Name: rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines
Uploaded: 2021-09-21T13:00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לכל אנשי המכון למחקר ביו-רפואי באוניברסיטה הרפואית גראץ על עזרתם ושיתוף הפעולה, כמו גם כריסטופר ג'ון רייטון על הגהת כתב היד.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הרשויות המקומיות (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (משרד המדע והמחקר האוסטרי); מספר רישיון: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). חולדות DA זכר מבוגר (10 - 12 שבועות של גיל) שוכנו במחזור 12/12 שעות אור / כהה עם גישה חופשית למזון ומים.
1. הכנה חומרית הערה: הניתוח מתבצע בתנאים אספטיים. לפני ההתחלה, ודא כי כל המכשירים הכירורגיים כולל המקדחות מנוקים עם חומר חיטוי מתאים.
<ol><li>הכן תערובת הרדמה: 0.02 מ"ג / מ"ל של פנטניל, 0.4 מ"ג / מ"ל של midazolam, ו 0.2 מ"ג / מ"ל של מדטומידין (ריכוזים סופיים בתערובת). הערה: עיין בסעיף הדיון המתאים לקבלת הרדמה חלופית.</li>
	<li>הכן תערובת נוגדנים: 0.07 מ"ג / מ"ל של פלומזניל ו 0.42 מ"ג / מ"ל של atipamezole (ריכוזים סופיים בתערובת).</li>
	<li>להרכיב את הצנתר ואת כובע הקטטר עם המפרצון ואת הבורג. חותכים את הקטטר לאורך של 2 מ"מ עם אזמל(איור 1). הערה: אין להשתמש במספריים עבור זה, שכן הם לסחוט ומעוות את הצורה החתך המעגלי של קצה הקטטר.</li>
</ol>2. הכנה כירורגית
<ol><li>מרדים את החולדה על ידי ניהול תוך-פריתוניאלי (i.p.) של תערובת ההרדמה (1.5 מ"ל / קילוגרם של משקל גוף).</li>
	<li>לגלח את הראש של החולדה בין האוזניים באמצעות מכונת הגילוח החשמלית. מניחים שמיכה הומיאותרמית על המסגרת הסטריאו-טסטרואקטיבית לפני מיקום החיה, כדי למנוע היפותרמיה לאורך כל הניתוח.</li>
	<li>לשתק את ראש החולדה במסגרת הסטריאו-טקית באמצעות מוטות האוזניים וצלחת הנשיכה, מה שמבטיח שהראש אופקי ויציב. בדוק את היציבות על ידי הפעלת לחץ על הגולגולת עם אצבע או מלקחיים. הערה: קיבוע רופף ומיצוב לא אופקי במסגרת הסטריאוטקטית עלולים לגרום לחריגה מהקואורדינטות המיועדות.</li>
	<li>יש למרוח טיפות עיניים משמנות כדי למנוע יובש בקרנית במהלך הניתוח. לכסות את העיניים עם חומר אטום כדי למנוע כל חשיפה לאור כירורגי.</li>
	<li>נקה את האזור המגולח על ידי לסירוגין היישום של 70% אתנול ו 10% קומפלקס פוידון-יוד. הערה: בצע את כל אמצעי הזהירות במהלך הניתוח כדי למנוע זיהום. הניתוח מתבצע בתנאים אספטיים. אם אספסיס שבור, אז החומר המזוהם צריך להיות מוחלף.</li>
</ol>3. השתלת קטטר
<ol><li>לעשות קיסם אורך של כ 2 ס"מ של אורך באמצע העור הראש. השתמש מלחציים בולדוג להחזיק את העור בצדדים. לקבלת סקירה כללית של שלבים אלה, ראו איור 2.</li>
	<li>הסר את הדם באמצעות אפליקטור כותנה.</li>
	<li>הסר את פריוסטיום הגולגולת. נקו את הרקמה עם אפליקטור קצה הכותנה וחשפו את עצם הגולגולת. אפשר לגולגולת להתייבש במשך כ 1 דקות.</li>
	<li>זהה את ציוני הדרך האנטומיים, למבדה, ברגמה והתפירה המודילית. כאשר המקדחה מותקנת על המסגרת הסטריאו-טסטרואטקטית, מקם את קצה המקדחה בברזמה כנקודת ההתחלה. מעבירים 2 מ"מ אחורי מהברזמה ומעבירים כ-2.4 מ"מ לרוחב לתבל המהודל.</li>
	<li>לקדוח חור בקוטר 0.5 מ"מ עבור הקטטר במצב זה. בעדינות לנפח כל אבק עצם. הערה: חשוב כי dura mater נשאר שלם במהלך הקידוח. כדי להבטיח זאת, 1) השתמש במקדחה שניתן להתקין במסגרת הסטריאוטקטית, 2) בדוק את החור לעתים קרובות במהלך הקידוח, ו -3) להסתעף במדרגות קטנות - אם מופעל לחץ רב מדי על הגולגולת, קצה המקדחה ימשיך לתוך, ויפגע במוח כאשר הגולגולת חודרת במלואה.</li>
	<li>מקדחה 3 חורים נוספים (קוטר של כ-1.3 מ"מ) עבור ברגי העוגן במרחק של כמה מילימטרים מהחור הראשון. לפוצץ בעדינות אבק עצם משם. הערה: בחר מיקומי בורג עוגן המספקים מספיק מקום לראש הקטטר (קוטר של ~ 2 מ"מ) וצמרות בורג העוגן (~ 1 מ"מ).</li>
	<li>הסר את אבק העצם על ידי השקיה עם סביב 1 - 2 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חוצץ פוספט (PBS) או מלוחים פיזיולוגיים באמצעות מזרק. תנקה את הגולגולת. הדקו את ברגי העוגן ב-2-3 סיבובים מלאים. הערה: ברגי העוגן נחוצים כדי לייצב את ההקמה על ידי החזקת המלט הדנטלי, ובכך, את הקטטר, במקום. תוך הידוק בורג עוגן, ודא כי הוא לא ניתן להסרה בקלות על ידי הרמה בעדינות כלפי מעלה עם מלקחיים. מכיוון שהשתלת הצנתר עצמו גורמת לטראומה ברקמות, פגיעה נוספת של דורה במהלך הקידוח, או הידוק ברגי העוגן יובילו לפציעות טראומטיות מרובות, ואולי יפגעו בהשוואה בתוך קבוצה. הדקו תחילה את ברגי העוגן והכניסו את הקטטר אחרון.</li>
	<li>הכנס את הצנתר באורך 2 מ"מ דרך החור הראשון, מאונך אל פני הגולגולת. בעוד עדיין מחזיק את הקטטר, להחיל קצת מלט דנטלי ולתת לו פילמור עם חשיפה קצרה (~ 5 s) לאור ריפוי השיניים כדי לייצב את הקטטר, המאפשר את השימוש בשתי הידיים בשלב הבא. אזהרה: בעת עבודה עם אור ריפוי שיניים, הימנע מלהסתכל ישירות על הקצה, או על האור משתקף מאזור היישום, כמו העוצמה הגבוהה של אור זה יכול לגרום נזק ברשתית. השתמש במשקפי מגן מתאימים.</li>
	<li>יש למרוח יותר מלט דנטלי סביב הצנתר, לעגן את הברגים ולחזק את הבטון הדנטלי עם אור ריפוי השיניים (~15 - 30). אשר את התקשות המלט עם קצה של מלקחיים.</li>
</ol>4. סגירת הפצע ואנטגוניזציה של הרדמה
<ol><li>סוגרים את עור הראש עם תפרים הניתנים למיחזור, הקדמי והאחוריים לקטטר. הערה: מכיוון שתהיה הגדרת מהמורות מעל הגולגולת בסוף ההשתלה, בצע את סגירת הפצע בהתאם. הרמת העור יותר מדי תגרום לאי נוחות עבור החיה.</li>
	<li>הזריקו את תערובת הנוגדן באופן תת עורי (1.5 מ"ל/ק"ג משקל גוף) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 G.</li>
	<li>יש לתת enrofloxacin (2.5%) על ידי הזרקה תת עורית (7.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) לטיפול אנטיביוטי מניעתי. יש לנהל את carprofen (1 מ"ג/מ"ל; 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ובופרנורפין (1.2 מ"ג/ק"ג) לשיכוך כאבים על ידי הזרקה תת עורית.</li>
</ol>5. טיפול ותרופות לאחר ניתוח
<ol><li>להחזיר את החיה לכלוב שונה ולשמור אותו תחת השגחה במשך 1 - 3 שעות, עם יישום של אור אינפרא אדום כדי למנוע היפותרמיה. כל הזמן להתבונן ולמקם מחדש את החיה כל 5 עד 10 דקות עד התאוששות לאחר הניתוח. יש לה מקפיד להימנע מחשיפה מתמדת לאור לעיניים עד להחלמה.</li>
	<li>חזור על enrofloxacin (7.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ו carprofen (1 מ"ג / מ"ל; 5 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) ממשלים על ידי זריקות תת עוריות יום לאחר הניתוח. Buprenorphine אין צורך לרענן כמו הטיפול הקודם יעיל במשך 72 שעות.</li>
</ol>6. הכנת תערובת חיסונים (לכל המוקדם 14 ימים לאחר השתלת הצנתר)
הערה: מניחים את המזרקים על קרח במהלך הליך ההכנה.
<ol><li>חבר שני מזרקי זכוכית קצה מנעול Luer 10 מ"ל לזרועות קצרות של stopcock 3 כיווני ולסגור את השקע השלישי עם הזרוע הארוכה.</li>
	<li>ודא שהחיבורים מאובטחים וללא דליפות: הוסיפו כ-4 מ"ל של PBS סטרילי למזרק הפתוח תוך החזקת בוכנה 2. הכנס בוכנה 1 ולדחוף את שתי הבוכנות קדימה ואחורה תוך כדי בדיקת דליפה. אם לא מתרחשת דליפה, יש להשליך את ה-PBS ולהסיר שוב את הבוכנה 1.</li>
	<li>Pipette 1 מ"ל של IFA ו 50 מיקרוגרם של rMOG1-125 יחד ולהתאים את התערובת לנפח סופי של 2 מ"ל עם PBS סטרילי (pH 7.4) בצינור מתאים. הערה: עקב אובדן אמולסיה על טיפים או קירות של מזרקים במהלך ההכנה, להכין נפח גדול יותר מאשר מיועד לממשל. זה גם מעשי יותר להתכונן ליותר מבעל חיים אחד בבת אחת.</li>
	<li>מניחים את תערובת IFA וrMOG 1-125 מדוללת במזרק הפתוח. הכנס את הבוכנה בעדינות תוך שמירה על לחץ רופף על הבוכנה הנגדית (איור 3A).</li>
	<li>תחליב את האינוקולום על ידי הנעתו ממזרק אחד לשני על ידי דחיפת הבוכנות קדימה ואחורה, עד שהוא לבן וצמיג(איור 3B).</li>
	<li>תקן מזרק מנעול Luer בגודל 1 מ"ל לזרוע הקצרה הפתוחה של העצירה ה-3-כיוונית ומלא אותו באינוקום(איור 3C). יש להפיץ את כל המזרקים ל-1 מ"ל. שמור אותו על קרח עד הזריקה. לנהל את התערובת ביום ההכנה.</li>
</ol>7. חיסון
<ol><li>להרדים את החולדה עם איזופלואורן בתא (~ 2 דקות, מעורבב עם חמצן 2 L / min) ולאחר מכן לשמור על הרדמה באמצעות מסכה (מעורבב עם חמצן 1.5 L / min).</li>
	<li>הזרק 200 μL של inoculum תת עורית בבסיס הזנב באמצעות מחט 21 G. הערה: לנהל את הזריקה לאט כמו הפתרון הוא צמיג.</li>
</ol>8. קביעת טיטרים נוגדנים
<ol><li>לסגת ~ 200 μL של דם 4 שבועות לאחר החיסון על מנת לקבוע את titers נוגדנים נגד MOG.</li>
	<li>מצפים את הבארות של צלחת 96-באר עם MOG (5 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS) ודגור אותם במשך 1 שעה ב 37 °C (5 °F).</li>
	<li>לחסום את הצלחת עם 1% אלבומין סרום בקר (BSA) ב PBS במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדגור על הצלחת עם סרום חולדה (1:50) ולתקן אותו במשך 2 שעות ב 37 °C (50 °F). לשטוף את הצלחת 3x עם 200 μL של PBS / Polysorbate 20.</li>
	<li>לדגור את הצלחת עם חזרת peroxidase מצומד נגד חולדה נוגדן משני IgG (1:10,000). לשטוף את הצלחת 3x עם 200 μL של PBS / Polysorbate 20.</li>
	<li>הוסף 100 μL של פתרון מצע peroxidase לכל באר ודגרה זה במשך 20 - 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מדוד את הצפיפות האופטית אורך גל של 405 ננומטר וחשב את טיטר הנוגדנים מהצפיפות האופטית באמצעות עקומה סטנדרטית.</li>
</ol>9. הזרקת ציטוקינים תוך-מוחיים
<ol><li>כוונן את אורך הצינורית המחבר (2 מ"מ). (ראו איור 4 לקבלת שלבי ההכנה).)</li>
	<li>מלא מזרק 1 מ"ל עם תערובת ציטוקינים (500 ננוגרם / μL של TNF-אלפא, 300 U / μL של חולדה רקומביננטית IFN-גמא PBS סטרילי). חבר את המזרק ל צינורית מחבר. ממלאים את הצינורית בתערובת הציטוקינים. הימנע מבועות.</li>
	<li>הר את המזרק על משאבת המזרק הניתן לתכנות ותכנת אותו להזרקה של 0.2 μL/min (איור 5A). התחל את המשאבה ולשמור אותו עובד על מנת למנוע היווצרות בועת אוויר בקצה הצינורית. הערה: מהירות ההזרקה חייבת לקחת בחשבון את הקוטר הפנימי של המזרק הספציפי המשמש; ובכך, קוטר המזרק צריך להיות רשום במהלך המשאבה להגדיר.</li>
	<li>להרדים את החולדה עם איזופלוראן בתא (~ 2 דקות, מעורבב עם 2 L / min של חמצן) ולאחר מכן לשמור על ההרדמה באמצעות מסכה (מעורבב עם 1.5 ליטר / דקה של חמצן)(איורים 5B ו 5C). החל טיפות עיניים סיכה כמו החיה תהיה מרדים לפחות 30 דקות.</li>
	<li>הסר את מכסה הקטטר עם המפרצון. הכנס את צינורית המחבר לתוך הקטטר ובורג והידוק אותו (איורים 5D ו 5E). הערה: לא להגזים אותו, כמו זה יהרוס את הקצה העליון של הקטטר.</li>
	<li>אפשר את הזריקה להמשיך במשך 10 דקות (הנפח הכולל של הזרקה להיות 2 μL). תעצור את המשאבה. השאירו את הצינורית בתוך הקטטר במשך 20 דקות כדי לאפשר את הנפח המוזרק לפזר באופן מלא.</li>
	<li>פתח את הצינורית של המחבר והסר אותה לאט כדי למנוע אפקט ואקום.</li>
	<li>לחבר מחדש את מכסה הקטטר עם המפרצון ולברג אותו. אפשר לחיה להתאושש מההרדמה בכלוב.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה שלנו משתמשת בחולדות DA. ההסתגלות לעכברים תדרוש ככל הנראה שימוש בקטטר וברגים קטנים יותר. כמו כן יש לזכור כי קורס המחלה, התגובה הדלקתית, ואת היקף demyelination עשוי להיות שונה ממה שמוצג כאן אם נעשה שימוש מינים / זן אחר. הבדלים כאלה נצפו עם מודלים קלאסיים EAE באמצעות זנים שונים של עכברים. MOG92-106 ממוצא חולדה, למשל, הביא EAE פרוגרסיבי או משני ראשוני בעכברים A.SW, בעוד זה גרם הישנות-העברת EAE בעכברים SJL / J46. בעלי חיים מאותו זן צריך, אם כן, לשמש. הבדלים מגדריים בביטוי EAE דווחו גם במחקרים קודמים שונים24. המופע של השפעות מגדריות כאלה עשוי בהחלט להיות צפוי עבור הפרוטוקול המתואר כאן עדיין נשאר להיות מאומת בניסויים נוספים.
ניהול תוך-פריטיטונאלי (IP) של תערובת הרדמה הכוללת 0.02 מ"ג/מ"ל של פנטניל, 0.4 מ"ג/מ"ל של מידזולם, ו-0.2 מ"ג/מ"ל של מדטומינדין משמש להתערבות כירורגית. חולדות DA זכר מבוגר במשקל 270 - 300 גרם דורשות סביב 0.4 - 0.6 מ"ל של תערובת זו(כלומר,~ 1.5 מ"ל / קילוגרם) כדי לגרום להרדמה שנמשכת 60 - 90 דקות. לאחר הניתוח, ההרדמה היא אנטגוניזציה על ידי הזרקה תת עורית של תרופה הכוללת 0.07 מ"ג / מ"ל של flumazenil ו 0.42 מ"ג / מ"ל של atipamezole מלוחים פיזיולוגיים (0.9% NaCl). מנה של 1 - 1.5 מ"ל / קילוגרם מרגיז את ההרדמה בתוך 5 דקות. לחלופין, ניתן לאפשר לבעלי החיים להתעורר באופן ספונטני על שטיפה פיזיולוגית מתוך ההרדמה, אך במקרה זה, יש לשמור על בעלי החיים תחת השגחה עד שהם בהכרה מלאה.
אפשרויות הרדמה אחרות המשמשות לעתים קרובות לניתוחים בבעלי חיים, כגון הזרקת IP של קטמין וקסילאצין47 או נתרן פנטוברביטל48, או שאיפה של הרדמה נדיפה כמו איזופלואורן49 והלוטאן50, ניתן לשקול גם עבור הניתוח המוצג כאן. עם זאת, חשוב לבחור בסוכן הרדמה שאינו מפריע להתערבות הזרם המיועדת.
במהלך החיסון והזרקת ציטוקינים תוך-מוחיים, 5% איזופלוראן משמש להרדמה. המודל המתואר כאן הוקם באמצעות חולדות, והפרטים הניסיוניים המפורטים הם, אם כן, חלים במיוחד על החולדה. קואורדינטות השתלת הצנתר נבחרו כדי לאפשר ניתוח סימולטני של שינויים אפשריים בחומר הלבן (קצה הקטטר בקורפוס קלוסום). בעוד אתר החדרת הצנתר יכול להיות מגוון ביחס למיקום anteroposterior ו לרוחב, הבחירה של סולקוס מרכזי דורש הימנעות של נזק לסינוס קשת מעולה.
מאפיין נוסף של השיטה המתוארת הוא demyelination שווה ערך של isi - ו contralateral hemispheres, אולי כתוצאה מההובלה של תערובת ציטוקינים מוזרק לחלל subarachnoid על ידי הזרימה הפיזיולוגית של הנוזל interstitial מאזורים קליפת המוח51. מצב ההזרקה, ולא המיקום של הקטטר, ולכן, גורם demyelination בכל קליפת המוח, ואת הבחירה של קליפת המוח הימנית או השמאלית צריך, ולכן, להיות לא מהותי בהקשר זה.
הפרוטוקול משתמש צנתר 26 G, שהוא קטן מספיק כדי למנוע פגיעה טראומטית נרחבת וגדול מספיק כדי למנוע קצב מוגבר של סתימה של קצה הקטטר במהלך הארוך של הניסוי. אין ספק שההשתלה ונוכחות הקטטר עצמו גורמות להפעלה אסטרוציטית ומיקרו-גליאלית, גם בחיות הבקרה המקבלות רק את השתלת הצנתר; עם זאת, זה מינורי בהשוואה לבעלי החיים מוזרק ציטוקינים. 43 כדי למנוע כל הפרעה עם ניתוחים הבאים, השתמשנו צנתרים תואמי MRI עשויים פולי-אתר-אתר-קטון (PEEK).
עומק דומה של דמיאלינציה נוצר, למעשה, הן באזורים IPSI- והן באזורים מנוגדים עם השיטה המוצגת. משמעות הדבר היא כי עומק / אורך קטטר לא יכול לשחק תפקיד מרכזי בתבנית ובהיקף של demyelination בקליפת המוח. לכן, שינוי של אורך הצנתר עשוי להיחשב על מנת להפחית את גודל הנגע הנגרמת על ידי קטטר. עם זאת, אורך קטטר קצר משמעותית עלול לגרום לדמלינציה קליפתית מעט פחות בולטת, בעוד שתשובה חד משמעית תתקבל רק על ידי ניסויים שנערכו במיוחד לאורך הצנתר.
אחד היתרונות של המודל הוא כי הצנתר המושתל מאפשר בדיקה של טיפולים פוטנציאליים מנוהלים לקליפת המוח באמצעות הקטטר כדי לאפשר remyelination ב או אחרי השיא של demyelination קליפת המוח היסטולוגית (יום 15 ואילך), בעוד בסביבה טרום טיפול זה יהיה לאחר החיסון אבל לפני הזרקת ציטוקינים. ההחלטה על מסגרת הזמן שבה יינתן הטיפולים, אם כן, תהיה תלויה בשאלת המחקר הספציפית ובתרופה המעניינת.
לאחר השתלת הצנתר, חשוב לשכן בעלי חיים בודדים בכלובים המותאמים (רצוי גבוהים) על מנת למנוע הסרת צנתר עד סוף המחקר(איור 8). בעלי חיים עשויים גם לפתוח את מכסה הצנתר עם המפרצון, אם כי זה קורה לעתים רחוקות. יש לצפות בבעלי החיים מדי יום ולהסיר כובעים עם אלה טריים, כדי למנוע חסימת קצה קטטר בהיעדר מפרצון, כדי להבטיח משלוח מדויק לתוך parenchyma לאחר הזרקה תוך מוחית. בעלי החיים מחוסנים לכל המוקדם שבועיים לאחר השתלת הצנתר כדי לאפשר ריפוי וסגירה של מחסום הדם - מוח.
סרום נגד MOG נוגדנים titers צריך להימדד לאחר החיסון. ניסוי תגובת מינון הראה כי 5 מיקרוגרם של MOG1-125 (ב IFA) סיפק חיסון מספיק בתוך 4 שבועות בחולדות DA זכר מבוגר. titer של 5,000 מיקרוגרם / מ"ל ומעלה יהיה מספיק, אבל בהחלט יהיה תלוי במספר גורמים, כולל הכנת MOG ואת זן בעלי החיים, ולכן, יהיה צריך להיקבע בנפרד. חשוב להימנע מינוני אנטיגן גבוהים מדי פוטנציאל וכתוצאה מכך פנוטיפ EAE קלאסי עם גפיים אחוריות משותקות עוד לפני הזרקת ציטוקינים.
כל חיה מחוסנת ב-5 מיקרוגרם של אוליגודנדרוציט גליקופרוטאין (rMOG1-125)מחוסנת ב-200 מיקרוגרם של אדג'ובנט של פרוינד (IFA) לא שלם. מאז חלק אמולסיה הולך לאיבוד בתוך המזרק במהלך ההכנה, מומלץ להכין יותר מסכום זה עבור כל בעל חיים. השתמשנו ב- MOG רקומביננטי (1-125 מה- N-terminus של עכברוש MOG), אשר בא לידי ביטוי Escherichia coli ולאחר מכן טוהר הומוגניות על ידי כרומטוגרפיה כלאט, מומס ב 6 M אוריאה, ודיאליזה נגד PBS כדי לקבל הכנה פיזיולוגית52,53. MOG זמין מסחרית, עם זאת, עשוי לשמש גם.
תכשירי אנטיגן אחרים, כגון MOG1-116, MOG35-55 או PLP139-151 משמשים במודלים שונים של EAE, והבדלים בזן אנטיגן ובעלי חיים ידועים כמזינים פנוטיפים של מחלות שונות במודלים אלה20. תכשירי אנטיגן אלה לא נבדקו בחולדות DA, ואם נעשה שימוש בהעדפה rMOG1-125, עלול לגרום פנוטיפ מחלה או תוצאות היסתולוגיות שונה ממה שמוצג כאן.
צינורית מחבר באותו אורך כמו הקטטר מוכן לפני הזרקה תוך מוחית. ניתן לעשות זאת על ידי הרכבתו עם צנתר תבנית וחיתוך אותו לאותו גודל (באורך 2 מ"מ)(איור 4). חשוב כי הצינורית המחבר להיות ללא בועה אוויר במהלך הזרקת ציטוקינים - כי נפח ההזרקה הוא רק 2 μL, אפילו בועת אוויר זעירה בקצה הצינורית יפחית באופן משמעותי את נפח הנוזל המועבר בהצלחה לתוך המוח. זה מושגת על ידי שמירה על המשאבה פועלת והכנסת הצינורית רק כאשר טיפה גדלה של נוזל הזרקה נוכח בקצה. לאחר החדרת הצינורית, המחבר מוברג לקטטר תוך הימנעות overtightening כדי לא לפגוע בקצה העליון של הקטטר, אשר יקשה על סיכום לאחר הזריקה. מהירות הזרקה של 0.2 μL/ min משמשת כדי למנוע טראומה הנגרמת על ידי הזרקה. יתר על כן, זריקה איטית, בשילוב עם תקופת המתנה של 20 דקות לאחר ההזרקה, מבטיחה את דיפוזיית הנוזל המוזרק לתוך הנוזל interstitial וניקוז יעיל לתוך CSF. הצינורית מוסרת לאט כדי למנוע אפקט ואקום.
השיטה המדווחת כוללת התערבות כירורגית, ולכן דורשת צוות מסוגל לבצע ניתוח הישרדות סטריאוטקטי. אנשי צוות במגע ישיר עם בעלי החיים היו צריכים לקחת את קורסי הניסויים בבעלי חיים המתאימים. שאר הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי חברי מעבדה מוסמכים.
השיטה נועדה לייצר demyelination מופעל דלקת של קליפת המוח ואינו לשחזר את כל התכונות של MS אנושי (למשל,התרחשות של נגעים חומר לבן דלקתי מוקד, המהווה סימן היכר של MS אנושי).

MS היא מחלה דלקתית בתיווך מערכת החיסון של מערכת החיות, אשר פוגעת בעיקר יריעות מיאלין, אבל בסופו של דבר מוביל לאובדן אקסוני ונזק עצבי קבוע. טרשות נפוצה היא המחלה הנפוצה ביותר בתיווך מערכת חיסון של מערכת ן עם שכיחות מוערכת של כ -2.3 מיליון אנשים ברחבי העולם, על פי האגודה הלאומית לטראנס 1 , ומייצגתנטלאישי וסוציו-אקונומי גדול. הגיל הממוצע של תחלואה המחלה הוא 30 שנה ומוביל לאובדן שנים פוריות על ידי גרימת נכות חמורה. MS הוא כרגע חשוכת מרפא, ואת שיטות הטיפול הנוכחי שואפים לנהל את הסימפטומים במהלך הישנות חריפה בנסיגה-remitting MS ולשנות את מהלך המחלה כדי להקטין את תדירות הישנות על ידי טיפול אימונומודולטורי2,3. אין אפשרות טיפול עדיין הוכיחה יעילות עבור סוגים מתקדמים4, למעט ניסוי קליני האחרון של טיפול מרוקן B-cell, אשר הוכח להיות יעילות בקבוצת משנה של MS פרוגרסיבי ראשוני (PPMS) חולים עם דלקת פעילה5. בעוד מספר גורמי סיכון גנטיים פוטנציאליים6 וסביבתי7 זוהו, האטיולוגיה של MS, עם זאת, עדיין לא ידוע.
MS מאופיין על ידי לוחות demyelinating דלקתיים גדולים, ופציעות מפוזרות, החומר הלבן8,9. נגעים מוקדיים קושרו עם התקפה מתווכת נרחבת של תאי T, הרס אוליגודנדרוציטים, אסטרוגליוזיס תגובתי, ניוון אקסוניאלי, מה שמוביל לירידה בנוירונים מוטוריים. חומר אפור demyelination וניוון זכו להכרה כמאפיינים היסטופתולוגיים נוספים של המחלה9,10,11. האחרון הוצע לתרום לתפקוד נוירולוגי ולירידה קוגניטיבית בחולים12,13. שלושה דפוסים של demyelination קליפת המוח נבדלו, כלומר i) לויקוקורטיקליות, רציפות עם נגעי החומר הלבן (34%), ii) קטן, perivascular (16%), ו - iii) תת-צינורי (50%). שלא כמו נגעים בחומר הלבן מוקד, נגעים אלה חומר אפור דווחו חסר התקפה מתווכת תא T והם מאופיינים במקום זאת על ידי הפעלה microglial משופרת, אפופטוזיס, ואובדן עצבי12.
עד כה, לא ניתן היה לשחזר את MS האנושי במודל של חיה אחת, בעיקר בשל המורכבות של המחלה. מגוון מודלים של בעלי חיים MS, כל המדמה היבטים שונים של פתוגנזה המחלה והתקדמות פותחו, במקום זאת,14,15. המודלים הנוכחיים של בעלי חיים מחקים שלושה תהליכי מחלה שונים: i) נגעים דלקתיים מוקדיים, ii) פגיעה בחומר הלבן מפוזרים, ו-iii) פתולוגיית חומר אפור מפוזרת.
מחקרים בבעלי חיים של לוחות חומר לבן MS נערכו בעיקר במודלים אנצפלאמליטיס מכרסם (EAE). חיות ניסוי מחוסנות באופן פעיל עם אמולסיה המכילה אנטיגן מיאלין [בדרך כלל מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG)16,17, חלבון בסיסי מיאלין (MBP)18, או חלבון פרוטאוליפיד (PLP)19], יחד עם אדג'ובנט של פרוינד שלם (CFA)20. המחלה יכולה גם להיות מושרה באופן פסיבי על ידי העברה מאמצת של תאי T ספציפיים מיאלין21. קורס המחלה תלוי בשילוב זן אנטיגן / עכבר המשמש. MOG35-55 ב C57BL/6, למשל, תוצאות מחלה כרונית מונופאזית22, בעוד PLP139-151 בעכברים שוויצרי ג'ים למברט (SJL) מוביל קורס מחלה חוזרת23 באופן ספציפי למין24. עכברוש MOG35-55,יתר על כן, מעורר תגובת תאי T אנצפליטוגנית, בעוד MOGאנושי 35-55 גורמת לדלקת תלוית תאי B ב- C57BL / 6 עכברים25. מודלים שונים של EAE מספקים כלי מצוין לחקר דלקת בתיווך התא בעיקר בחוט השדרה וב במוח הקטן, אך מבנים מוח-קדם כמו קליפת המוח, קורפוס קאלוסום ומבנים תת-קורטיטיים נותרו חסכים במידה רבה26. לא פציעה מפוזרת של חומר לבן ולא demyelination חומר אפור הוא, יתר על כן, משוכפל כראוי במודלים EAE26,27. demyelination קליפת המוח הקשורים אינדוקציה פעילה EAE דווחה מרמוסטים28,29 ובזני משנה חולדה לואיס מסוימים, במקרה האחרון המיוחס לשילובים השוררים של MHC class I ואיזוטיפים מדרגה II ואללים30.
דגם cuprizoneמודל 31 הוא כלי שימושי לחקר demyelination חומר לבן מפוזר ופתולוגיה של חומר אפור עם demyelination נרחב של קליפת המוח, תת קליפת המוח32, והיפוקמפוס33 אזורים, כמו גם קורפוס callosum34 ואת putamen caudate35. שיכרון Cuprizone, אשר, באופן עקרוני, גורם אפופטוזיס הנגרמת על ידי מתח מטבולי של אוליגודנדרוציטים, מחקה כמה מאפיינים של נגעים demyelinating קליפת המוח של המוחות טרשת נפוצה כגון הפעלת מיקרוגליה, אסטרוגליוזיס, וחוסר יחסי של תאים חיסוניים היקפיים חודרים. חוסר אפופטוזיס עצבי ניוון תלמי, כמו גם את הרזולוציה המלאה של demyelination עם remyelination חזק נצפתה עם הפסקת תוספי קופריזוןתזונתיים 32, עם זאת, להגביל את השימוש של שיכרון cuprizone כמודל טרשת נפוצה פרה-אקלינית. demyelination רעיל יכול גם להיגרם על ידי הזרקת מוקד של ליזולציטין או אתידיום ברומיד לתוך דרכי החומר הלבן36,37, אבל שיטות אלה משמשים לעתים רחוקות. מודלים רעילים demyelination מתאימים במיוחד לניתוח של מנגנונים מורכבים של remyelination, כגון הדרישה לתאי אבות אוליגודנדרוציטים אסטרוציטים38,39. מידע מפורט על מודלים EAE ושיכרון מסופקים בשתי ביקורות אחרונות15,40.
demyelination המושרה ציטוקינים פותח בתחילה כדי לחקור נגעים חומר לבן עמוד השדרה ב EAE41. מאוחר יותר, זה שונה כדי ללמוד פתולוגיות חומר אפור קליפת המוח ב MS. Dark Agouti (DA) או לואיס חולדות מוכנות לראשונה על ידי חיסון תת קליני עם MOG1-12542,43 או MOG1-11644 באדג'ובנט של פרוינד לא שלם (IFA). שלא כמו מודלים קלאסיים של EAE, בעלי חיים אלה אינם מפגינים תסמינים קליניים של נגעים דלקתיים מוקדיים בחוט השדרה. במקום זאת, תגובה דלקתית demyelination במוח מושגים לאחר מכן על ידי ממשל תוך מוחי של תערובת ציטוקינים פרו דלקתית [גורם נמק הגידול אלפא (TNFα) ואינטרפרון גמא (IFNγ)] ברגע שבעלי החיים השיגו titer יציב של נוגדנים נגד MOG בדם.
מחקרים של מרלר ואח'. 42 וגרדנר ואח' 44 הוכיחו את היעילות של אינדוקציה demyelination קליפת המוח תת-צינור על ידי חיסון MOG תת קליני הזרקת ציטוקינים תוך-עכבישיים או תת-עכבישיים. משך הזמן המדווח של demyelination היה, עם זאת, קצר מדי- remyelination מלא התרחש בתוך 14 ימים או פחות, ובכך להגביל את החלון עבור כל בדיקת התערבות פרמקולוגית. שני המודלים, יתר על כן, משתמשים במודוס הזרקה טראומטי, אשר כשלעצמו יכול לגרום טראומת הזרקה ומחסום דם - מוח התמוטטות (BBB) ובכך להוביל לגיוס בלתי מבוקר של תאים דלקתיים לתוך parenchyma. שני המחקרים, יתר על כן, הדגימו demyelination כי הוא מוגבל לאזור מוגבל, בקליפת המוח ipsilateral, או בקרבת האתר של הזרקת ציטוקינים.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, שתלנו קטטר בקליפת המוח הקודקודית הימנית של חולדות DA, עם קצה הצנתר הממוקם ממש מעל הקורפוס קאלוסום. כדי לאפשר החלמה מלאה של שלמות BBB, בעלי החיים הורשו תקופת מנוחה של שבועיים לאחר השתלת הצנתר. לאחר מכן, החולדות היו מחוסנות תת קלינית עם 5 מיקרוגרם של MOG רקומביננטי1-125 ב- IFA. בעקבות השגת טיטר נוגדן אנטי-MOG יציב לאחר כ -4 שבועות, 2 μL של תערובת ציטוקינים הוזרק דרך הצנתר בתוך 10 דקות באמצעות משאבת מזרק לתכנות. הליך זה עורר demyelination קליפת המוח הנרחבת של IPSI - ואת האונה המוחית contralateral ב 15 ימים, עם remyelination חלקי סביב 30 ימים לאחר הזרקת ציטוקינים43. שלבי demyelination מרובים יכול, יתר על כן, להיגרם על ידי ניהול חוזר ונשנה של ציטוקינים פרו דלקתיים דרך הקטטר, ניוון המוח העולמי, תכונה נפוצה של תת סוגים מתקדמים MS45, יכול להיות מושרה כבר לאחר שלב demyelination השני43. חשוב לציין, הקטטר המושתל יכול לשמש גם לבדיקת התערבויות פרמקולוגיות.
הפרוטוקול המתואר להלן מספק הסבר מפורט על הצעדים הניסיוניים לדור רבייה של דמיאלינציה קליפתית נרחבת בשתי ההמיספרות המוחיות של חולדות DA באמצעות קטטר תוך-מוחי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Adult male Dark Agouti rats (300 &#177;25 g)&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fentanyl</td>
			<td style="width:267px;">Hameln pharma plus, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">&#160;as Fentanyl-Citrate, 50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Midazolam</td>
			<td style="width:267px;">ERWO Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;">50039017</td>
			<td style="width:267px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Medetomidin&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Orion Pharma, Finland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Flumazenil&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Roche, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">0.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Atipamezol&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Orion Pharma, Finland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10% povidone-iodine complex&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Mundipharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dental cement&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus Kulzer, Germany</td>
			<td style="width:145px;">6603 7633</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Physiological saline solution&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fresenius Kabi, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">P3813</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:267px;">AbbVie, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lubricating eye drops&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Thea Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:269px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:267px;">Merck, Germany</td>
			<td style="width:145px;">1070172511</td>
			<td style="width:267px;">Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">2.5% enrofloxacin</td>
			<td style="width:267px;">Bayer, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Prophylactic antibiotics&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">carprofen</td>
			<td style="width:267px;">Pfizer, USA</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Painkillers, 50 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">P9416</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pentobarbital&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Richter Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">pentobarbital sodium, 400 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Interferon gamma&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PeproTech, USA</td>
			<td style="width:145px;">&#160;400-20</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tumor necrosis factor alfa</td>
			<td style="width:267px;">R&#38;D Systems, USA</td>
			<td style="width:145px;">510-RT-050/CF</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="107">
			<td height="107" style="height:107px;width:269px;">rMOG1-125</td>
			<td style="width:267px;">own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Anti-MOG antibody&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan</td>
			<td style="width:145px;">AS-555157</td>
			<td style="width:267px;">Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Incomplete Freund&#8217;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">&#160;F5506</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan</td>
			<td style="width:145px;">AS-555157</td>
			<td style="width:267px;">Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">A9576</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Peroxidase substrate solution</td>
			<td style="width:267px;">Vector Laboratories, USA</td>
			<td style="width:145px;">SK-45000</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Stereotactic frame&#160;</td>
			<td style="width:267px;">David Kopf Instruments, USA</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Catheters, MRI suitable&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC315GPKXXC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dummy cannulas&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC315DCNSPC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plastic screws, MRI suitable&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8L080X093N01</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Connector cannula&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC313CXSPCC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Screw driver with 2mm tip-size</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill with flexible shaft extension&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Proxxon, Germany</td>
			<td style="width:145px;">NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,&#160;&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill bit, round, 0.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td style="width:145px;">REF310 104 001 001 009</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill bit, twisted, 1.3 mm&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td style="width:145px;">REF350 104 417 364 013</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">BB510</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scalpel handle&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">91003-12</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cotton tip applicator&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Henry Schein Medical, Austria</td>
			<td style="width:145px;">900-3155</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">14101-14, 14088-10&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">11002-12, 11251-35</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bulldog clamps&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">18050-35</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Homoeothermic blanket&#160;</td>
			<td style="width:267px;">TSE systems, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Infrared Lamp</td>
			<td style="width:267px;">Beurer, Germany</td>
			<td style="width:145px;">616.51</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dental curing light&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Guilin Woodpecker Medical, China</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Absorbable suture&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Johnson &#38; Johnson, Belgium</td>
			<td style="width:145px;">V792E</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Programmable syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:267px;">World Precision Instruments, USA</td>
			<td style="width:145px;">AL-1000</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Exam gloves</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical gown</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Electric Shaver</td>
			<td style="width:267px;">Aesculap, Germany</td>
			<td style="width:145px;">GT420</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Volatile anesthetic vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">CV 30-301-D</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:267px;">Air Liquide, Austria</td>
			<td style="width:145px;">19,113</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Volatile anesthesia chamber&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">PS-0347</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Anesthesia mask for rats&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">PS-0307-A</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1 ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Codan, Denmark</td>
			<td style="width:145px;">REF 62.1612</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">26 Gauge needle for injection&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">4657683</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">20 Gauge needle for cytokine injection and immunization&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">4657519</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Luer lock tip glass syringes&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Poulten &#38; Graf, Germany</td>
			<td style="width:145px;">7.140-37</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">3 way stopcock&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Becton Dickinson, Sweden</td>
			<td style="width:145px;">394600</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well plate&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:145px;">442404</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plate reader&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Cole-Parmer, USA</td>
			<td style="width:145px;">EW-1396-00</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">37&#176;C incubator</td>
			<td style="width:267px;">Kendro, Germany</td>
			<td style="width:145px;">50042301</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Micropipettes&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gilson, USA</td>
			<td style="width:145px;">F167350</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines

טרשת נפוצה (MS) היא המחלה הנפוצה ביותר בתיווך מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומובילה בהדרגה לנכות פיזית ומוות, הנגרמת על ידי נגעים בחומר הלבן בחוט השדרה וב במוח הקטן, כמו גם על ידי demyelination בחומר אפור. בעוד מודלים קונבנציונליים של דלקת המוח אלרגית ניסיונית מתאימים לחקירה של דלקת בתיווך התא בחומר הלבן בעמוד השדרה ובחומר המוח, הם אינם מצליחים לטפל בפתולוגיות של חומר אפור. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול הניסיוני למודל עכברושים חדשני של דמיאלינציה קליפת המוח המאפשר לחקור את המנגנונים הפתולוגיים והמולקולריים המובילים נגעים קליפת המוח. demyelination הוא המושרה על ידי חיסון עם מיאלין במינון נמוך אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) באדג'ובנט של פרוינד לא שלם ואחריו משלוח תוך מוחי בתיווך קטטר של ציטוקינים פרו דלקתיים. הצנתר, יתר על כן, מאפשר סבבים מרובים של demyelination מבלי לגרום טראומה הנגרמת על ידי הזרקה, כמו גם משלוח תוך מוחי של תרופות טיפוליות פוטנציאליות עובר חקירה פרה קלינית. השיטה גם חיובית מבחינה אתית שכן כאב ומצוקה או נכות בעלי חיים נשלטים ומינימליים יחסית. מסגרת הזמן הצפויה ליישום הפרוטוקול כולו היא סביב 8 - 10 שבועות.

ניתן להעריך דמיאלינציה קליפתית בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת ציטוקינים על ידי אימונוהיסטוכימיה לחלבון פרוטאוליפיד (PLP) (איור 6). איור 6A מראה חיסון PLP שלם ביום ה-15 בחית בקרה מחוסנת MOG שקיבלה PBS סטרילי בלבד דרך הצנתר המושתל. ביום הראשון לאחר הזרקת הציטוקינים, ניתן היה להבחין בדמיאלינציה בבעלי חיים בעלי ראש MOG, אם כי רק בסביבה הקרובה של האזור הצנתור(איור 6B). החיסון PLP נשאר שלם בקליפת המוח הנגדית 1-יום לאחר הזרקת ציטוקינים. ביום 3, ניתן היה לראות עלייה הדרגתית באובדן החיסון PLP, המתפשט בקליפת המוח האיסיליטרלית (איור 6C). ניתן היה לזהות דה-מיאלינציה קליפתית Contralateral גם ביום 3 (איור 6D),אך היא מוגבלת למדי לאזור שמתחת לברגי העוגן, אולי בשל אזור זרימה נמוך של נוזל ביניים הנגרם על ידי ברגי העוגן43. היעדר תצפית דומה בחיות הבקרה שהוזרקו ל-PBS אינו כולל את האפשרות של דמיאלינציה הנגרמת מטראומה הנובעת מבורג העוגן.
בין ימים 9 - 15, demyelination משפיע על חלקים גדולים של קליפת המוח של שתי ההמיספרות (איורים 6E, 6F, ו 6G). זה עולה בקנה אחד עם התבוננות של התנהגות איטית, אם כי ללא ירידה משמעותית סטטיסטית בכישורים המוטוריים במבחן רוטארוד43. demyelination קליפת המוח הוא מתמשכת עד 30 ימים לאחר הזרקת ציטוקינים בשתי ההמיספרות (איורים 6H ו 6I) עם remyelination חלקי בלבד. איור 6J מראה כימות של אובדן PLP בחומר האפור הקליפתי לאחר הזרקת ציטוקינים תוך-מוחיים. יש לציין כי חיסון PLP עדיין לא הוערך לאחר תקופות ארוכות יותר מ 30 ימים; ובכך, ההחלטה המיידית של remyelination, אם יש, נותר להעריך על ידי ניסויים נוספים. ממשל שני של תערובת ציטוקינים דרך הצנתר המושתל 30 יום לאחר ההזרקה הראשונה גורם ניוון מוחי מסומן ביום 15 (איור 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig1.jpg"> איור 1:הכנת הצנתר. (A ו- B)צינורית המדריך והמנולה הבובה (כובע צנתר עם מפרצון) מורכבים ומוברגים. (C)לאחר מכן הקטטר נחתך לגודל של 2 מ"מ בעזרת אזמל. התצפית המיקרוסקופית הראתה כי השימוש במספריים למטרה זו מעוות את הצורה המעגלית של קצה הצינורית, ובכך יש להימנע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig2.jpg"> איור 2: השתלת הצנתר. (א)הניתוח מתחיל בחתירה אורכית והסרת פריוסטיום. (B, ג) פאנל זה מציג את סימון המקום עבור הקטטר ב 2 מ"מ אחורי ברגמה ו 2.4 מ"מ לרוחב מימין מן התפר קשת; כמו גם את המקומות עבור החורים המיועדים לשלושת ברגי העוגן עם מרחק מתאים מן הקטטר למבדה. (D)לאחר קידוח חור הקטטר (קוטר 0.5 מ"מ, עם קצה מקדחה עגול) ואת החורים עבור ברגי העוגן (1.3 מ"מ קוטר עם קצה מקדחה מפותל), ברגי העוגן מתהדקים. (ה, ו) לאחר מכן הקטטר מוכנס וכל ההתקנה מיוצבת עם פילמור מלט דנטלי. הפצעתפור עם שניים או שלושה קשרים הקדמיים והאחוריים של הצנתר. B = ברגמה; L = למדה; C = קטטר; S1, S2 ו- S3 = מקומות עבור החורים עבור שלושת ברגי העוגן. סרגלי קנה המידה = 1 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig3.jpg"> איור 3: הכנת אמולסיה rMOG /IFA. (A)התערובת של rMOG, PBS ו- IFA מתחלפת על ידי לחיצה על האינוקולום ממזרק אחד למשנהו על ידי דחיפת הבוכנות הלוך ושוב, (B) עד שהוא לבן וצמיג. (C)לאחר מכן, אינוקולום מופץ למזרקים 1 מ"ל עבור ההזרקה. 5 מיקרוגרם של rMOG משמש 200 μL של תערובת PBS / IFA כדי sub מבחינה קלינית לחסן חולדה אחת; עם זאת, בשל ההפסדים בקצות והקירות של המזרקים במהלך ההכנה, יש להכין נפח גדול יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig4.jpg"> איור 4: הכנת צינורית המחבר. (A - D)לוחות אלה מראים כיצד מחבר ומחבר פנימי מורכבים עם צינורית מדריך תבנית בגודל 2 מ"מ. (E)הפנימי נחתך לאותו גודל כמו צינורית המדריך בעזרת אזמל (F) ומדריך התבנית אינו נפתח לאחר מכן. (G)הקצה השני של הצינורית המחבר קבוע מזרק 1 מ"ל, אשר מכיל את תערובת ההזרקה, עם מחט 20 G. סרגלי קנה המידה = 3 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig5.jpg"> איור 5: הזרקה תוך-מוחית. (A) משאבת מזרק ניתנת לתכנות מותאמת למהירות הזרקה של 2 μL/min, והמזרק בגודל 1 מ"ל מלא בתערובת ציטוקינים (או PBS סטרילי עבור הפקדים) מותקן על המשאבה. (B)החיה מורדמת תחילה בתא באמצעות 5% איזופלוראן עם זרימת חמצן של 2 ליטר / דקה ולאחר מכן (C) ההרדמה מתקיימת דרך המסכה באמצעות 2.5% איזופלוראן עם זרימת חמצן של 1.5 ליטר לדקה. (D)מכסה הצנתר עם הכניסה (צינורית הדמה) מוברגת ונקניקת ההזרקה מוכנסת דרך הצנתר המושתל. מאז נפח הזריקה הוא קטן מאוד, החוקר צריך להיות זהיר כדי למנוע בועות אוויר בקצה הצינורית. מסיבה זו, חשוב להתחיל את ההחדרה בזמן המשאבה פועלת ורק כאשר יש בועה נוזלית גדלה בקצה. הנפח הנוסף לא ייכנס למוח בכל מקרה, כפי שהוא מתפרק על גבי הקטטר לפני הכניסה. (E)לאחר מכן הצינורית המחבר הוא התהדק, ואת המשאבה הוא מאפשר לפעול במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות של הזרקה, המשאבה נעצרת, ואת הצינורית נשאר בפנים במשך 15 - 20 דקות כדי לאפשר את דיפוזיה של נפח מוזרק לנוזל interstitial. מוטות קנה המידה = 5 ס"מ, אלא אם צוין אחרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig6.jpg"> איור 6: חיסון PLP במקטעי מוח קורונלי. (A) פאנל זה מציג מוח בקרה (MOG-primed) עם הזרקת PBS (יום 15), אשר אינו גורם demyelination קליפת המוח. (B)כבר ביום הראשון לאחר הזרקת ציטוקינים, demyelination ניכר באזור הצנתר. (C)אובדן רחב יותר של חיסוניות PLP נצפה בקליפת המוח ipsilateral ביום 3, (D) כמו גם בצד הנגדי. אובדן נרחב של חיסוניות PLP נצפה בשתי ההמיספרות ביום 15, כמו (E) פאנל זה מראה את קליפת המוח ipsilateral ו -( F) פאנל זה מראה את קליפת המוח הנגדית. (ז)סקירה כללית של שתי ההמיספרות ניתנת בהצגת האובדן הנרחב של PLP ביום ה - 15. ביום 30, כמו (H) פאנל זה מראה את קליפת המוח ipsilateral ו (אני) פאנל זה מראה עבור קליפת המוח contralateral, עדיין יש demyelination מדהים, אבל גם כמה אזורים remyelinated ניתן היה לראות. (J)פאנל זה מציג את הכימות של demyelination (אובדן PLP ב מ"מ2/ חצי כדור). 1.5 - 2 μm מקטעי מוח כוראלי שימשו לגילוי PLP עם MS anti-PLP עם גורם דילול של 1:500. החלקים היו מוכתמים בהמטוקסילין עבור גרעיני תאים. למידע מפורט על האימונוהיסטוכימיה, ראה Ucal et al. 43. פאנל G ו- J שונו מ Ucal ואח '. 43. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig7.jpg"> איור 7: ניוון המוח לאחר הזרקת ציטוקינים שנייה. (A)פאנל זה מציג מוח בקרה (MOG-primed) עם הזרקת PBS (יום 15). (B)ביום 15 לאחר הזרקת הציטוקינים הראשונה, זריקה שנייה מובילה להתנוונות המוח תוך 15 יום. 1.5 - 2 μm מקטעי מוח כוראלי שימשו לגילוי PLP עם MS anti-PLP עם גורם דילול של 1:500. החלקים היו מוכתמים בהמטוקסילין עבור גרעיני תאים. למידע מפורט על אימונוהיסטוכימיה, ראו בלקמור37. סרגלי קנה המידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig8.jpg"> איור 8: כלובים מותאמים למניעת הסרת קטטר על ידי החיה. בכלובים הסטנדרטיים, שטח מחזיק המזון ברשת ממוקם קרוב יותר לתחתית הכלוב, ויוצר מרחב צר ומסוכן המגדיל את הסיכוי של הצנתר להסתבך עם הרשת, ובכך, הסרתו. כדי למנוע זאת, יש לשנות את הכלוב. חלל צר זה נחסם במישור שקוף, המאפשר את קיום החיה. האוכל צריך להינתן בתוך הכלוב בכלובים המותאמים האלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines at JoVE.com

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר רבייה של חיקוי נרחב של חומר אפור של שתי ההמיספרות הקליפתיות בחולדות אגוטי אפלות זכריות בוגרות. השיטה כוללת השתלה תוך-מוחית של קטטר, חיסון תת-אקליני נגד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין, והזרקה תוך-מוחית של תערובת ציטוקינים פרו-דלקתית דרך הצנתר המושתל.

מודל חולדה של דמיאלינציה קליפת המוח הנרחבת הנגרמת על ידי הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים פרו דלקתיים

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור demyelination נרחב של קליפת המוח של שתי ההמיספרות המוחיות במודל חולדה באמצעות חיסון תת קליני נגד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין, ואחריו הזרקת מוח עניין של ציטוקינים דרך קטטר מושתל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מרכזיות במחלות demyelinating דלקתיות של המוח, כגון טרשת נפוצה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול ליצור demyelination חומר אפור המושרה דלקת בקליפת המוח של שתי ההמיספרות המוחיות מבלי להוביל תקעים חומר לבן.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון הבנה טובה יותר של מנגנונים של demyelination קליפת המוח כי הוא ציין בעיקר סוגים מתקדמים של טרשת נפוצה. כדי להתחיל בהליך זה, להרכיב את הצנתר ואת כובע הקטטר עם כניסת. לאחר מכן, לחתוך את הקטטר לאורך של שני מילימטרים עם אזמל.ואז לגלח את ראשו של חולדה מרדים בין האוזניים באמצעות מכונת הגילוח החשמלית. מניחים את החולדה במסגרת הסטריאו-טקית ומאבטחים את ראשה באמצעות מוטות האוזניים וצלחת הנשיכה. ודא שהראש אופקי ובדוק את יציבותו על ידי הפעלת לחץ עליו עם אצבע או מלקחיים.לאחר מכן, יש למרוח טיפות עיניים משמנות למניעת יובש בקרנית במהלך הניתוח, לכסות את העיניים בחומר אטום כדי למנוע חשיפה לאור כירורגי. לאחר מכן, לנקות את האזור המגולח על ידי לסירוגין היישום של 70%אתנול ו 10% קומפלקס יוד povidone. כדי להשתיל את הקטטר, לעשות חותך אורך של כשני ס"מ לאורך קו האמצע.ואז להשתמש מלחציים בולדוג להחזיק את העור לצדדים. הסר את הדם באמצעות אפליקטור קצה כותנה. לאחר מכן, להסיר את periosteum, לנקות את הרקמה עם אפליקטור קצה כותנה, לחשוף את הגולגולת ולאפשר לו להתייבש במשך כדקה אחת.לאחר מכן, זהה את ציוני הדרך האנטומיים, למבדה, ברגמה ותפירה מדילית. כאשר המקדחה מותקנת על המסגרת הסטריאו-טסטרואטקטית, מקם את קצה המקדחה בברזמה כנקודת ההתחלה. הזז שני מילימטרים אחוריים מן bregma, ו 2.4 מילימטרים לרוחב לתבל המהודל.לאחר מכן, לקדוח חור בקוטר 0.5 מ"מ עבור הקטטר במצב זה. לקדוח עוד שלושה חורים בקוטר 1.3 מ"מ עבור ברגי העוגן כמה מילימטרים מהחור הראשון. הסר את אבק העצם על ידי השקיה עם סביב אחד עד שני מיליליטר של PBS סטרילי ולנקות את הגולגולת.לאחר מכן, להדק את ברגי העוגן על ידי שניים עד שלושה סיבובים מלאים. הכנס קטטר באורך שני מילימטר דרך החור הראשון בניצב אל פני הגולגולת. בעוד עדיין מחזיק את הקטטר, להחיל קצת מלט דנטלי ולתת לו פילמור עם חשיפה קצרה לאור ריפוי השיניים על מנת לייצב את הצנתר.לאחר מכן להחיל יותר מלט דנטלי סביב הקטטר, לעגן את הברגים, ולבסס את המלט הדנטלי עם אור ריפוי השיניים במשך כ 15 עד 30 שניות, לאשר כי המלט מוקשח. לאחר ההשתלה, סגור את העור עם תפרים הניתנים למיחזור הקדמיים, ואחוריים אל הצנתר. ואז להזריק את תערובת הנוגדן תת עורית.לאחר מכן, לנהל 2.5% enrofloxacin על ידי הזרקה תת עורית לטיפול אנטיביוטי מניעתי. להחזיר את החיה לכלוב שונה ולשמור אותו תחת השגחה במשך שעה עד שלוש שעות עם יישום של אור אינפרא אדום כדי למנוע היפותרמיה. חזור על הטיפול enrofloxacin ולנהל carprofen במיליגרם אחד למיליליטר תת עורית להקלה על הכאב על ידי הזרקה יום לאחר הניתוח.כדי להכין את תערובת החיסונים, חבר שני מזרקי זכוכית עם קצה מנעול נמוך ב-10 מיליליטר לזרועות הקצרות של עצירה משולשת, וסגור את השקע השלישי בזרוע הארוכה. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של IFA ו 50 מיקרוגרם של rMOG יחד. ולהתאים את התערובת לנפח סופי של שני מיליליטר עם PBS סטרילי.מניחים את תערובת IFA ו rMOG מדוללת במזרק הפתוח, ולאחר מכן להכניס את הבוכנה בעדינות תוך שמירה על לחץ רופף על הבוכנה הנגדית. תחליב את inoculum על ידי נהיגה אותו ממזרק אחד לשני באמצעות דוחף את הבוכנות הלוך ושוב עד שהוא לבן וצמיג. לאחר מכן, תקן מזרק מנעול תחתון של מיליליטר אחד לזרוע הקצרה הפתוחה של העצירה המשולשת ומלא אותו באינוקום.מפיצים את כל האינוקולום למזרקי מיליליטר אחד ושומרים אותם על קרח עד ההזרקה. לאחר מכן, להזריק 200 microliters של תערובת IFA ו rMOG תת עורית בבסיס הזנב תחת הרדמה איזופלורן זמני באמצעות מחט 21 מד. להזרקת ציטוקינים תוך-מוחיים, התאם את אורך הצינורית המחברת לשני מילימטרים.ממלאים מזרק מיליליטר אחד בתערובת הציטוקינים. לאחר מכן, חבר את המזרק לחיבור הצינורית המחברת. לאחר מכן, למלא את הצינורית עם תערובת ציטוקינים, להימנע מיצירת כל בועות.לאחר מכן, הר את המזרק על משאבת המזרק הניתן לתכנות ולתכנת אותו להזריק בקצב של 0.2 מיקרוליטרים לדקה. התחל את המשאבה ולשמור אותו עובד על מנת למנוע היווצרות בועת אוויר בקצה הצינורית. לאחר מכן, להסיר את כובע הקטטר עם מפרצון.הכנס את הצינורית המחבר לתוך הצנתר, בורג ומהדק אותו. לאחר מכן לאפשר את הזריקה להמשיך במשך 10 דקות לפני עצירת המשאבה. השאירו את הצינורית בתוך הקטטר במשך 20 דקות כדי לאפשר את הנפח המוזרק לפזר באופן מלא.לאחר מכן, לפתוח את הצינורית המחבר ולהסיר אותו לאט כדי למנוע אפקט ואקום. לחבר מחדש את מכסה הקטטר עם המפרצון ולברג אותו. אפשר לחיה להתאושש מההרדמה בכלוב.demyelination קליפת המוח ניתן להעריך בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת ציטוקינים על ידי היסטוכימיה אימונו עבור PLP. איור 6A מראה חיסון PLP שלם ביום ה-15 בחית בקרה מחוסנת מוגית שקיבלה רק PBS סטרילי דרך הצנתר המושתל. ביום הראשון לאחר הזרקת הציטוקינים, demyelination כבר יכול להיות מזוהה בבעלי חיים ראשוניים MOG.אם כי, רק בקרבת האזור הצנתור. החיסון PLP נשאר שלם בקליפת המוח הנגדית יום אחד לאחר הזרקת ציטוקינים. ביום השלישי, ניתן היה לראות עלייה הדרגתית באובדן תגובתיות האימונו PLP, המתפשטת בקליפת המוח האיסיליטרלית.Demyelination קליפת המוח Contralateral יכול להיות מזוהה גם ביום השלישי, אבל זה מוגבל למדי לאזור מתחת ברגי העוגן. בין ימים 9 עד 15, demyelination משפיע על חלקים גדולים של קליפת המוח של שתי ההמיספרות. demyelination קליפת המוח הוא מתמשכת עד 30 ימים לאחר הזרקת ציטוקינים בשתי ההמיספרות עם remyelination חלקי בלבד.איור 6J מראה כימות של אובדן PLP בחומר האפור הקליפתי לאחר הזרקת ציטוקינים תוך-מוחיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור demyelination של חומר אפור באמצעות חיסון תת-אקליני נגד חלבוני מיאלין, ואחריו הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים דרך הצנתר המושתל. מודל חייתי זה יכול לעזור לחוקרים בחקר סוגים מתקדמים של טרשת נפוצה, ירידה בחומר אפור שכבה היא סימן שלם.הצנתר המושתל מאפשר סבבים מרובים של demyelination או משלוח בין-גזעי של תרופות טיפוליות פוטנציאליות העוברות חקירה פרה קלינית מבלי לגרום לטראומה הנגרמת על ידי הזרקה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

דגם מרחק איסכמיה מוחית על ידי ספיגה תפר Endovascular של עורק המוח התיכון עכברוש

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

ג&#39;ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

הזרקת דם עצמיים על דגם דימום intracerebral ספונטנית עכברים

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

הקלטת פוטנציאל עוררה חזותית במודל עכברוש של demyelination עצב אופטי הניסויי

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

יצירת מודלים העכבר עבור וירוס Zika-induced הפרעות נוירולוגיות באמצעות הזרקת גרם אסטרטגיות: עובריים Neonatal, למבוגרים

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...