Name: rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines
Uploaded: 2021-09-21T13:00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить всех сотрудников Института биомедицинских исследований при Медицинском университете Граца за помощь и сотрудничество, а также Кристофера Джона Райтона за корректуру рукописи.

Авторам нечего раскрывать.

Наш метод использует крыс DA. Адаптация к мышам, вероятно, потребует использования меньшего катетера и винтов. Следует также иметь в виду, что течение заболевания, воспалительная реакция и степень демиелинизации могут отличаться от того, что представлено здесь, если используется другой вид / штамм. Такие различия наблюдались с классическими моделями EAE с использованием различных штаммов мышей. НАпример, MOG92-106 крысьего происхождения приводил к первично-прогрессивной или вторичной прогрессирующей EAE у мышей A.SW, в то время как он индуцировал рецидивирующе-ремиттирующую EAE у мышей SJL / J46. Поэтому следует использовать животных одного и того же штамма. Гендерные различия в проявлении EAE также были зарегистрированы в различных предыдущих исследованиях24. Возникновение таких гендерных эффектов вполне можно было бы ожидать в связи с протоколом, описанным здесь, однако еще предстоит проверить в ходе дальнейших экспериментов.
Для хирургического вмешательства используется внутрибрюшинное (ИП) введение смеси анестетиков, содержащей 0,02 мг/мл фентанила, 0,4 мг/мл мидазолама и 0,2 мг/мл медетомидина. Взрослым самкам крыс DA весом 270 - 300 г требуется около 0,4 - 0,6 мл этой смеси(т.е.~ 1,5 мл / кг), чтобы вызвать анестезию продолжительностью 60 - 90 минут. После операции анестезия антагонизмируется подкожной инъекцией антидота, содержащего 0,07 мг/мл флумазенила и 0,42 мг/мл атипамезола в физиологическом физиологическом растворе (0,9% NaCl). Доза 1 - 1,5 мл/кг противодействовает анестезии в течение 5 мин. В качестве альтернативы животным может быть позволено просыпаться спонтанно после физиологического вымывания анестетиков, но в этом случае животных необходимо будет держать под наблюдением до тех пор, пока они не станут полностью сознательными.
Другие варианты анестезии, часто используемые для операций на животных, такие как инъекция IP кетамина и ксилазина47 или пентобарбитала натрия48или ингаляция летучих анестетиков, таких как изофторан49 и галотан50,также могут быть рассмотрены для операции, представленной здесь. Однако крайне важно выбрать анестетик, который не мешает предполагаемому последующему вмешательству (вмешательствам).
Во время иммунизации и внутримозгового введения цитокинов для анестезии используется 5% изофлуран. Модель, описанная здесь, была создана с использованием крыс, и перечисленные экспериментальные детали, таким образом, конкретно применимы к крысе. Координаты имплантации катетера были выбраны для одновременного анализа возможных изменений белого вещества (наконечник катетера в мозолистом теле). В то время как место введения катетера может варьироваться в отношении переднезадней и боковой позиции, выбор центральной борозды требует предотвращения повреждения верхнего сагиттального синуса.
Еще одной особенностью описанного способа является эквивалентное демиелинирование как ипси-, так и контралатерального полушарий, возможно, возникающее в результате носительства введенной цитокиновой смеси в субарахноидальное пространство физиологическим потоком интерстициальной жидкости из корковыхобластей 51. Режим инъекции, а не расположение катетера, следовательно, вызывает демиелинацию по всей коре головного мозга, и выбор правой или левой теменной коры должен, таким образом, быть несущественным в этом отношении.
В протоколе используется катетер 26 Г, который достаточно мал, чтобы избежать обширного травматического повреждения, и достаточно велик, чтобы избежать повышенной скорости засорения наконечника катетера в течение длительного курса эксперимента. Безусловно, имплантация и наличие самого катетера вызывают астроцитарную и микроглиальную активацию, также у контрольных животных, получающих только имплантацию катетера; однако это незначительно по сравнению с животными, вводимыми цитокинами. 43 Чтобы избежать каких-либо помех при последующих анализах, мы использовали МРТ-совместимые катетеры, изготовленные из поли-эфир-эфир-кетона (PEEK).
Подобная глубина демиелинизации, по сути, создается как в ипси-, так и в контралатеральных областях представленным методом. Это означает, что глубина /длина катетера может не играть важной роли в характере и степени демиелинизации в коре. Поэтому можно рассмотреть возможность модификации длины катетера, чтобы уменьшить размер поражения, вызванного катетером. Тем не менее, значительно более короткая длина катетера может вызвать немного менее выраженную кортикальная демиелинизация, в то время как окончательный ответ будет получен только в экспериментах, специально проверяя длину катетера.
Одним из преимуществ модели является то, что имплантированный катетер позволяет тестировать потенциальные терапевтические средства, вводимые в кору через катетер, чтобы обеспечить ремиелинацию на пике гистологически обнаруживаемой кортикальной демиелинизации (день 15 или позже), в то время как в условиях предварительной обработки это будет после иммунизации, но до инъекции цитокина. Таким образом, решение о сроках введения терапевтических средств будет зависеть от конкретного вопроса исследования и препарата, представляющий интерес.
После имплантации катетера важно размещать животных одиночными в модифицированных (предпочтительно с высоким верхом) клетках, чтобы избежать удаления катетера до конца исследования(рисунок 8). Животные могут также открутить крышку катетера с входом, хотя это происходит редко. Животные должны наблюдаться ежедневно, а снятые колпачки должны быть заменены на свежие, чтобы избежать закупорки наконечника катетера при отсутствии впускного входа и обеспечить точную доставку в паренхиму после внутримозговой инъекции. Животные иммунизируются не ранее чем через 2 недели после имплантации катетера, чтобы обеспечить заживление и закрытие гематоэнцефалических барьеров.
Титры анти-MOG в сыворотке крови должны быть измерены после иммунизации. Эксперимент «доза-реакция» показал, что 5 мкг MOG1-125 (в IFA) обеспечивают достаточную иммунизацию в течение 4 недель у взрослых самцов крыс DA. Титра в 5000 мкг/мл и выше было бы достаточно, но, безусловно, он будет зависеть от нескольких факторов, включая препарат MOG и штамм животных, и, таким образом, должен быть определен индивидуально. Важно избегать чрезмерно высоких доз антигенов, которые потенциально могут привести к классическому фенотипу EAE с парализованными задними конечностями еще до инъекции цитокина.
Каждое животное иммунизируется 5 мкг рекомбинантного миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (rMOG1-125),эмульгированного в 200 мкл неполного адъюванта Фройнда (IFA). Поскольку часть эмульсии теряется внутри шприца во время приготовления, желательно приготовить больше этого количества для каждого животного. Мы использовали рекомбинантный MOG (1-125 из N-конца КРЫСиного MOG), который экспрессировали в кишечной палочке и затем очищали до однородности хелатной хроматографией, растворяли в 6 М мочевины и диализовали против PBS для получения физиологического препарата52,53. Коммерчески доступный MOG, однако, также может быть использован.
Другие антигенные препараты, такие как MOG1-116,MOG35-55 или PLP139-151, используются в различных моделях EAE, а различия между антигенами и штаммами животных, как известно, вызывают различные фенотипы заболеваний в этих моделях20. Эти препараты антигена не тестировались на крысах DA и, если они использовались в предпочтении rMOG1-125,могли бы вызвать фенотип заболевания или результаты гистологии, отличающиеся от того, что представлено здесь.
Соединительная канюля той же длины, что и катетер, готовится перед внутримозговой инъекцией. Это можно сделать, собрав его с помощью шаблонного катетера и разрезав до одинакового размера (2 мм в длину)(рисунок 4). Важно, чтобы соединительная канюля была без пузырьков воздуха во время инъекции цитокина - поскольку объем инъекции составляет всего 2 мкл, даже крошечный пузырь воздуха на кончике канюли значительно уменьшит объем жидкости, успешно доставляемой в мозг. Это достигается путем поддержания работы насоса и введения канюли только тогда, когда на кончике присутствует растущая капля инъекционной жидкости. После введения канюли соединитель привинчивается к катетеру, избегая при этом чрезмерного затягивания, чтобы не повредить верхний наконечник катетера, что затруднит повторение после инъекции. Скорость инъекции 0,2 мкл/мин используется для предотвращения травмы, вызванной инъекцией. Кроме того, медленная инъекция в сочетании с 20-минутным периодом ожидания после инъекции обеспечивает диффузию введенной жидкости в интерстициальную жидкость и эффективный слив в ликвор. Затем канюля медленно удаляется, чтобы избежать эффекта вакуума.
Представленный метод включает хирургическое вмешательство и, следовательно, требует персонала, способного выполнять стереотаксическую операцию по выживанию. Персонал, набирающий непосредственный контакт с животными, должен был проходить соответствующие курсы экспериментов на животных. Остальная часть протокола может быть выполнена компетентными членами лаборатории.
Метод предназначен для получения вызванной воспалением демиелинизации коры головного мозга и не воспроизводит все особенности РС человека(например,возникновение очаговых воспалительных поражений белого вещества, что является отличительной чертой РС человека).

РС является иммуноопосредованным, воспалительным заболеванием ЦНС, которое в первую очередь повреждает миелиновые листы, но в конечном итоге приводит к потере аксонов и постоянному повреждению нейронов. РС является наиболее распространенным иммуноопосредованным заболеванием ЦНС с предполагаемой распространенностью около 2,3 миллиона человек во всем мире, по данным Национального обществаРС 1,и представляет собой серьезное личное и социально-экономическое бремя. Средний возраст начала заболевания составляет 30 лет и приводит к потере продуктивных лет, вызывая тяжелую инвалидность. РС в настоящее время неизлечим, и настоящие методы лечения направлены на управление симптомами во время острого рецидива при рецидивирующе-ремиттирующей РС и на изменение течения заболевания для снижения частоты рецидивов иммуномодулирующей терапией2,3. Ни один вариант лечения еще не доказал свою эффективность для прогрессирующих типов4,за исключением недавнего клинического испытания В-клеточной истощающей терапии, которая, как было показано, эффективна в подгруппе пациентов с первично-прогрессирующим РС (PPMS) с активным воспалением5. Хотя было идентифицировано несколько потенциальных генетических факторов6 и факторов риска окружающей среды7, этиология РС, однако, остается неизвестной.
РС характеризуется большими воспалительными демиелинизирующими бляшками и диффузными повреждениями белого вещества8,9. Очаговые поражения были связаны с обширной Опосредоточенная Т-клетками атака, разрушение олигодендроцитов, реактивный астроглиоз и аксональная дегенерация, приводящая к снижению двигательных нейронов. Демиелинизации серого вещества и атрофии получили признание в качестве дополнительных гистопатологических признаков заболевания9,10,11. Последнее было предложено способствовать неврологической дисфункции и снижению когнитивных функций у пациентов12,13 лет. Были выделены три паттерна кортикальной демиелинизации, а именно: i) лейкокортикальная, смежная с белым веществом поражения (34%), ii) мелкая, периваскулярная (16%) и iii) субпиальная (50%). В отличие от очаговых поражений белого вещества, эти поражения серого вещества, как сообщается, не имеют Опосредоточенную Т-клетками атаки и вместо этого характеризуются усиленной активацией микроглии, апоптозом и потерей нейронов12.
На сегодняшний день не удалось повторно оговорить РС человека на одной животной модели, во многом из-за сложности заболевания. Вместо этого были разработаны различные модели РС на животных, каждая из которых имитирует различные аспекты патогенеза и прогрессирования заболевания14,15. Современные модели животных имитируют три различных процесса заболевания: i) очаговые воспалительные поражения, ii) диффузное повреждение белого вещества и iii) диффузная патология серого вещества.
Исследования бляшек белого вещества РС на животных в основном проводились в моделях энцефаломиелита грызунов (EAE). Подопытных животных активно иммунизируют эмульсией, содержащей миелиновый антиген [обычно миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG)16,17,основной белок миелина (MBP)18или протеолипидный белок (PLP)19],вместе с полным адъювантом Фройнда (CFA)20. Заболевание также может быть пассивно индуцировано путем принятия переноса миелин-специфических Т-клеток21. Течение заболевания зависит от используемой комбинации антиген/штамм мыши. НАпример, MOG35-55 в C57BL/6 приводит к монофазному хроническому заболеванию22,в то время как PLP139-151 у швейцарских мышей Jim Lambert (SJL) приводит к рецидивирующе-ремиттирующей болезни23 гендерно-специфической манерой24. Крысиный MOG35-55,кроме того, индуцирует энцефалитогенный Т-клеточный ответ, в то время как человеческий MOG35-55 индуцирует В-клеточное воспаление у мышей C57BL/625. Различные модели EAE обеспечивают отличный инструмент для изучения клеточно-опосредованного воспаления, в первую очередь в спинном мозге и мозжечке, но структуры переднего мозга, такие как кора, мозолистое тело и подкорковые структуры, остаются в значительной степени щадящими26. Кроме того, ни диффузное повреждение белого вещества, ни демиелинирование серого вещества не воспроизводятся адекватно в моделях EAE26,27. Кортикальная демиелинизации, связанная с активной индукциейEAE,была зарегистрирована у мартышек28,29 и у некоторых подстразов крыс Льюиса, в последнем случае приписывается преобладающим комбинациям изотипов и аллелей30класса I и класса II MHC.
Купризоновая модель31 является полезным инструментом для изучения диффузной демиелинизации белого вещества и патологии серого вещества с обширной демиелинизации кортикальной, подкорковой32и гиппокампа33 областей, а также мозолистого тела34 и хвостатого путамина35. Интоксикация купризоном, которая, в принципе, приводит к метаболическому стресс-индуцированию апоптоза олигодендроцитов, имитирует некоторые характеристики кортикального демиелинизирующего поражения мозга РС, такие как активация микроглии, астроглиоз и относительное отсутствие инфильтрирующих периферических иммунных клеток. Отсутствие нейронального апоптоза и таламической атрофии, а также полное разрешение демиелинизации с надежной ремиелинизации, наблюдаемое при прекращении приема пищевых добавок купризона32,однако, ограничивают использование интоксикации купризоном в качестве доклинической модели РС. Токсическое демиелинирование также может быть индуцировано очаговой инъекцией лизолецитина или бромида этидия в тракты белого вещества36,37,но эти методы используются редко. Модели токсической демиелинизации особенно подходят для анализа сложных механизмов ремиелинизации, таких как потребность в клетках-прародителях олигодендроцитов и астроцитах38,39. Подробная информация о моделях EAE и интоксикаций приведена в двух последних обзорах15,40.
Цитокин-индуцированная демиелинация была первоначально разработана для изучения поражений белого вещества позвоночника в EAE41. Позже он был модифицирован для изучения патологий серого вещества коры у MS. Темные агути (DA) или крысы Льюиса сначала праймированы субклинической иммунизацией MOG1-12542,43 или MOG1-11644 в неполном адъюванте Фройнда (IFA). В отличие от классических моделей EAE, эти праймлированные животные не проявляют клинических симптомов очаговых воспалительных поражений в спинном мозге. Вместо этого воспалительная реакция и демиелинация в головном мозге впоследствии достигаются внутримозговым введением провоспалительной цитокиновой смеси [фактор некроза опухоли альфа (TNFα) и интерферон гамма (IFNγ)], как только животные достигли стабильного титра анти-MOG антител в крови.
Исследования Мерклера и др. 42 и Гарднер и др. На фиг.44 доказана эффективность индукции субпиальной кортикальной демиелинизации субклинической иммунизацией MOG и внутримозговой или субарахноидальной инъекцией цитокинов. Однако заявленная продолжительность демиелинизации была слишком короткой - полная ремиелинация происходила через 14 дней или менее, тем самым ограничивая окно для любого фармакологического интервенционного тестирования. Кроме того, обе модели используют травматический инъекционный модус, который может сами по себе вызвать инъекционную травму и разрушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и, таким образом, привести к неконтролируемому набору воспалительных клеток в паренхиму. Кроме того, оба исследования продемонстрировали демиелинацию, которая ограничена ограниченной областью, в ипсилатеральной коре или в непосредственной близости от места инъекции цитокина.
Чтобы преодолеть эти ограничения, мы имплантировали катетер в правую теметальную кору крыс DA, причем наконечник катетера расположен чуть выше мозолистого тела. Чтобы обеспечить полное восстановление целостности ГЭБ, животным был предоставлен период покоя в 2 недели после имплантации катетера. Впоследствии крысы были субклинально иммунизированы 5 мкг рекомбинантного MOG1-125 в IFA. После достижения стабильного титра антител против MOG примерно через 4 недели 2 мкл цитокиновой смеси вводили через катетер в течение 10 мин с использованием программируемого шприцевого насоса. Эта процедура вызвала широко распространенную кортикальную демиелинизации как ипси-, так и контралатерального полушарий головного мозга через 15 дней, с частичной ремиелинией около 30 дней после инъекции цитокина43. Кроме того, множественные фазы демиелинизации могут быть вызваны повторным введением провоспалительных цитокинов через катетер, а глобальная атрофия мозга, общая черта прогрессирующих подтиповРС 45,может быть вызвана уже после второй фазы демиелинизации43. Важно отметить, что имплантированный катетер также может быть использован для тестирования фармакологических вмешательств.
Протокол, описанный ниже, предоставляет подробное объяснение экспериментальных этапов для воспроизводимой генерации широко распространенной кортикальной демиелинизации в обоих полушариях головного мозга крыс DA с использованием внутримозгового катетера.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Adult male Dark Agouti rats (300 &#177;25 g)&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fentanyl</td>
			<td style="width:267px;">Hameln pharma plus, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">&#160;as Fentanyl-Citrate, 50 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Midazolam</td>
			<td style="width:267px;">ERWO Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;">50039017</td>
			<td style="width:267px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Medetomidin&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Orion Pharma, Finland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Flumazenil&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Roche, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">0.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Atipamezol&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Orion Pharma, Finland</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10% povidone-iodine complex&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Mundipharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dental cement&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus Kulzer, Germany</td>
			<td style="width:145px;">6603 7633</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Physiological saline solution&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fresenius Kabi, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">P3813</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:267px;">AbbVie, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lubricating eye drops&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Thea Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:269px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:267px;">Merck, Germany</td>
			<td style="width:145px;">1070172511</td>
			<td style="width:267px;">Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">2.5% enrofloxacin</td>
			<td style="width:267px;">Bayer, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Prophylactic antibiotics&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">carprofen</td>
			<td style="width:267px;">Pfizer, USA</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Painkillers, 50 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">P9416</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pentobarbital&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Richter Pharma, Austria</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">pentobarbital sodium, 400 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Interferon gamma&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PeproTech, USA</td>
			<td style="width:145px;">&#160;400-20</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tumor necrosis factor alfa</td>
			<td style="width:267px;">R&#38;D Systems, USA</td>
			<td style="width:145px;">510-RT-050/CF</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="107">
			<td height="107" style="height:107px;width:269px;">rMOG1-125</td>
			<td style="width:267px;">own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;">Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Anti-MOG antibody&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan</td>
			<td style="width:145px;">AS-555157</td>
			<td style="width:267px;">Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Incomplete Freund&#8217;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">&#160;F5506</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan</td>
			<td style="width:145px;">AS-555157</td>
			<td style="width:267px;">Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:145px;">A9576</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Peroxidase substrate solution</td>
			<td style="width:267px;">Vector Laboratories, USA</td>
			<td style="width:145px;">SK-45000</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Stereotactic frame&#160;</td>
			<td style="width:267px;">David Kopf Instruments, USA</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Catheters, MRI suitable&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC315GPKXXC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dummy cannulas&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC315DCNSPC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plastic screws, MRI suitable&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8L080X093N01</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Connector cannula&#160;</td>
			<td style="width:267px;">PlasticsOne, USA</td>
			<td style="width:145px;">8IC313CXSPCC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Screw driver with 2mm tip-size</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill with flexible shaft extension&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Proxxon, Germany</td>
			<td style="width:145px;">NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,&#160;&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill bit, round, 0.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td style="width:145px;">REF310 104 001 001 009</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Drill bit, twisted, 1.3 mm&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td style="width:145px;">REF350 104 417 364 013</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">BB510</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scalpel handle&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">91003-12</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cotton tip applicator&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Henry Schein Medical, Austria</td>
			<td style="width:145px;">900-3155</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">14101-14, 14088-10&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">11002-12, 11251-35</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bulldog clamps&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Fine Science Tools, Germany</td>
			<td style="width:145px;">18050-35</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Homoeothermic blanket&#160;</td>
			<td style="width:267px;">TSE systems, Germany</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Infrared Lamp</td>
			<td style="width:267px;">Beurer, Germany</td>
			<td style="width:145px;">616.51</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dental curing light&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Guilin Woodpecker Medical, China</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Absorbable suture&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Johnson &#38; Johnson, Belgium</td>
			<td style="width:145px;">V792E</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Programmable syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:267px;">World Precision Instruments, USA</td>
			<td style="width:145px;">AL-1000</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Exam gloves</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Surgical gown</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Electric Shaver</td>
			<td style="width:267px;">Aesculap, Germany</td>
			<td style="width:145px;">GT420</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Volatile anesthetic vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">CV 30-301-D</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:267px;">Air Liquide, Austria</td>
			<td style="width:145px;">19,113</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Volatile anesthesia chamber&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">PS-0347</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Anesthesia mask for rats&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Rothacher Medical, Switzerland</td>
			<td style="width:145px;">PS-0307-A</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1 ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Codan, Denmark</td>
			<td style="width:145px;">REF 62.1612</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">26 Gauge needle for injection&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">4657683</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">20 Gauge needle for cytokine injection and immunization&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:145px;">4657519</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Luer lock tip glass syringes&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Poulten &#38; Graf, Germany</td>
			<td style="width:145px;">7.140-37</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">3 way stopcock&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Becton Dickinson, Sweden</td>
			<td style="width:145px;">394600</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well plate&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:145px;">442404</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plate reader&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Cole-Parmer, USA</td>
			<td style="width:145px;">EW-1396-00</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">37&#176;C incubator</td>
			<td style="width:267px;">Kendro, Germany</td>
			<td style="width:145px;">50042301</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Micropipettes&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gilson, USA</td>
			<td style="width:145px;">F167350</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines

Рассеянный склероз (РС) является наиболее распространенным иммуноопосредованным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС) и постепенно приводит к физической инвалидности и смерти, вызванной поражениями белого вещества в спинном мозге и мозжечке, а также демиелинизации в сером веществе. В то время как обычные модели экспериментального аллергического энцефаломиелита подходят для исследования клеточно-опосредованного воспаления в спинномозговом и мозжечковом белом веществе, они не могут решить патологии серого вещества. Здесь мы представляем экспериментальный протокол для новой крысиной модели кортикальной демиелинизации, позволяющей исследуть патологические и молекулярные механизмы, приводящие к корковым поражениям. Демиелинизация индуцируется иммунизацией низкодозовым олигодендроцитарным гликопротеином (MOG) в неполном адъюванте Фройнда с последующей катетер-опосредованием внутримозговой доставкой провоспалительных цитокинов. Кроме того, катетер позволяет проводить несколько раундов демиелинизации, не вызывая травмы, вызванной инъекциями, а также внутримозговую доставку потенциальных терапевтических препаратов, проходящих доклиническое исследование. Метод также этически благоприятен, поскольку боль и дистресс или инвалидность животных контролируются и относительно минимальны. Ожидаемый срок реализации всего протокола составляет около 8 - 10 недель.

Кортикальная демиелинация может быть оценена в разные моменты времени после инъекции цитокина с помощью иммуногистохимии для протеолипидного белка (PLP)(рисунок 6). На рисунке 6A показана неповрежденная иммунореактивность PLP на 15-й день у MOG-иммунизированного контрольного животного, которое получало только стерильный PBS через имплантированный катетер. На 1-й день после инъекции цитокинов демиелинизация уже могла быть обнаружена у животных, загрунтованных MOG, хотя и только в непосредственной близости от катетеризованной области(рисунок 6B). Иммунореактивность PLP остается неповрежденной в контралатеральной коре через 1 день после инъекции цитокина. На 3 день можно наблюдать постепенное увеличение потери иммунореактивности ПЛП, которая распространяется в ипсилатеральной коре(рисунок 6С). Контралатеральная кортикальная демиелинация также может быть обнаружена на 3-й день(фиг.6D),но она скорее ограничена областью под анкерными винтами, возможно, из-за низкопоточной области интерстициальной жидкости, вызванной анкерными винтами43. Отсутствие аналогичного наблюдения у контрольных животных, вводимых ВБС, исключает возможность вызванной травмой демиелинизации, вытекающей из анкерного винта.
Между 9 - 15 днями демиелинизация поражает большие части коры обоих полушарий(рисунки 6E, 6Fи 6G). Это совпадает с наблюдением медленного поведения, хотя и без статистически значимого снижения двигательных навыков в ротарод-тесте43. Кортикальная демиелинация поддерживается до 30 дней после инъекции цитокинов в обоих полушариях(рисунки 6H и 6I)только с частичной ремиелинцией. На рисунке 6J показана количественная оценка потери PLP в сером веществе коры после внутримозгового введения цитокинов. Следует отметить, что иммунореактивность ПЛП еще не оценивалась после периодов более 30 дней; таким образом, мгновенное разрешение ремиелинизации, если таковое имеется, еще предстоит оценить с помощью дальнейших экспериментов. Второе введение цитокиновой смеси через имплантированный катетер через 30 дней после первой инъекции приводит к выраженной атрофии мозга на 15-й день(рисунок 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig1.jpg"> Рисунок 1:Подготовка катетера. (А иВ) Направляющая канюля и манекен канюля (катетерная колпачка с впускным отверстием) собираются и привинчиваются. (C) Затем катетер разрезается до 2 мм в размере с помощью скальпеля. Микроскопическое наблюдение показало, что использование ножниц для этой цели искажает круглую форму кончика канюли, и, тем самым, ее следует избегать. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig2.jpg"> Рисунок 2:Имплантация катетера. (А)Операция начинается с продольного разреза и удаления надкости. (Б, В) На этой панели показана маркировка места для катетера на 2 мм с задней стороны от Брегмы и 2,4 мм сбоку справа от сагиттального шва; а также места для отверстий, предназначенных для трех анкерных винтов с соответствующим расстоянием от катетера и лямбда. (D)После сверления отверстия катетера (диаметром 0,5 мм, с круглым наконечником сверла) и отверстий для анкерных винтов (диаметром 1,3 мм со скрученным сверлильной головкой) анкерные винты затягиваются. (E, F) Затем вводится катетер и вся установка стабилизируется полимеризующим зубным цементом. (G) Рана зашивается двумя или тремя узлами с передней и задней частью катетера. B = Брегма; L = лямбда; C = катетер; S1, S2 и S3 = места для отверстий для трех анкерных винтов. Шкала = 1 см. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig3.jpg"> Рисунок 3:Получение эмульсии rMOG/IFA. (A) Смесь rMOG, PBS и IFA эмульгируют путем нажатия инокулята от одного шприца к другому путем проталкивания поршней вперед и назад, (B) до тех пор, пока он не будет белым и вязким. (C) Впоследствии инокулят распределяют по 1 мл шприцев для инъекции. 5 мкг rMOG используется в 200 мкл смеси PBS/IFA для субклинальной иммунизации одной крысы; однако из-за потерь на кончиках и стенках шприцев во время приготовления следует приготовить больший объем. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig4.jpg"> Рисунок 4:Подготовка соединительной канюли. (A - D) Эти панели показывают, как соединитель и внутренний соединитель собираются с помощью канюли размером 2 мм. (E) Внутренняя часть вырезается до того же размера, что и направляющая канюля с помощью скальпеля(F),а затем направляющая шаблона откручивается. (G)Другой конец соединительной канюли закреплен на шприце 1 мл, который содержит инъекционную смесь, с помощью иглы 20 г. Шкала = 3 см. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig5.jpg"> Рисунок 5:Внутримозговая инъекция. (A)Программируемый шприцевой насос регулируется для скорости впрыска 2 мкл / мин, и шприц 1 мл, заполненный цитокиновой смесью (или стерильным PBS для органов управления), устанавливается на насос. (B)Животное сначала анестезируют в камере с использованием 5% изофлурана с потоком кислорода 2 л / мин, а затем (C) анестезию поддерживают через маску с использованием 2,5% изофлурана с потоком кислорода 1,5 л / мин. (D) Колпачок катетера с входом (фиктивная канюля) привинчивается, и инъекционная канюля вводится через имплантированный катетер. Поскольку объем инъекции очень мал, исследователь должен быть осторожен, чтобы избежать пузырьков воздуха на кончике канюли. По этой причине важно начинать вставку во время работы насоса и только тогда, когда на кончике растет пузырь жидкости. Дополнительный объем все равно не попадет в мозг, так как он разрушается поверх катетера перед введением. (E) Затем соединительную канюлю затягивают, и насосу дают работать в течение 10 минут. После 10 мин инъекции насос останавливают, а канюлю оставляют внутри на 15 - 20 мин, чтобы обеспечить диффузию вводимого объема в интерстициальную жидкость. Шкала стержней = 5 см, если не указано иное. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig6.jpg"> Рисунок 6:Иммунореактивность PLP в коронарных отделах мозга. (A) На этой панели показан контрольный мозг (MOG-праймированный) с инъекцией PBS (день 15), который не приводит к кортикальной демиелинизации. (B) Уже на 1-й день после инъекции цитокинов демиелинизация проявляется в области катетера. (C)Более широкая потеря иммунореактивности PLP наблюдается в ипсилатеральной коре на 3-й день(D),а также на контралатеральной стороне. Широко распространенная потеря иммунореактивности PLP наблюдается в обоих полушариях на 15-й день, так как(E)эта панель показывает ипсилатеральную кору и(F)эта панель показывает контралатеральную кору. (G)Обзор обоих полушарий приведен в демонстрации широко распространенной потери ПЛП на 15-й день. На 30-й день, поскольку(H)эта панель показывает ипсилатеральную кору и(I)эта панель показывает контралатеральную кору, все еще наблюдается замечательная демиелинация, но также могут наблюдаться некоторые ремиелинированные области. (J)На этой панели показана количественная оценка демиелинизации (потери PLP в мм2/полушарие). 1,5 - 2 мкм корональные участки мозга использовались для обнаружения PLP с MS anti-PLP с коэффициентом разбавления 1:500. Срезы были уравновешино гематоксилином для клеточных ядер. Для получения подробной информации об иммуногистохимии см. Ucal et al. 43. Панели G и J были изменены по сравнению с Ucal et al. 43. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig7.jpg"> Рисунок 7:Атрофия мозга после второй инъекции цитокина. (A) На этой панели показан контрольный мозг (MOG-праймированный) с инъекцией PBS (день 15). (B)На 15-й день после первой инъекции цитокина вторая инъекция приводит к атрофии мозга в течение 15 дней. 1,5 - 2 мкм корональные участки мозга использовались для обнаружения PLP с MS anti-PLP с коэффициентом разбавления 1:500. Срезы были уравновешино гематоксилином для клеточных ядер. Для получения подробной информации об иммуногистохимии см. Blakemore37. Шкала = 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig8.jpg"> Рисунок 8:Модифицированные клетки для предотвращения удаления катетера животным. В стандартных клетках пространство держателя пищи на сетке расположено ближе к дну клетки, создавая рискованное узкое пространство, увеличиваемое вероятность запутывания катетера с сеткой и, тем самым, ее удаления. Чтобы этого избежать, клетку приходится модифицировать. Это узкое пространство было перекрыто прозрачной плоскостью, позволяющей соблюдать животное. Пища должна быть дана внутри клетки в этих модифицированных клетках. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines at JoVE.com

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Протокол, представленный здесь, позволяет воспроизводить широко распространенную демиелинацию серого вещества обоих кортиковых полушарий у взрослых самцов темных крыс Агути. Метод включает внутримозговую имплантацию катетера, субклиническую иммунизацию против миелинового олигодендроцитарного гликопротеина и внутримозговую инъекцию провоспалительной цитокиновой смеси через имплантированный катетер.

Крысиная модель широко распространенной церебральной кортикальной демиелинизации, индуцированной внутримозговой инъекцией провоспалительных цитокинов

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы генерировать широко распространенную демиелинацию коры обоих полушарий головного мозга в модели крысы с использованием субклинической иммунизации против гликопротеина миелина олигодендроцитов с последующей инъекцией цитокинов через имплантированный катетер. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях головного мозга, таких как рассеянный склероз. Основным преимуществом этого метода является то, что он может генерировать демиелинацию серого вещества, вызванную воспалением, в коре обоих полушарий головного мозга, не приводя к закупорке белого вещества.Последствия этого метода распространяются на лучшее понимание механизмов кортикальной демиелинизации, которая наблюдается в основном при прогрессирующих типах рассеянного склероза. Чтобы начать эту процедуру, соберите катетер и колпачок катетера с входом. Далее скальпелем разрезаем катетер на длину до двух миллиметров.Затем побрить голову обезболенной крысы между ушами с помощью электробритвы. Поместите крысу в стереотаксическую рамку и закрепите ее голову с помощью ушных перекладик и прикусной пластины. Убедитесь, что голова горизонтальна и проверьте ее устойчивость, надавливая на нее пальцем или щипцами.После этого нанесите смазывающие глазные капли, чтобы предотвратить сухость роговицы во время операции, накройте глаза непрозрачным материалом, чтобы предотвратить любое хирургическое воздействие света. Далее очищают бритую область, чередуя применение 70% этанола и 10%повидон йодного комплекса. Чтобы имплантировать катетер, сделайте продольный разрез длиной около двух сантиметров по средней линии.Затем используйте бульдожьи зажимы, чтобы держать кожу в стороны. Удалите кровь с помощью аппликатора из хлопкового наконечника. После этого удалите покостница, очистите ткань аппликатором хлопкового наконечника, обнажите череп и дайте ему высохнуть в течение примерно одной минуты.Далее выявляют анатомические ориентиры, лямбда, брегму и медиаальный шов. Установив дрель на стереотаксическую раму, расположите наконечник сверла в брегме в качестве отправной точки. Переместите два миллиметра с задней стороны от брегмы и на 2,4 миллиметра с боков к медиальному шву.Затем просверлите отверстие диаметром 0,5 миллиметра для катетера в этом положении. Просверлите еще три отверстия диаметром 1,3 миллиметра для анкерных винтов на расстояние нескольких миллиметров от первого отверстия. Удалите костную пыль путем орошения примерно одним-двумя миллилитрами стерильного PBS и очистите череп.Впоследствии затяните анкерные винты на два-три полных оборота. Вставьте катетер длиной два миллиметра через первое отверстие, перпендикулярное поверхности черепа. Все еще удерживая катетер, нанесите немного зубного цемента и дайте ему полимеризоваться с коротким воздействием света отверждения зубов, чтобы стабилизировать катетер.Затем нанесите больше зубного цемента вокруг катетера, закрепите винты и затвердите зубной цемент с помощью зубного отверждающего света в течение примерно 15-30 секунд, убедитесь, что цемент затвердел. После имплантации закройте кожу рассасываяся швами с передней и задней стороны катетера. Затем вводят смесь антидота подкожно.Далее вводят 2,5% энрофлоксацин путем подкожной инъекции для профилактического лечения антибиотиками. Верните животное в модифицированную клетку и держите его под наблюдением в течение одного-трех часов с применением инфракрасного света, чтобы избежать переохлаждения. Повторите лечение энрофлоксацином и вводят карпрофен по одному миллиграмму на миллилитр подкожно для облегчения боли путем инъекции на следующий день после операции.Для приготовления иммунизационной смеси соедините два 10-миллилитровых нижних стеклянных шприца с запорным наконечником к коротким рычагам трехстороннего запорного крана и закройте третье выходное отверстие длинным рычагом. Далее пипетка один миллилитр IFA и 50 мкг rMOG вместе. И отрегулируйте смесь до конечного объема в два миллилитра со стерильным PBS.Поместите разбавленный раствор IFA и rMOG в открытый шприц, затем аккуратно вставьте поршень, сохраняя при этом слабое давление на противоположный поршень. Эмульгируйте инокулятивный, перегоняя его из одного шприца в другой, толкая поршни вперед и назад, пока он не будет белым и вязким. Далее прикрепите один миллилитр нижнего стопорного шприца к открытому короткому плечу трехстороннего запорного крана и заполните его инокулятором.Распределите весь инокулят по одному миллилитру шприцев и держите их на льду до инъекции. Впоследствии вводят 200 микролитров смеси IFA и rMOG подкожно в хвостовое основание под временную изофлурановую анестезию с использованием иглы 21 калибра. Для внутримозговой инъекции цитокинов отрегулируйте длину соединительной канюли до двух миллиметров.Наполните шприц на один миллилитр смесью цитокинов. Затем подключите шприц к разъему канюли. Затем заполните канюлю смесью цитокинов, избегая создания пузырьков.Затем установите шприц на программируемый шприцевой насос и запрограммируем его на впрыск со скоростью 0,2 микролитра в минуту. Запустите насос и поддерживайте его в рабочем состоянии, чтобы избежать образования пузырьков воздуха на кончике канюли. После этого снимите колпачок катетера с помощью входного отверстие.Вставьте соединительную канюлю в катетер, закрутите и затяните ее. Затем дайте инъекции продолжаться в течение 10 минут, прежде чем остановить насос. Оставьте канюлю внутри катетера на 20 минут, чтобы введенный объем полностью рассеялся.Впоследствии открутите соединительную канюлю и медленно снимите ее, чтобы избежать эффекта вакуума. Прикрепите колпачок катетера к входу и прикрутите его. Дайте животному восстановиться после анестезии в клетке.Кортикальная демиелинация может быть оценена в разные моменты времени после инъекции цитокина с помощью иммуногистохимии для PLP. На рисунке 6А показана интактная иммунореактивность PLP на 15-й день у могги иммунизированного контрольного животного, которое получало только стерильный PBS через имплантированный катетер. На первый день после инъекции цитокина демиелинация уже могла быть обнаружена у первичных животных MOG.Хотя и только в непосредственной близости от катетеризированной области. Иммунореактивность PLP остается неповрежденной в контралатеральной коре через один день после инъекции цитокина. На третий день наблюдалось постепенное увеличение потери иммунорегионтности ПЛП, которая распространяется в ипсилатеральной коре.Контралатеральная кортикальная демиелинация также может быть обнаружена на третий день, но она скорее ограничена областью под анкерными винтами. Между девятым и 15-м дней демиелинизация поражает большие части коры обоих полушарий. Кортикальная демиелинация сохраняется до 30 дней после инъекции цитокина в обоих полушариях с лишь частичной ремиелинией.На рисунке 6J показана количественная оценка потери PLP в сером веществе коры после внутримозгового введения цитокинов. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как генерировать демиелинацию серого вещества с помощью субклинической иммунизации против миелиновых белков с последующим внутримозговой инъекцией цитокинов через имплантированный катетер. Эта животная модель может помочь исследователям в изучении прогрессирующих типов рассеянного склероза, слой серого вещества демиелинизации является целой меткой.Имплантированный катетер позволяет проводить несколько раундов демиелинизации или межмозговой доставки потенциальных терапевтических препаратов, проходящих доклиническое исследование, не вызывая травмы, вызванной инъекцией.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Фокусное церебральный Модель ишемии по эндоваскулярной окклюзии шов средней мозговой артерии в Крыса

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Гена Доставка в послеродовой мозга крысы по Non-желудочковой плазмиды инъекция и Электропорация

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Инъекции аутологичной крови в модели спонтанного внутримозгового кровоизлияния у мышей

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Двухслойный сотрудничества культуре первичных Крыса корковых нейронов и глии

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Интрацеребровентрикулярное Вирусный Инъекция по неонатологии мозга мыши для устойчив и распространен нейронов трансдукции

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Экспериментальная Демиелинизация и ремиелинизацию мышиной спинного мозга Focal инъекций лизолецитина

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

Визуальный вызванных потенциалов Запись в крысиной модели экспериментальной зрительного нерва демиелинизация

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Количественная оценка церебральной сосудистой архитектуры с использованием двухфотонного микроскопии в мышиной модели ВИЧ-индуцированной нейровоспаление

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Создание модели мыши Зика вирус-индуцированной неврологических расстройств, используя стратегии внутримозговых инъекций: эмбриональные, у новорожденных и взрослых

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...