的创伤。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

焦距脑缺血模型大鼠大脑中动脉的血管内缝合闭塞

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

科研

神经科学

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

基因传递到产后大鼠脑非心室质粒注射和电穿孔

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

自体血液的注入模型小鼠自发性脑出血

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

二层共培养小学的大鼠皮层神经元和神经胶质

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

新生小鼠脑侧脑室注射病毒的持续和广泛的神经元传导

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

实验脱髓鞘和小鼠脊髓髓鞘再生由溶血卵磷脂的焦点注射

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

在实验视神经脱髓鞘模型大鼠视觉诱发电位记录

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

利用双光子显微镜的艾滋病毒引起的神经炎症的小鼠模型脑血管结构的量化

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

大鼠皮层神经元丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）泪点的量化

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

应用脑注射策略建立小鼠 Zika 病毒诱发神经系统疾病模型: 胚胎、新生儿和成人

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...