Name: in situ measurement and correlation of cell density and light emission of bioluminescent bacteria
Uploaded: 2018-06-28T15:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות ולדיסלאו Maier (BMG Labtech GmbH) בשל תמיכתו בהקמת בתסריט כתוב עצמית עבור הקורא צלחת. עבודה זו נתמכה על ידי האוסטרים "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) כדי PM (P24189) ואת התוכנית PhD "DK מולקולרית אנזימולוגיה" (W901) עד בערב.

1. עיצוב, הכנה, ומביע לאקס אופרון ב- Escherichia coli
הערה: ראה טבלה של חומרים למידע על קיטים מסחריים להשתמש בסעיף זה.
<ol><li>לצורך העברת את אופרון לאקס לתוך החיידק לבחור וקטור מחמד סטנדרטי עם הגבלה מתאימה לאתרים של עמידות לאנטיביוטיקה ג'ין עניין (למשל, pET28a; NcoI, XhoI, kanamycin).</li>
	<li>עיצוב השברים, חופפים תחל להרכבה גיבסון, המבוססת על רצף הדנ א של Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).</li>
	<li>להגדיר תגובה PCR סטנדרטי עם תחל את תוכנן, ה-DNA גנומי מבודד של Photobacterium mandapamensis 27561 כתבנית (ראה חומר משלים תחל ותנאים). הערה: בידוד של דנ א גנומי של המתח חיידקי המתאימים מגבירה יעילות ה-PCR.</li>
	<li>לטהר המוצר PCR דרך ספין עמודות טיהור.</li>
	<li>ביצוע של עיכול הגבלה של וקטור pET28a מבודדים עם NcoI ו XhoI ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.</li>
	<li>לטהר את הווקטור ליניארית, שברי PCR ויה agarose ג'ל אלקטרופורזה וטיהור ספין עמודות עוקבות.</li>
	<li>לקבוע את ריכוז הדנ א של כל שבר, הווקטור ליניארית, לחשב הכמויות של האופטימלית עבור ההרכבה על פי פרוטוקול20,21. הערה: היעילות של הרכבה תלוי פרגמנט הגודל והמספר, חייב להיות מותאם על פי היצרן פרוטוקול20,21.</li>
	<li>לאחר שילוב כל שברי המאגר בצינור PCR, דגירה התערובת ההרכבה במכונה PCR ב 50 מעלות לשעה.</li>
	<li>להפוך את המוצר וקטור שהורכב על פי פרוטוקולים סטנדרטיים טרנספורמציה עבור פלסמיד חיידקי e. coli הסתדרותי המתאים e. coli מערכת לשכפול פלסמיד תשואה גבוהה (למשל, e. coli TOP10 או XL-1).</li>
	<li>לבחור מושבות מן הצלחת השינוי פס על לוחיות הרישוי עבור בידוד של דנ א.</li>
	<li>לבודד דנ א פלסמיד לפי פרוטוקולים סטנדרטיים.</li>
	<li>כדי לוודא הרכבה נכונה של פלסמיד כולל כל חלקי, תחילה לבצע מושבה PCR על פי פרוטוקולים סטנדרטיים באמצעות תחל ספציפיים עבור כל קטע התאספו.</li>
	<li>בנוסף המושבה PCR ו agarose הבאים בג'ל, להכין כל כיווני ההרכבה המבודד עבור רצפי DNA לוודא הרכבה נכונה של רצפי דנ א נכונה.</li>
	<li>להפוך את פלסמיד מאומת על פי פרוטוקולים סטנדרטיים טרנספורמציה עבור פלסמיד חיידקי e. coli הסתדרותי המתאים e. coli מערכת לייצור חלבון תשואה גבוהה (e.g.,E-קולי BL21). הערה: להמשיך ישירות עם ביטוי בפרוטוקול להלן. לאחסון ארוך יותר, מומלץ הכנת מלאי גליצרול.</li>
</ol>2. הביטוי של זנים ששונה e. coli
<ol><li>להכין תרבות לילה (שוב) לביטוי על ידי חיסון של אמצעי אחסון המתאים של מדיום ליברות (למשל, 100 מ ל) עם המניה גליצרול בעבר מוכן של התאים e. coli BL21 הפך את פלסמיד שהורכב או ישירות צלחת טרנספורמציה. להוסיף 100 µL של kanamycin (50 מ"ג/מ"ל; גן עמידות לאנטיביוטיקה של pET28a), דגירה. סרטן שעומדים של 37 ° C ו 120 סל ד ב שייקר אינקובטור בן לילה.</li>
	<li>לחסן התרבות הביטוי העיקרי (למשל, 800 מיליליטר בינוני ליברות) עם 8 מ ל סרטן שעומדים ולהוסיף µL 800 של kanamycin (50 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>דגירה התרבות המרכזית ב 37 ° C ו 120 סל ד ב שייקר אינקובטור עד צפיפות התא מגיע עם יתר600 של 0.6 - 0.8 (כ- 2.5 שעות).</li>
	<li>לצמצם את הטמפרטורה הדגירה 28 ° C.</li>
	<li>זירוז ביטוי חלבונים על-ידי הוספת IPTG ריכוז סופי של 0.1 מ מ. הערה: מבחנים אמפיריים הראו כי ההפחתה של הטמפרטורה 28 ° C נתן עוצמת האור הגבוה ביותר.</li>
	<li>להתבונן תאים עד שהם מתחילים זוהר (כ ג 1). הערה: בהתאם למטרת הביטוי, התאים גדלים עד למחרת, נקצרים מכן, או התאים יכולים להיות כל הזמן רועד כל עוד הם דולקים (מקסימום 48 שעות). קציר את התאים ואת טיהור של כל החלבונים יכול להיעשות על-פי נהלי.</li>
</ol>3. הבעה של זני חיידקים זוהרים
הערה: זני חיידקים זוהרים לדרוש צמיחה ספציפיים בינוני/מלאכותי ים מים בינונית עבור גידול והפקה אור.
<ol><li>להכין בינוני מים ים מלאכותי, מורכב משני הרכיבים בינוני מוכן בנפרד. הערה: הכנת המדיום מים ים מלאכותי הותאמה מן הפרוטוקול המקורי22. הסיכומים שלהלן מיועדות בינוני נוזלי 1 ליטר או 1 ליטר אגר בינוני.<ol>
<li>ים מלאכותי מים בינוני, שוקלים המלחים הבאים: 28.13 g NaCl, 0.77 גרם אשלגן כלורי, 1.60 g CaCl2 · 2H2O. 4.80 g MgCl2 · 6-אייץ '-2O, 0.11 g NaHCO3ו- 3.50 g MgSO4 · 7 שעות2O.</li>
		<li>להוסיף 1 ליטר של מים מזוקקים, לפזר את כל הרכיבים.</li>
		<li>LB בינוני, שוקלים את המרכיבים הבאים: תמצית שמרים 10 גרם, 10 גרם peptone, ועבור לוחות אגר אגר 20 גרם נוספים.</li>
		<li>להוסיף 250 מ של מי ברז, להמיס רכיבים.</li>
		<li>אוטוקלב שניהם מוכן מדיה בנפרד ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
		<li>עבור לוחות אגר, לשלב 250 מ ל LB בינוני עם 750 מ של מדיום מים ים מלאכותי ישירות לאחר autoclaving והכן צלחות.</li>
		<li>בינוני נוזלי, לשלב 250 מ ל LB בינוני עם 750 מ של מדיום מים ים מלאכותי ישירות לאחר autoclaving, או התקררה. הערה: המדיום מים ים מלאכותי עשוי לקבל עכורים דרך משקעים מלח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צובעות את זני חיידקים זוהרים על צלחות בינוני אגר מים ים מלאכותי, דגירה בין לילה ב 24-30 º C. הערה: זמן האחסנה של זני חיידקים מושגת בדרך כלל באמצעות הקפאת גליצרול מניות של התרבות חיידקי. זנים צריך תמיד להיות רץ בעירום על פלטות אגר קודם כדי להבטיח תנאי התחלה אחיד עבור כל זנים, לפני השימוש עבור תרבויות נוזלי, עקב שלב פיגור בצמיחה לאחר מפשיר.</li>
	<li>הכן של סרטן שעומדים על ידי מזריקים 100 מ ל ים מלאכותי מים בינונית עם מושבה בודדת מהצלחת. דגירה על. סרטן שעומדים ב 24-30 מעלות צלזיוס ו 120 סל ד ב שייקר אינקובטור בן לילה.</li>
	<li>לחסן 800 מיליליטר ים מלאכותי מים בינונית עם 8 מ של עוד.</li>
	<li>דגירה של תאים חיידקיים ב 24-30 מעלות צלזיוס ו 120 סל ד ב שייקר אינקובטור. הערה: הפרופיל עוצמת האור של חיידקים זוהרים משתנה בחום עם הטמפרטורה. בהתאם מנגנוני הרגולציה של הפקת אור המתח חיידקי בהתאמה, פליטת אור עשוי להתחיל לאחר כ- 1-6 h.</li>
	<li>להתבונן תרבית תאים חיידקיים עד שהם מתחילים זוהר (כ ג 1-6). הערה: בהתאם למטרת הביטוי, התאים גדלים עד למחרת, נקצרים מכן, או התאים יכולים להיות כל הזמן רועד כל עוד הם דולקים. קציר את התאים ואת טיהור של כל החלבונים יכול להיעשות על-פי נהלי.</li>
</ol>4. in Vivo פעילות וזמינותו של זני חיידקים זוהרים וללחצים ששונה e. coli
הערה: זמן האחסון של זנים הוא בדרך כלל acieved באמצעות הקפאת גליצרול מניות של התרבות חיידקי. זנים צריך תמיד להיות רץ בעירום על פלטות אגר קודם כדי להבטיח תנאי התחלה אחיד עבור כל זנים, לפני השימוש עבור תרבויות נוזלי, עקב שלב פיגור בצמיחה לאחר מפשיר.
<ol><li>פס המתח חיידקים זוהרים הרצוי או ששונה e. coli מסננים על צלחת אגר, דגירה-28 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: הטמפרטורה הדגירה יכולה להשתנות זן זן ויש לו להערכה מדעית. כדי להיות היכולת להשוות בין זני חיידקים זוהרים, ששונה e. coli זנים, תנאי הגידול צריך להיות זהה.</li>
	<li>לחסן 3 מ"ל של מדיום עם המתח בהתאמה עם מושבה בודדת מתוך צלחת אגר, דגירה התאים-28 ° C ו- 180 סל ד ב שייקר אינקובטור עבור 1-2 h.</li>
	<li>למדוד צפיפות תא 1:10 דילול של התרבות נוזלי-650 ננומטר. לחשב את יחס נפח לתרבות 1 מ"ל עם יתר650 של 0.05. הערה: וזמינותו קורא צלחת הבאים יקבעו את צפיפות התאים-650 nm כדי למנוע הפרעה על ידי פליטת אור של הזנים.</li>
	<li>Pipette הנפח מחושב של תרבות, בינוני לתוך צלחת עם קירות שחור 24-ובכן עם קרקעית זכוכית. עבור ששונה e. coli זן, להוסיף 1 µL של kanamycin (עמידות לאנטיביוטיקה של וקטור pET28a) µL 1 של IPTG (אינדוקציה של ביטוי גנים) הדגימות. במקום מכסה על הלוח כדי למנוע התאיידות במהלך המדידות. הערה: כדי להבטיח כי וקטור pET28a המכיל את אופרון כל לאקס לא ללכת לאיבוד על ידי התרבות e. coli , kanamycin להתווסף כל מדגם e. coli ב הבארות צלחת ולהבטיח את הפקת האור e. coli התאים ניתן למדוד, בביטוי הגן חייב להיגרם על ידי IPTG. כדי למנוע הפרעה crosstalk ומדידה, עם קירות שחור צלחות היטב עם רצפת הזכוכית, מכסה שקוף הראו התוצאות הטובות ביותר. למרות זאת, יכול להיות שנצפו crosstalk ויש עמדות טוב להיבחר בקפידה.</li>
	<li>להתחיל את המדידה קורא צלחת. הערה: פרוטוקול קורא צלחת מבוסס על תסריט שפותחה במיוחד עבור זה assay (ראה חומר משלים) המשלבת שתי מדידות, ספיגת ביולומינסנציה. נקודות נתונים נאספים כל 10 דקות ברעידות קבוע בין המדידות על טמפרטורה קבועה של 28 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widder, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+in+the+Ocean:+Origins+of+Biological+Chemical,+and+Ecological+Diversity.">Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity.</a> Science. 328 (5979), 704-708 (2010).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence,+Microbial.">Bioluminescence, Microbial.</a> Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).</li><li>Ulitzur, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+tetradecanal+as+the+natural+aldehyde+in+bacterial+bioluminescence.">Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).</li><li>Kurf&#252;rst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+postulated+structure+of+the+primary+emitter+in+the+bacterial+luciferase+reaction.">Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence.</a> Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Bioluminescence:+Organization,+regulation,+and+application+of+the+lux+genes.">Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes.</a> FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+Photobacterium+leiognathi+non-fluorescent+flavoprotein+with+limited+sequence+identity+to+bacterial+luciferase.">Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase.</a> J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+flavoprotein+related+to+the+subunits+of+bacterial+luciferase.">Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase.</a> EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+structural+features+of+the+luxF+protein+and+the+subunits+of+bacterial+luciferase:+Evidence+for+a+(&#946;&#945;)8+fold+in+luciferase.">Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (&#946;&#945;)8 fold in luciferase.</a> Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+refinement+of+the+non-fluorescent+flavoprotein+from+Photobacterium+leiognathi+at+1.60+&#197;+resolution.">Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 &#197; resolution.</a> J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).</li><li>Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+flavoprotein+FP390+from+a+luminescent+bacterium+Photobacterium+phosphoreum+refined+at+2.7+&#197;+resolution.">Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 &#197; resolution.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).</li><li>Bergner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biochemical+properties+of+LuxF+from+Photobacterium+leiognathi.">Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi.</a> Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).</li><li>Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+quorum+quenching+in+Vibrio+harveyi:+Lessons+learned+from+in+vivo+work.">Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work.</a> ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).</li><li>Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Genetics of bacterial bioluminescence.</a> Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).</li><li>Kelkar, M., De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+based+in+vivo+screening+technologies.">Bioluminescence based in vivo screening technologies.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).</li><li>Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+luciferase+reporters:+The+Swiss+army+knife+of+molecular+biology.">Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology.</a> Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).</li><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioluminescence living lights, lights for living. , (2013).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).</li><li>Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הקמת פלסמיד ביטוי המכיל ארבעה קטעים להלחין את אופרון כל לאקס-צלעות של mandapamensis פ 27561 הושגה באמצעות גיבסון שיבוט. ביטוי גנים זה e. coli מבוסס לאקס מאפשר לתאים e. coli פולטים אור. הימנעות חישת רגולציה, תנאי הגידול לא סטנדרטיים הם יתרונות משמעותי של מערכת זו.
יתרונות השימוש אסטרטגיה שיבוט גיבסון הם הרכבה קלה של שברי DNA ליניארי מרובים, גמישות גבוהה, אין צורך הגבלה ספציפית אתרי18,19,20. שיטה זו מאפשרת לשנות בקלות את אופרון לאקס , למעט גנים יחיד או אשכולות גנים או החדרת גנים חדשים או החלפת גנים מהמאמץ אחד עם השני. תנאי הכרחי ליישום של שיטה זו הוא הזמינות של רצף גנטי אופרון בהתאמה lux . רק עבור מספר קטן של חיידקים זוהרים הוא רצף הדנ א מלאה של אופרון בהתאמה לאקס מוכרות ו/או זמינות. רבים של רצפי אלה הם מפוצלים כי מופקות באמצעות רובה רצף. במקרה של ובדוקים mandapamensis פ 27561 רצף הדנ א מלאה של אופרון לאקס הוא ידוע וזמין ממסד הנתונים של ג'ין NCBI (GenBank: DQ988878.2).
צעד קריטי בפרוטוקול של האסיפה גיבסון הוא חישוב ריכוז ה-DNA של השברים יחיד. בפרוטוקול הרכבה של היצרן הומלץ להשתמש 0.2 - 0.5 pmols, הנפח הכולל של 20 µL 4-6 קטעים20,21. במקרה שלנו, איפה luxCDABFEG-ribEBH מורכב מ 4 חלקים, ריכוזים של נפחים היו 0.1 pmol 45 µL, בהתאמה, בהתאם התשואה של מוצרי ה-PCR. מצד אחד, הריכוז היה צריך להיות מופחת, מצד שני, אמצעי האחסון היה צריך להיות מוגברת. ובכל זאת, מכלול עבדו היטב, רצפי DNA אישר את הכניסה הנכון על הניסיון הראשון. ממצא זה אישר גיבסון הרכבה כשיטה המתאימה ועמיד לחקירה שלנו, אשר יכול בקלות להיות שונה18,19,20.
צלחת שהוקם קורא וזמינותו הוא קל לטפל בשיטה. הוא מאפשר ניתוח ראשוני פשוטה של חדש (un-) ידוע זני חיידקים זוהרים ונותן כבר רמז ראשון על מנגנון רגולטורי אור הייצור (למשל, לג בהפריה חוץ גופית-צפיפות התאים נמוך). בנוסף, בקלות ניתן להעריך תנאי הגידול בשילוב עם ייצור אור פשוט על ידי שינוי מדיום הגידול או טמפרטורה.
המדידות עם הקורא צלחת בוצעו ב 28 ° C. הסיבה להגדרה זו יוצאת דופן היא הרגישות לטמפרטורה של זני חיידקים זוהרים, איפה טמפרטורות מעל 30 מעלות צלזיוס להוביל פחות או אפילו אין צמיחה ו/או פליטת אור. שימו לב, כי הקורא צלחת הוא מסוגל לשמור טמפרטורה מוגדרים לאורך זמן עם המגבלה של חסר הפעיל מערכת הקירור. לכן, טמפרטורת הסביבה של חייב להיות מתחת הטמפרטורה של המדידה.
מהווה הוכחה של המושג, ההשוואה של הבונה e. coli עם המתח זוהרים mandapamensis פ (איור 5) מצד אחד ומדידות הפניה (איור 4) לעומת בוצעו ואשר האמינות של המערכת שזה עתה הוקם. בנוסף, מדידה ארוכת טווח הבטיח את תוחלת החיים של פליטת אור (איור 6). אבל צריך לשקול כי יתר הערכים אינם אמינים מעל צפיפות אופטית מסוימים, בהתאם המאפיינים של המכשיר בשימוש מדידה (כ 15 h במקרה הנוכחי) שבו יהיה צורך של דילול המתאים עבור מדידה ב טווח ליניארי של הגלאי. אלה סטיות גבוהה יתר הערכים לבצע מדידות זמן אלה לא אמין. לכן, מדידות קצרות כגון 10 h מומלץ שימוש את הגדרת הניסוי דיווחו כאן.
איור7 ניתן לראות מגבלות של צלחת הוקמה קורא וזמינותו. הקושי הוא למצוא הגדרה מתאימה של המדידה. 'להרוויח ערך' מכווננת את הרגישות של הצינור מכפיל צילום (PMT). הוא ההגברה של האות ב- PMT, כלומר גורם רווח גבוה יותר יגדיל את האות. אם רווח ערך נמוך מדי, האות לרעש יחס הופך גדול יותר בעוצמות אור של "נמוך" חיידקים זוהרים זוהר שאי אפשר למדוד כל (אותות יותר קרובה לאפס, הנתונים לא מוצג). האתגר ב assay זוהרים הוא להגדיר את הרווח אז תוצאות המדידה עבור כל זני חיידקים להישאר בטווח של המכשיר. בנוסף, טווח מדידה עבור הפריה חוץ גופית תלוי זמן מרווח זמן המדידה (למשל, מקסימום 2,000,000 1 s).
הרווח הוגדר 2800, היה נבדק מדעית, שבחרת עבור הקורא צלחת ספציפיים השתמשו להקמתה של שיטה זו. ההגדרה בשימוש רווח מאפשרת ההקלטה של האור הנפלט המרבי על ידי ביולומנאסן מערכת e. coli , פ mandapamensis 27561 ו mandapamensis פ S1 ללא גלישה, אבל עבור זנים mandapamensis פ TH1 ו- (פ') harveyi 14126 הרווח היה גבוה מדי. לכן, אלה זנים השנייה חורגת מהמגבלה של זיהוי, לא ניתן למדוד את עוצמת האור ממש מקסימלי. מגבלה טכנית זו עלולה למנוע את ההשוואה של חיידקים זוהרים, המציגות וריאציות גבוהה בפליטת אור מקסימלית, למרות תנאי הגידול וצפיפות התא יכול להיות דומה.
מיצוב של זנים חיידקי שנותחה בתוך הלוחות טוב בשימוש יש לעבור הערכה מדעית. למרות הצלחות טוב שחור עם תחתית זכוכית שימשו, נצפתה crosstalk בין הדגימות. עוצמת האור של זנים מסוימים הוא כל כך גבוה, כי כל הבארות הסמוכים יראה שווא חיוביים פליטת אור (למשל, ריק). לכן, חשוב למדוד שני זנים שונים בנפרד או עם הפרדה מרחבית מסוים אחד לשני.
ישנם כבר רבים ששינה זני החיידק הידוע המכילים חלקים אופרון לאקס , הם בעיקר מוכוונת יישומים15,16,17. בשיטות המתוארות כאן, מכוון מחקר בסיסי, לדוגמה את האפשרות לנתח כל הגן לאקס בנפרד. למרות המחקר של ביולומינסנציה יש היסטוריה ארוכה, יש עדיין הרבה שאלות פתוחות. למעט או החדרת גנים מ אופרון לאקס , מחליפים את הגנים luxAB עם גנים של עוד מאמץ או ניתוח חלבון מכלולי מוטבע בתוך קל לטפל e. coli המערכת והיישומים נוספת של צלחת הקורא assay, יתכן ניתן להשיג מידע נוסף על תהליכים רגולטוריים, הפונקציות של גנים lux .

פליטת האור על ידי אורגניזמים (ביולומינסנציה) הוא תהליך מרתק נמצאו חיידקים, פטריות, חרקים, נמטודות, דגים ופירות דיונונים1. פליטת אור זוהרים מגיח לתגובה chemiluminescent שבו אנרגיה כימית (חלקית) הופכת אנרגיית האור ("אור קר"). בחיידקים זוהרים, מזרז לוציפראז אנזים heterodimeric את monooxygenation של שרשרת ארוכה, aldehydes אליפטיות, כגון tetradecanal, כדי חומצות התואם את בליווי פליטת אור עם מקסימום-490 nm2, 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2.jpg"> איור 1 : תגובה כללית בסכמה לוציפראז חיידקי. חיידקי לוציפראז (LuxAB) מזרז את monooxygenation של שרשרת ארוכה aldehydes (CH3(CH2)nצ'ו) על-ידי ניצול מופחתת פלווין mononucleotide (FMNH2), חמצן מולקולרי (O2), מניב את המוצרים זמן שרשרת חומצות (CH3(CH2)nCOOH), פלווין mononucleotide (FMN), מים (H2O), את פליטת האור מרוכז 490 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
האנרגיה שפורסמו במהלך חמצון זה גורם של עירור FMN-4a-הידרוקסיד, אשר משמש האור emitting luciferin4. החלבונים המעורבים ביולומינסנציה חיידקים, כלומר LuxCDABEG, מקודדות על ידי אופרון לאקס , מאוד נשמרים על זני חיידקים שונים2,5. הגנים luxA ו- luxB קידוד עבור לוציפראז heterodimeric; מוצרי גן של luxC של luxD, של לוקס הם מרכיבים של רדוקטאז חומצת שומן מורכבות; luxG מקודד עבור רדוקטאז פלווין6. מספר של ביולומנאסן Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) נושאים את הגן נוספים luxF . דווח כי LuxF הוא חלבון homodimeric המאגד פלווין יוצא דופן נגזרת 6-(3'-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. גנים נוספים זוהו שהיו אחראים הריבופלאווין סינתזה (למשל, ribEBH), יתר על כן הרגולטורי הגנים דווח, כי תפקיד בוויסות חישה quorum של ביולומינסנציה, במיוחד עבור ויבריו פישרי ויבריו harveyi6,13. למרות סדר מאוד שנשמרת ג'ין, חיידקים זוהרים להראות וריאציות גבוהה במאפיינים כמו התנהגות גדילה, האינטנסיביות של פליטת אור, או ויסות ביולומינסנציה2,5,14 .
מספר זנים או פלסמידים המכיל חלקי או שלם lux operons ידועים, ניצול ביולומינסנציה כמערכות הכתב. יישומים שונים כגון קביעת מקדם פעילות, ניטור של חיידקי מציג בסביבת או דוגמאות מזון, ביולומינסנציה תהודה אנרגיה העברה (ברט), ויוו הדמיה של זיהומים היצורים האיקריוטים. pyrosequencing וכדומה היו הוקמה15,16,17. מעניין, שלושת תכוף כתב ביולומנאסן מערכות נגזרות של גחלילית בצפון אמריקה (Photinus pyralis) את הפתוגן המעית של נמטודות (Photorhabdus luminescens), אמנון ותמר ים (Renilla reniformis). אף אחד מערכות אלה ממקור חיידקי, אך השימוש לאקס גנים operons ממוצא חיידקי הוא צובר יותר עניין של מחקר יישומי16. היישום פחות בשפע של ביולומינסנציה חלבונים ממקורות חיידקי בעיקר עקב יציבות נמוכה יותר, תוחלת החיים של חיידקים נגזר חלבונים זורח, אשר יכול להיות קשור שלהם בתי גידול ימיים. חיידקים זוהרים של בתי גידול ימיים אינן cultivable תחת תנאי מעבדה סטנדרטיים. חיידקים אלו דורשות תקשורת צמיחה ספציפיים, תנאים, כגון טמפרטורות נמוכות ובינוניות צמיחה/דגירה מים ים מלאכותי (למשל, 28 ° C).
כדי לפשט את ההשוואה של לאקס אופרון מאפיינים או יחיד לאקס גנים של מגוון זני חיידקים שונים מייצרים אור, שיטה לתקנן את הביטוי אופרון לאקס וניתוח הוא תנאי הכרחי. לפיכך, הופיע הרעיון של שילוב של אופרון כל לאקס-צלעות החיידק תקן-מחקר Escherichia coli (e. coli). לענין זה, גיבסון הרכבה הוכיחה להיות כלי שימושי כדי לשלב מספר קטעים ליניארי, חופפים וקטור ביטוי אחד ללא צורך אתרי הגבלה ספציפית. שיטה זו מתאימה גם כשאתה מוסיף DNA גדולים מדי (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb אופרון גודל) הגברה באמצעות PCR. אופרון לאקס ניתן להפריד קטעים חופפים מרובים ולאחר מכן הניתנים להרכבה לתוך פלסמיד ביטוי אחד ונבדקה סוף סוף הרצף הרכבה המוצר יכול להיהפך ישירות לתוך המתאים e. coli מערכת עבור תשואה גבוהה חלבון ביטוי18,19,20. בנוסף קל לטפל e. coli המבוסס על ביטוי גנים לאקס , שיטה פשוטה המשלב הקלטה של צמיחת תאים, פליטת אור זוהרים נשארו שתוקם. השיטה המתוארת כאן מאפשר מדידה ב באתרו של צפיפות התאים והן פליטת אור של חיידקים זוהרים.
הניתוח של גנים לאקס לאקס אופרון וסדר. רגולציה של חיידקים שונים מייצרים אור עם, מצד אחד, מייצרים אור מלאכותי e. coli מערכת המכילה את אופרון כל לאקס-צלעות של פ mandapamensis יד 27561, מצד שני, וזמינותו קורא צלחת פיתח המשלב את ההקלטה בבאתרו של צפיפות התאים, פליטת אור, עוזר כדי לקבל מידע נוסף אודות חיידקי לאקס המערכות השונות. השוואה של luciferases ואנזימים הקשורים ואפיון היסוד הזה עלול להוביל חלופות למערכות כתב כבר הוקמה עם יציבות משופרת ופעילות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:896px;" width="895">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:115px;">E2621S</td>
			<td style="width:276px;">for 10 rxn 
			dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Q5 High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:115px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">K0721</td>
			<td>for 50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI)</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:115px;">R3193S/R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>for 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Monarch DNA Gel Extraction Kit&#160;</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:115px;">#T1020S</td>
			<td>for 50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJet Plasmid Miniprep Kit&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>for 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq G2 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:171px;">Promega</td>
			<td style="width:115px;">M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well black sensoplate with glass bottom</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:115px;">662892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLUOStar Omega plate reader&#160;</td>
			<td style="width:171px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">OPTIMA/Mars Analysis Software</td>
			<td style="width:171px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Version 2.20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsoft Excel 2010</td>
			<td style="width:171px;">Microsoft</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Multitron Standard Incubator Shaker</td>
			<td style="width:171px;">Infors AG</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ measurement and correlation of cell density and light emission of bioluminescent bacteria

יש מספר ניכר של חיידקים שמסוגל לפלוט אור. כולם חולקים האשכול גנטי זהה, כלומר אופרון לאקס . למרות הדמיון הזה, חיידקים אלו מראים קיצוניים מאפיינים כמו התנהגות גדילה, האינטנסיביות של פליטת אור או ויסות ביולומינסנציה. השיטה המוצגת כאן היא assay פיתח המשלב הקלטה של צמיחת תאים ועוצמת פליטת אור זוהרים לאורך זמן ניצול קורא צלחת. הצמיחה וכתוצאה מכך ואת פליטת אור מאפיינים יכולים להיות מקושרים לתכונות חשובות של המתח חיידקי המתאימים, כגון חישת רגולציה. הטיפוח של מגוון רחב של חיידקים זוהרים דורש מדיום מסוים (למשל, מים ים מלאכותי בינוני), שהוגדרו טמפרטורות. קל לטפל, תקן-מחקר שאינם מייצרים אור החיידק Escherichia coli (e. coli), מצד שני, יכול להיות מעובדות בזול בכמויות גבוהות בקנה מידה מעבדה. ניצול e. coli על ידי החדרת של פלסמיד המכיל את כל לאקס אופרון יכולים לפשט את תנאי הניסוי, בנוסף ונפתח אפשרויות רבות עבור יישומים עתידיים. הביטוי של כל הגנים לאקס ניצול זן בביטוי e. coli הושגה על ידי בניית פלסמיד ביטוי דרך גיבסון שיבוט והוספה של ארבעה קטעים המכיל שבעה גנים לאקס , שלוש צלעות הגנים של אופרון לאקס-צלעות לתוך וקטור pET28a. E. coli המבוסס על ביטוי גנים לאקס המושרה ונשלט באמצעות תוספת איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) וכתוצאה מכך ביולומנאסן e. coli תאים. היתרונות של מערכת זו הם כדי למנוע חישת מגבלות רגולציה ויצירות בינוני מורכבים יחד עם תנאי הגידול לא סטנדרטיות, כגון שהוגדרו טמפרטורות. מערכת זו מאפשרת ניתוח של לאקס גנים והגומלין שלהם, על ידי הכללת הגן בהתאמה מ אופרון לאקס , או אפילו תוספת של הרומן גנים, מחליפים את הגנים luxAB של זן חיידקי אחד במשנהו, או ניתוח מתחמי חלבון, כגון luxCDE.

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria at JoVE.com

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

חיידקים זוהרים לווסת ייצור אור באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, כגון חישת צפיפות. שיטה חדשנית זו מאפשרת החקירה ב באתרו של ביולומינסנציה הקורלציה של פליטת אור לדחיסות התא. מייצרים אור מלאכותי Escherichia coli מערכת מאפשרת אפיון lux operons, לאקס חלבונים והגומלין שלהם.

בחיי עיר ובחינת המתאם של צפיפות התאים ואת פליטת אור של חיידקים זוהרים

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

אופטימיזציה של הצמיחה של גבישי אנדותיאפפסין לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

אופטוגנטיקה ביולומינסנטית 2.0: רתימת ביולומינציה להפעלת חלבונים פוטו-חושיים במבחנה וב-Vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

מכשיר טיפול פוטודינמי מבוסס דיודה פולטת אור הבנוי בתוך הבית להגברת ציטוטוקסיות של חוליות במודל תרבית תאים דו-ממדית

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...