Name: in situ measurement and correlation of cell density and light emission of bioluminescent bacteria
Uploaded: 2018-06-28T15:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria at JoVE.com

Мы хотим поблагодарить Владислав Майер (BMG Labtech GmbH) за его поддержку в создании самостоятельной письменность для читателя пластины. Эта работа была поддержана австрийского «Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Тюрингия» (FWF) до вечера (P24189) и программы PhD «ДК молекулярной энзимологии» (W901) до вечера.

1. Проектирование, подготовка и выражение люкс Оперон в Escherichia coli
Примечание: Смотрите Таблицу материалов для получения информации о коммерческих наборы, используемые в этом разделе.
<ol><li>Для передачи Оперон люкс в E. coli выберите Стандартный ПЭТ вектор с места соответствующие ограничения и антибиотикам ген интереса (например, pET28a; NcoI, XhoI, канамицин).</li>
	<li>Дизайн фрагменты и перекрывающихся Праймеры для Ассамблеи Гибсон, основанный на последовательности ДНК Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).</li>
	<li>Настройка стандартной реакции PCR с дизайном грунты и изолированные геномной ДНК Photobacterium mandapamensis 27561 как шаблон (см. Дополнительные материалы для грунтовки и условий). Примечание: Изоляции геномной ДНК бактериального штамма соответствующих повышает эффективность ПЦР.</li>
	<li>Очищайте продукт PCR через очищение спин колонки.</li>
	<li>Выполните пищеварение ограничения изолированной pET28a вектора с NcoI и XhoI при 37 ° C на 45 мин.</li>
	<li>Очистить линеаризованного вектора и ПЦР фрагментов через агарозы гель электрофореза и последующих спин колонки очистки.</li>
	<li>Определение концентрации ДНК каждого фрагмента и линеаризованного вектора и рассчитать оптимальное количество для Ассамблеи согласно протокола20,21. Примечание: Эффективность Ассамблеи зависит размер фрагментов и номер и корректироваться согласно производителя протокол20,21.</li>
	<li>После объединения всех фрагментов и буфера в ПЦР-пробирку, Инкубируйте Ассамблея смесь в машину ПЦР при 50 ° C за 1 час.</li>
	<li>Трансформировать собранный продукт вектор согласно протоколы стандартные преобразования для преобразования бактериальных плазмид E. coli в соответствующей E. coli система для высокодоходных плазмида репликации (например, кишечной палочки TOP10 или XL-1).</li>
	<li>Выберите колоний от преобразования пластины и полоска на новые пластины для изоляции ДНК.</li>
	<li>Изолируйте плазмида ДНК по стандартным протоколам.</li>
	<li>Чтобы проверить правильную сборку плазмида, включая все фрагменты, сначала выполните колонии PCR согласно стандартных протоколов с помощью грунтовки, специфичных для каждый собранный фрагмент.</li>
	<li>Дополнительно к колонии PCR и последующих геля агарозы, подготовьте все изолированные Ассамблеи векторов для секвенирования ДНК для проверки правильной сборки и правильной последовательности ДНК.</li>
	<li>Трансформировать проверенных плазмида согласно протоколы стандартные преобразования для преобразования бактериальных плазмид E. coli в соответствующей E. coli система для производства белка высокодоходных (e.g.,E. coli BL21). Примечание: Продолжите непосредственно с протоколом выражение ниже. Для более длительного хранения рекомендуется подготовке биржевых глицерин.</li>
</ol>2. выражение штаммов модифицированных E. coli
<ol><li>Подготовьте ночь культуры (ONC) для выражения, прививка соответствующего объема LB среды (например, 100 мл) с ранее подготовленными глицерина запас E. coli BL21 клеток превращается с собрал плазмида или непосредственно из преобразования пластины. 100 мкл канамицин (50 мг/мл; антибиотикам ген pET28a) и инкубировать ONC при 37 ° C и 120 об/мин в шейкер инкубатор на ночь.</li>
	<li>Прививать культуру основные выражения (например, 800 мл среды LB) с 8 мл ONC и 800 мкл канамицин (50 мг/мл).</li>
	<li>Инкубировать основной культуры при 37 ° C и 120 об/мин в шейкер инкубатор, до тех пор, пока плотность клеток достигает ОД600 0,6 - 0,8 (примерно 2,5 часа).</li>
	<li>Снижение температуры инкубации до 28 ° C.</li>
	<li>Побудить выражение протеина, добавив IPTG до конечной концентрации 0,1 мм. Примечание: Эмпирические тесты показали, что снижение температуры до 28 ° C дал высокие интенсивности света.</li>
	<li>Соблюдайте клетки, пока они не начинают блестящие (примерно 1 час). Примечание: В зависимости от цели выражения, клетки растут пока на следующий день и затем собирают, или клетки может быть постоянно тряски до тех пор, как они сияют (максимум 48 часов). Заготовка клетки и очистки любой белков может быть сделано в соответствии со стандартными процедурами.</li>
</ol>3. выражение биолюминесцентных штаммов бактерий
Примечание: Штаммы бактерий биолюминесцентных требуют определенного роста среднего/искусственный морской воды среднего для легких производства и роста.
<ol><li>Подготовка среднего искусственное море воды, состоит из двух отдельно подготовленных компонентов среды. Примечание: Подготовка среднего искусственный морской воды был адаптирован от оригинального протокола22. Следующие суммы являются для жидкой среды 1 Л или 1 L агар среднего.<ol>
<li>Для средних искусственный морской воды, весят в следующих солей: 28.13 г NaCl, 0,77 г KCl, 1,60 g CaCl2 · 2H2O, 4.80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3и 3,50 г MgSO4 · 7H2O.</li>
		<li>Добавить 1 Л дистиллированной воды и растворяет все компоненты.</li>
		<li>Для средних LB, весят в следующие ингредиенты: экстракт дрожжей 10 g, 10 g Пептон и за дополнительные 20 g агар агар пластины.</li>
		<li>Добавьте 250 мл водопроводной воды и распустить компонентов.</li>
		<li>Автоклав обеих подготовлен СМИ отдельно при температуре 121 ° C для 20 мин.</li>
		<li>Для плиты агара сочетать 250 мл среды фунтов с 750 мл искусственное море водной среды непосредственно после автоклавирования и готовить тарелки.</li>
		<li>Для жидкой среды сочетают 250 мл среды фунтов с 750 мл искусственное море водной среды непосредственно после автоклавирования или когда остынет. Примечание: Средство искусственный морской воды может получить мутная через соль осадков.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Полоска биолюминесцентных штаммов бактерий на искусственный морской воды средних агар пластины и Инкубируйте на ночь на 24-30 ° C. Примечание: Длительное время хранения штаммов бактерий обычно достигается за счет замораживания глицерин запасы бактериальной культуры. Штаммы всегда должен быть прожилками на плитах агара сначала обеспечить равномерное стартовые условия для всех штаммов, до использования жидкого культур, из-за запаздывания фазы роста после оттаивания.</li>
	<li>Подготовьте ONC прививки 100 мл искусственное море водной среды с единой колонии от пластины. Инкубируйте ONC на 24-30 ° C и 120 об/мин в шейкер инкубатор на ночь.</li>
	<li>Прививать 800 мл с 8 мл ONC искусственное море водной среды.</li>
	<li>Инкубируйте бактериальные клетки в 24-30 ° C и 120 об/мин в шейкер инкубатор. Примечание: Профиль интенсивности света биолюминесцентных бактерий сильно зависит от температуры. В зависимости от механизмы регулирования света производства соответствующих бактериальный штамм светового излучения может начаться после примерно 1-6 ч.</li>
	<li>Соблюдайте культуру бактериальных клеток, до тех пор, пока они начинают блестящие (около 1-6 h). Примечание: В зависимости от цели выражения, клетки растут пока на следующий день и затем собирают, или клетки может быть постоянно тряски до тех пор, как они сияют. Заготовка клетки и очистки любой белков может быть сделано в соответствии со стандартными процедурами.</li>
</ol>4. в естественных условиях деятельности пробирного биолюминесцентных штаммов бактерий и штаммов модифицированных E. coli
Примечание: Длительное время хранения штаммов является обычно acieved через замораживания глицерин запасы бактериальной культуры. Штаммы всегда должен быть прожилками на плитах агара сначала обеспечить равномерное стартовые условия для всех штаммов, до использования жидкого культур, из-за запаздывания фазы роста после оттаивания.
<ol><li>Полоска желаемого биолюминесцентных бактериальный штамм или модифицированных E. coli деформации на плите агар и Инкубируйте на 28 ° C на ночь. Примечание: Температуры инкубации может варьироваться от штамма к деформации и оценивать эмпирически. Чтобы иметь возможность сравнить биолюминесцентных бактериальных штаммов и модифицированных штаммов E. coli , условий роста должны быть идентичны.</li>
	<li>Прививок 3 мл среды с соответствующей деформации с единой колонии от плиты агара и инкубировать клетки на 28 ° C и 180 об/мин в шейкер инкубатор для примерно 1-2 ч.</li>
	<li>Измерить плотность клеток в 1:10 разбавления жидкости культуры на 650 Нм. Вычислить коэффициент и объемом 1 мл культуры с ОД650 0,05. Примечание: Assay читателя последующих плита будет определять плотность ячеек на 650 нм, чтобы избежать помех от светового излучения штаммов.</li>
	<li>Пипетка вычислительного объема культуры и среднего в 24-ну со стенами черный плиту с стекла дном. Для модифицированных E. coli процедить, добавить 1 мкл канамицин (антибиотикорезистентности pET28a вектора) и 1 мкл IPTG (индукция экспрессии генов) образцов. Поместите крышку на пластину во избежание испарения во время измерения. Примечание: Чтобы заверить, что вектор pET28a, содержащий весь люкс Оперон не теряйтесь культуры е. coli , канамицин должен добавляться для каждого образца E. coli в лунках и заверить что света производства E. coli клетки могут быть измерены, экспрессии генов должны быть индуцированных IPTG. Чтобы избежать перекрестных помех и измерения вмешательства, черный стеной хорошо пластины с стекла дно и прозрачной крышкой показали лучшие результаты. Тем не менее уровень помех может наблюдаться и хорошо позиции должны быть выбраны тщательно.</li>
	<li>Начало измерения на тарелку читателя. Примечание: Плита читателя протокол основан на специально разработан сценарий для этого анализа (см. Дополнительные материалы), сочетает в себе два измерения, поглощения и биолюминесценции. Точки данных собираются каждые 10 мин с постоянной тряски между измерениями и постоянной температурой 28 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widder, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+in+the+Ocean:+Origins+of+Biological+Chemical,+and+Ecological+Diversity.">Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity.</a> Science. 328 (5979), 704-708 (2010).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence,+Microbial.">Bioluminescence, Microbial.</a> Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).</li><li>Ulitzur, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+tetradecanal+as+the+natural+aldehyde+in+bacterial+bioluminescence.">Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).</li><li>Kurf&#252;rst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+postulated+structure+of+the+primary+emitter+in+the+bacterial+luciferase+reaction.">Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence.</a> Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Bioluminescence:+Organization,+regulation,+and+application+of+the+lux+genes.">Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes.</a> FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+Photobacterium+leiognathi+non-fluorescent+flavoprotein+with+limited+sequence+identity+to+bacterial+luciferase.">Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase.</a> J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+flavoprotein+related+to+the+subunits+of+bacterial+luciferase.">Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase.</a> EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+structural+features+of+the+luxF+protein+and+the+subunits+of+bacterial+luciferase:+Evidence+for+a+(&#946;&#945;)8+fold+in+luciferase.">Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (&#946;&#945;)8 fold in luciferase.</a> Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+refinement+of+the+non-fluorescent+flavoprotein+from+Photobacterium+leiognathi+at+1.60+&#197;+resolution.">Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 &#197; resolution.</a> J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).</li><li>Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+flavoprotein+FP390+from+a+luminescent+bacterium+Photobacterium+phosphoreum+refined+at+2.7+&#197;+resolution.">Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 &#197; resolution.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).</li><li>Bergner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biochemical+properties+of+LuxF+from+Photobacterium+leiognathi.">Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi.</a> Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).</li><li>Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+quorum+quenching+in+Vibrio+harveyi:+Lessons+learned+from+in+vivo+work.">Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work.</a> ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).</li><li>Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Genetics of bacterial bioluminescence.</a> Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).</li><li>Kelkar, M., De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+based+in+vivo+screening+technologies.">Bioluminescence based in vivo screening technologies.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).</li><li>Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+luciferase+reporters:+The+Swiss+army+knife+of+molecular+biology.">Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology.</a> Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).</li><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioluminescence living lights, lights for living. , (2013).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).</li><li>Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , (2004).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Строительство плазмида выражения, содержащие четыре фрагментов, составляющих весь люкс ребра Оперон P. mandapamensis 27561 была достигнута через Гибсон клонирования. Это выражение гена люкс E. coli на основе позволяет E. coli клетки, чтобы излучать свет. Избегая кворума зондирования правил и условий нестандартного роста являются существенные преимущества этой системы.
Преимущества использования Гибсон клонирования стратегии являются легко Ассамблея нескольких линейных фрагментов ДНК, высокая гибкость и нет необходимости для конкретного ограничения сайтов18,19,20. Этот метод позволяет легко менять Оперон люкс , за исключением единичных генов или гена кластеров или введения новых генов или обмена гены от одного штамма с другой. Предварительным условием для применения этого метода является наличие соответствующих люкс Оперон генная последовательность. Только для небольшого числа биолюминесцентных бактерий полной последовательности ДНК соответствующих люкс -оперона известных и/или доступны. Многие из этих последовательностей являются разрозненными, потому что они были созданы с помощью дробовика последовательности. В случае исследуемых P. mandapamensis 27561 полной последовательности ДНК люкс -оперона известны и доступны из базы данных NCBI гена (GenBank: DQ988878.2).
Один важный шаг в протоколе собрания Гибсон является расчет концентрации ДНК одной фрагментов. В протоколе Ассамблея производителя, было рекомендовано использовать 0,2 - 0,5 pmols и суммарный объем 20 мкл для 4-6 фрагменты20,21. В нашем случае, где luxCDABFEG-ribEBH состоит из 4 фрагментов, концентрации и общие объемы были 0.1 пмоль и 45 мкл, соответственно, в зависимости от доходности продуктов PCR. С одной стороны концентрация пришлось сократить, а с другой стороны, объем пришлось увеличить. Тем не менее Ассамблея работал очень хорошо и секвенирования ДНК подтвердили правильность подсоединения с первой попытки. Этот вывод подтвержден Гибсон Ассамблеи как надежные и соответствующий метод для нашего исследования, которые могут быть легко изменение18,19,20.
Assay читатель недавно созданной пластина легко обрабатывать метод. Это позволяет простой первичный анализ новых или (ООН-) известный биолюминесцентных бактериальных штаммов и дает уже первый намек на механизм регулирования света производства (например, отставание в люминесценции при плотностях низкой клеток). Кроме того условия для роста в сочетании с легкими производства легко могут оцениваться путем простого изменения, рост средний или температуры.
Измерения с читателем пластины были исполнены на 28 ° C. Для этого необычного параметра причина чувствительность температуры биолюминесцентных бактериальных штаммов, где температура выше 30 ° C ведут к меньше или даже нет роста и/или излучение света. Обратите внимание, что плита читатель способен поддержания определенной температуры со временем с ограничением отсутствуют активные системы охлаждения. Таким образом температура должна быть ниже температуры измерений.
Как доказательство концепции сравнение E. coli конструкции с биолюминесцентных штамм P. mandapamensis (рис. 5) с одной стороны и ведения измерений (рис. 4) с другой стороны были исполнены и подтвердите надежность этой недавно созданной системы. Кроме того долгосрочное измерение заверил долголетия излучения света (рис. 6). Но надо учитывать, что ОД значения не являются надежными, выше определенной оптической плотности, в зависимости от характеристик устройства используемые измерения (примерно 15 h в данном случае), где потребуются соответствующие разрежения для измерения в линейный Диапазон детектора. Эти высокие разницы в ОД значения делают эти измерения долгое время не надежны. Таким образом короче измерения например 10 h рекомендуется использование экспериментальной установки сообщили здесь.
Ограничения пробирного читателя установленные плиты можно увидеть на рисунке 7. Сложность заключается в том, чтобы найти соответствующий параметр измерения. Получить значение регулирует чувствительность фото множитель трубки (ПЛТ). Прибыль является усиление сигнала в ПЛТ, означает, что высокий коэффициент повышения будет увеличить сигнал. Если прибыль установлено слишком низкое, отношение сигнал-шум становится больше и света «низкий» блестящие биолюминесцентных бактерий может быть измерена любой больше (сигналы близка к нулю, данные не показаны). В биолюминесцентных assay задача установить коэффициент усиления таким образом результаты измерений для всех бактериальных штаммов оставаться в пределах документа. Кроме того, диапазон измерения для свечения зависит от интервала времени измерения (например, максимум 2.000.000 для 1 s).
Прирост был установлен до 2800, который был эмпирически протестированы и выбрали для читателя конкретных пластины, используется для создания данного метода. Параметр использовать выгоды позволяет записывать максимальная испускаемого света, биолюминесцентных кишечной системы, P. mandapamensis 27561 и P. mandapamensis S1 без переполнения, но штаммов P. mandapamensis TH1 и V. harveyi 14126 прибыль была слишком высока. Таким образом эти последние штаммов превышает предел обнаружения и реальная максимальная сила света не может быть измерена. Это техническое ограничение могло бы предотвратить сравнение биолюминесцентных бактерий, которые показывают высокие изменения максимального светового излучения, хотя условия роста и плотности клеток могут быть сопоставимыми.
Позиционирование проанализированных штаммов бактерий внутри используется хорошо пластины должен оцениваться эмпирически. Хотя были использованы черный также пластины с стеклянный днищами, наблюдалось перекрестных помех между выборками. Интенсивность света конкретных штаммов настолько высока, что все соседние скважины будут показывать ложные положительные света выбросов (например, пустой). Таким образом важно для оценки двух различных штаммов, либо отдельно, либо с определенного пространственного разделения друг к другу.
Уже есть многие изменены штаммов E. coli , известно, что содержат части Оперон люкс и главным образом ориентированные на приложения15,16,17. Методы, описанные здесь, направлены на фундаментальных исследований, например возможность анализа каждого гена люкс отдельно. Хотя исследования биолюминесценции имеет долгую историю, есть еще много открытых вопросов. Исключая или введение генов от Оперон люкс , обмена luxAB генов с генами от другого напряжения или анализа белка комплексов, встроенный в легко обрабатывать E. coli и дальнейшее применение пластины пробирного читателя, может быть возможность получить больше информации о регуляторных процессов и функций генов люкс .

Излучение света, живыми организмами (биолюминесценции) это увлекательный процесс в бактерий, грибков, насекомых, нематоды, рыба и кальмары1. Биолюминесцентных светового излучения возникает от хемилюминесцентный реакции, в которых химической энергии (частично) преобразуется в энергию света («холодного света»). В биолюминесцентных бактерий гетеродимерная Люцифераза Фермент катализирует monooxygenation длинноцепочечных алифатических альдегидов, например tetradecanal, для соответствующей кислоты, в сопровождении светового излучения с максимальной в 490 Нм2, 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2.jpg"> Рисунок 1 : Общие реакции схема бактериальных Люцифераза. Бактериальные Люцифераза (LuxAB) катализирует monooxygenation длинной цепи альдегиды (CH3(2CH)nЧо), используя сокращены Флавинмононуклеотид (FMNH2) и молекулярного кислорода (2O), приносит продукты длинные цепи кислоты (CH3(2CH)nCOOH), флавин мононуклеотид (FMN), воды (H2O) и излучение света по центру в 490 Нм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Энергия, выделяющаяся при этом окисления вызывает возбужденного состояния ФМн 4a-гидроксид, который служит светоизлучающих люциферин4. Белков, участвующих в бактериальных биолюминесценции, а именно LuxCDABEG, кодируются Оперон люкс и сохраняются высоко над различных штаммов бактерий2,5. Гены luxA и luxB кодирования для гетеродимерная Люцифераза; в luxC, luxDи люкс в продукты гена являются компонентами жирных кислот-редуктазы комплекса; и luxG кодирует для Флавин редуктазы6. Количество биолюминесцентных Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) нести дополнительные luxF ген. Было сообщено, что LuxF это м.в белок, который связывается необычные Флавин производная 6-(3'-(R)-myristyl)-ФМн (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Определены дополнительные гены, которые отвечают за синтез рибофлавин (например, ribEBH) и Кроме того были зарегистрированы регуляторных генов, которые играют роль в кворума зондирования регулирование биолюминесценции, особенно для холерный фишери и Vibrio harveyi6,13. Несмотря на приказ высоко сохранены гена биолюминесцентных бактерий показать высокие колебания в характеристики как рост поведение, интенсивность светового излучения, или регулирование биолюминесценции2,5,14 .
Несколько измененных штаммов или плазмиды, содержащие части или весь люкс опероны известны, используют биолюминесценцию как репортер систем. Различные приложения, например определение промоутер деятельность, мониторинг бактериальных загрязнений в окружающей среде или образцах пищевых продуктов, биолюминесценцию резонанс энергии передачи (BRET), в естественных условиях изображений инфекций в эукариотических организмов, Пиросеквенирование и так далее были установленным15,16,17. Интересно, что три наиболее часто используемые биолюминесцентных репортер систем являются производными от Северной Америки Светлячок (откладываемых pyralis), кишечных патогенов нематод (Photorhabdus luminescens) и море анютины глазки (Renilla reniformis). Ни одна из этих систем имеет бактериального происхождения, но использование люкс генов и опероны от бактериального происхождения приобретает все больший интерес для прикладных исследований16. Менее обильные применение биолюминесценции белков от бактериальных источников объясняется главным образом ниже стабильность и долговечность бактерий производных светящиеся белков, которые могут быть связаны с их морской среды обитания. Биолюминесцентных бактерии морских ареалов обитания, не обрабатываемых в стандартных лабораторных условиях. Эти бактерии требуют конкретных питательных сред и условий, таких как температура среднего и нижнего роста/инкубации искусственный морской воды (например, 28 ° C).
Чтобы упростить сравнение характеристик Оперон люкс или двухместный люкс гены целого ряда различных биолюминесцентных бактериальных штаммов, метод для стандартизации люкс Оперон выражение и анализ является предварительным условием. Таким образом возникла идея интеграции Оперон весь люкс ребра в стандарт исследовательский бактерии Escherichia coli (E. coli). Для этой цели Гибсон Ассамблея оказалась полезным инструментом для интеграции нескольких линейного, перекрытие фрагментов в одно выражение вектор без необходимости для конкретного ограничения сайтов. Этот метод также подходит, когда ДНК вставки слишком велики (27561e.g.,P. mandapamensis luxCDABFEG-ribEBH; 9 КБ ~ Оперон размер), быть усилена через PCR. Оперон люкс могут быть разделены на несколько перекрывающихся фрагментов, а затем собрал в одно выражение плазмиду и наконец последовательность проверки сборки продукта могут быть непосредственно преобразованы в соответствующие E. coli системы для получения высококачественного урожая белка выражение18,19,20. В дополнение к легко обрабатывать E. coli на основе люкс экспрессии генов простой метод, объединяющий записи роста клеток и биолюминесцентных светового излучения по-прежнему создаваться. Метод, описанный здесь позволяет в situ измерения и корреляции плотность клеток и светового излучения биолюминесцентных бактерий.
Анализ генов люкс и люкс Оперон порядка и регулирования различных биолюминесцентных бактерий, с одной стороны, искусственные биолюминесцентных E. coli системы, содержащие весь люкс ребра Оперон P. mandapamensis 27561 и, с другой стороны, пробирного читатель недавно разработанных пластины, сочетая в situ записи плотность клеток и светового излучения, помогает получить более подробную информацию о различных системах бактериальных люкс . Это основные характеристики и сравнение luciferases и связанных с ними ферментов может привести к альтернатив уже созданной репортер систем с укрепления стабильности и деятельности.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:896px;" width="895">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:115px;">E2621S</td>
			<td style="width:276px;">for 10 rxn 
			dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Q5 High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:115px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">K0721</td>
			<td>for 50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI)</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:115px;">R3193S/R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td>for 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Monarch DNA Gel Extraction Kit&#160;</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:115px;">#T1020S</td>
			<td>for 50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneJet Plasmid Miniprep Kit&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>for 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq G2 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:171px;">Promega</td>
			<td style="width:115px;">M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well black sensoplate with glass bottom</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:115px;">662892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLUOStar Omega plate reader&#160;</td>
			<td style="width:171px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">OPTIMA/Mars Analysis Software</td>
			<td style="width:171px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Version 2.20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsoft Excel 2010</td>
			<td style="width:171px;">Microsoft</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Multitron Standard Incubator Shaker</td>
			<td style="width:171px;">Infors AG</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ measurement and correlation of cell density and light emission of bioluminescent bacteria

Существует значительное количество бактериальных видов способен излучает свет. Все из них доля того же кластера гена, а именно Оперон люкс . Несмотря на это сходство эти бактерии показывает экстремальные различия в характеристики как рост поведение, интенсивность светового излучения или регулирование биолюминесценции. Метод, представленный здесь является недавно разработанный assay, который сочетает в себе запись роста клеток и интенсивности биолюминесцентных светового излучения со временем, используя читателя пластины. Результате роста и характеристики светового излучения может быть связаны с важных особенностей соответствующих бактериальный штамм, например кворума зондирования регулирования. Выращивание ряда биолюминесцентных бактерий требует конкретных среднего (например, средний искусственный морской воды) и определенных температур. Прост в обращении, не биолюминесцентных стандарт исследовательский бактерии Escherichia coli (E. coli), с другой стороны, можно выращивать недорого в больших количествах в лабораторном масштабе. Использование E. coli путем введения плазмида, содержащий весь люкс Оперон может упростить экспериментальных условий и дополнительно открывает много возможностей для будущих приложений. Выражение генов люкс , используя штамм E. coli выражение было достигнуто за счет строительства плазмида выражение через Гибсон клонирования и вставки четырех фрагментов, содержащий семь люкс генов и три ребра генов Оперон люкс ребра в pET28a вектор. E. coli на основе люкс экспрессии генов может быть индуцированных и контролируется через изопропил β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) сложения, что приводит к биолюминесцентных E. coli клетки. Преимущества этой системы определяются во избежание кворума зондирования регулирование ограничения и сложные средние композиции вместе с нестандартными роста условий, таких как температуры. Эта система позволяет проводить анализ люкс генов и их взаимосвязь, исключение соответствующих генов от Оперон люкс , или даже добавление новых генов, обмена luxAB генов из одной бактериальный штамм другим, или Анализ комплексов протеина, например luxCDE.

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria at JoVE.com

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Биолюминесцентных бактерий регулируют света производства через различные механизмы, например кворума. Этот новый метод позволяет на месте расследования биолюминесценции и корреляции светового излучения в плотность клеток. Искусственные биолюминесцентных Escherichia coli система позволяет характеристика опероны люкс , Люкс белков и их взаимодействие.

На месте Измерение и корреляции плотность клеток и светового излучения биолюминесцентных бактерий

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Измерение базального и форсколин-стимулированного липолиза в паховых жировых жировых подушечках

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Оптимизация роста кристаллов эндотиапепсина для серийных кристаллографических экспериментов

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Фракционирование клеток U937 методом изопикновой очистки градиента плотности

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Протокол подготовки и передачи образцов для внутривакуумной длинноволновой кристаллографии на лучевой линии I23 на алмазном источнике света

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Биолюминесцентная оптогенетика 2.0: использование биолюминесценции для активации фотосенсорных белков in vitro и in vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Собственное устройство фотодинамической терапии на основе светодиодов для повышения цитотоксичности вертепорфина в 2D-модели клеточной культуры

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...